CN102311993A

CN102311993A - 用于检测水产品中重要致病菌的基因芯片及其试剂盒

Info

Publication number: CN102311993A
Application number: CN2010102266139A
Authority: CN
Inventors: 王磊; 李荣荣; 张恋心; 曹勃阳; 冯露
Original assignee: Tianjin Biochip Corp
Current assignee: Tianjin Biochip Corp
Priority date: 2010-07-08
Filing date: 2010-07-08
Publication date: 2012-01-11

Abstract

本发明涉及一种用于检测水产品中重要致病菌的基因芯片及其试剂盒。该基因芯片包括固相载体和寡聚核苷酸探针，所述寡聚核苷酸探针包含从以下核苷酸序列中选取的一种或多种：1)从奇异变形杆菌1、普通变形杆菌、以及从沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、创伤弧菌、蜡样芽孢杆菌群、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因中选取的DNA序列；2)上述1)中选取的DNA序列的互补DNA序列；3)上述1)或2)中选取的DNA序列的互补RNA序列。所述试剂盒包含上述的基因芯片。利用本发明的基因芯片及试剂盒检测水产品中重要致病菌，操作简便，准确性高，重复性强。

Description

用于检测水产品中重要致病菌的基因芯片及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测用基因芯片和试剂盒，尤其涉及检测水产品中重要致病菌的基因芯片及其试剂盒。

背景技术

食品质量与食品安全关系人类健康，因而受到世界各国的高度重视。微生物引起的食源性疾病是食品安全的主要问题。细菌污染造成的食源性疾病(食物中毒)是我国食品安全中最突出的问题。据卫生部统计，2000年共收到重大食物报告达150起，中毒6237人，死亡135人；2001年共发生重大食物中毒事件185起，15715人中毒，116人死亡。2005年全国各地上报的食物中毒事件中，微生物食物中毒人数最多，占总数的43.0％。国家食源性疾病监测网个案报告的资料分析表明：微生物性病原占46.4％，微生物性食源性疾病暴发中，副溶血性弧菌导致的疾病暴发占40.1％，变形杆菌占11.3％，葡萄球菌肠毒素占9.4％，蜡样芽孢杆菌占8.6％，沙门氏菌占8.1％，致病性大肠杆菌占4％。我国食物中毒的高危食品为：肉类、粮食、水产品、水果蔬菜、鸡蛋、豆类、奶。这一排序是基于国家食源性疾病监测网部分资料的分析的动态情况。其中水产品排名第三，是重要的食物中毒高危食品。水产品致病菌导致的食源性疾病影响的国家范围广、