CN103255202A - 霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的三重pcr检测方法 - Google Patents

霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的三重pcr检测方法 Download PDF

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王林同
朱琳
明红霞
王轲
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Abstract

本发明属于环境科学水体病原菌检测领域，通过基因片段的体外酶促扩增，快速检测水样中的霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌，评价并预警海洋环境这三种致病菌的含量及污染情况。霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌是三种常见的革兰氏阴性弧菌，在海洋环境中广泛分布，能感染人类，通过粪口途径在人群中传播。PCR技术具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时省力等优点。三重PCR在单一PCR基础上，向同一反应体系中加入三对引物，同时扩增出三段DNA片段，这样更加节省了时间和成本。建立三重PCR方法用于快速检测样品中的病原微生物具有重要的实际意义和应用价值，因而越来越受到人们的关注。

Description

霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的三重PCR检测方法
技术领域
本发明属于环境科学水体病原菌检测领域，是应用三重聚合酶链式反应(全称Polymerase Chain Reaction，简称PCR)技术，将被测病原菌微量的目的基因片段体外扩增，快速检测水样中的霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌，评价并预警海洋环境这三种致病菌的含量及污染情况。 
背景技术
霍乱弧菌(Vibrio Cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)和创伤弧菌(Vibrio Vulnificus)是三种常见的革兰氏阴性弧菌，在海洋环境中广泛分布。人们主要通过食用被污染的海产品感染以上三种病原菌，也可能通过伤口接触污染的海水、礁石等而感染，会在短时间内引起患者腹痛腹泻、呕吐，甚至内脏淤血和败血症。在美国、丹麦、西班牙、以色列及我国台湾等一些沿海城市，都有过副溶血弧菌和创伤弧菌感染的临床报告，大多因多器官功能障碍而死亡。历史上曾有过6次霍乱世界性大流行，无一不祸及中国。三种病原菌都能通过粪口途径在人群中传播，威胁人类的生命健康安全。 
PCR技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，三重PCR方法是多重PCR方法的一个分支。与传统的生物学方法相比，PCR技术具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时省力等优点。近二十几年来，该技术已经成为最常用、也是最重要的分子生物学技术之一。三重PCR在单一PCR基础上，向同一反应体系中加入三对引物，同时扩增出三段DNA片段，这样更加节省了时间和成本。建立三重PCR方法用于快速检测样品中的病原微生物具有重要的实际意义和应用价值，因而越来越受到人们的关注。 
发明内容
本发明根据霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的保守序列，分别选择退火温度相同的引物，并使三种不同细菌的目的基因片段长度不等。提取三种细菌的DNA基因组，在同一体系中同时进行三重PCR扩增反应。扩增结果通过琼脂糖凝胶电泳观察，整个检测时间只需6-8小时。 
本发明是通过以下技术方案实现的： 
1、DNA模板的准备 
将三种细菌的菌种分别接种到已灭菌的LB液体培养基中，振荡18小时(创伤弧菌于28℃，霍乱弧菌和副溶血弧菌于37℃)，所得的菌液用已过滤的无菌海水稀释一定的 倍数，用试剂盒提取两种细菌的基因组DNA。 
2、用于三重PCR的三对引物核苷酸序列如下： 
Figure BSA00000671906900021
3、三重PCR反应 
(1)反应的液体总体积为25μl，体系组成如下： 
  成分   体积(μl)   终浓度
  2×Master Buffer   12.5   1×Master Buffer
  MgCl2(25mM)   0.5   2.5mM
  Vc-F(10mM)   1   0.4mM
  Vc-R(10mM)   1   0.4mM
  Vv-F(10mM)   1   0.4mM
  Vv-R(10mM)   1   0.4mM
  Vp-F(10mM)   1   0.4mM
  Vp-R(10mM)   1   0.4mM
  霍乱弧菌DNA模板   2  
  创伤弧菌DNA模板   2  
  副溶血弧菌DNA模板   2  
(2)三重PCR扩增程序如下： 
①94℃预变性10分钟； 
②三温循环35次： 
94℃变性40秒； 
58℃退火1分钟； 
74℃延伸1分钟； 
③74℃终延伸10分钟 
(3)扩增产物检测 
三重PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，2％的胶中含0.5mg/ml的溴化乙锭(用于将DNA片段染色)，在凝胶成像系统下观察，霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌(从上到 下)的扩增片段长度分别为588bp、450bp和205bp。 
本发明的优点如下： 
①节省时间和成本。常规的生物学方法需要5-7天，普通PCR方法虽然也可在一天之内完成检测，但需要进行三次实验操作。本发明同时对三种病原菌的目的片段进行扩增检测，进行一组实验即可得到对三种病原菌的检测结果。 
②具有很高的灵敏度和特异性。本发明是针对三种致病菌的保守序列设计的引物，对三种致病菌的检测限都能达到101count/mL以内，灵敏度满足实用要求。 
③检测操作简单，不需要使用复杂仪器，对操作人员只需进行简单培训即可；所用试剂均为常用试剂，配制方便；也可购买使用配制好的试剂盒。 
④应用广泛。本发明的核心部分——三重PCR技术既可以应用在海水样品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的检测，对于其他环境样品以及海产品中的以上三种病原菌，都可在提取基因组后进行快速检测。 
附图说明
图1是本方法三重PCR扩增产物与单一PCR扩增产物的对比图。 
具体实施方法 
1.按照试剂盒方法提取菌液中的细菌基因组DNA，作为模板。 
2.按照下表配制反应溶液，溶液的总体积为25μl。 
  成分   体积(μl)   终浓度
  2×Master Buffer   12.5   1×Master Buffer
  MgCl2(25mM)   0.5   2.5mM
  Vc-F(10mM)   1   0.4mM
  Vc-R(10mM)   1   0.4mM
  Vv-F(10mM)   1   0.4mM
  Vv-R(10mM)   1   0.4mM
  Vp-F(10mM)   1   0.4mM
  Vp-R(10mM)   1   0.4mM
  霍乱弧菌DNA模板   2  
  创伤弧菌DNA模板   2  
  副溶血弧菌DNA模板   2  
3.三温循环，进行扩增，程序如下： 
①94℃预变性10分钟； 
②三温循环35次： 
94℃变性40秒； 
58℃退火1分钟； 
74℃延伸1分钟； 
③74℃终延伸10分钟 
4.扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测 
三重PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，2％的胶中含0.5mg/ml的溴化乙锭(用于将DNA片段染色)，在凝胶成像系统下观察，霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌(从上到下)的扩增片段长度分别为588bp、450bp和205bp。见附图1。 
附图中，M道为Marker； 
1道为霍乱弧菌单一PCR扩增结果，片段长度为588bp； 
2道为副溶血弧菌单一PCR扩增结果，片段长度为450bp； 
3道为创伤弧菌单一PCR扩增结果，片段长度为205bp； 
4道为三种病原菌三重PCR扩增结果，从上到下三条片段依次为霍乱弧菌588bp、副溶血弧菌450bp和创伤弧菌205bp。 
Figure ISA00000671907100011

Claims (2)

1.霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌三重PCR检测方法的特征在于将三种病原菌的特异性引物加入到同一反应体系中。本发明是通过以下技术方案实现的：
1)DNA模板的准备
将三种细菌的菌种分别接种到已灭菌的LB液体培养基中，振荡18小时(创伤弧菌于28℃，霍乱弧菌和副溶血弧菌于37℃)，所得的菌液用已过滤的无菌海水稀释一定的倍数，用试剂盒提取两种细菌的基因组DNA。
2)设计三重PCR的三对引物，核苷酸序列如下：
Figure FSA00000671906800011
3)三重PCR反应
(1)反应的液体总体积为25μl，体系组成如下：
  成分   体积(μl)   终浓度   2×Master Buffer   12.5   1×Master Buffer   MgCl2(25mM)   0.5   2.5mM   Vc-F(10mM)   1   0.4mM   Vc-R(10mM)   1   0.4mM   Vv-F(10mM)   1   0.4mM   Vv-R(10mM)   1   0.4mM   Vp-F(10mM)   1   0.4mM   Vp-R(10mM)   1   0.4mM   霍乱弧菌DNA模板   2   创伤弧菌DNA模板   2   副溶血弧菌DNA模板   2
(2)三重PCR扩增程序如下：
①94℃预变性10分钟；
②三温循环35次：
94℃变性40秒；
58℃退火1分钟；
74℃延伸1分钟；
③74℃终延伸10分钟
4)扩增产物检测
三重PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，2％的胶中含0.5mg/ml的溴化乙锭(用于将DNA片段染色)，在凝胶成像系统下观察，霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌(从上到下)的扩增片段长度分别为588bp、450bp和205bp。
2.权利要求1所述的三重PCR反应方法检测样品中的霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌，可用于检测海水样品以及其他水样中的霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌。
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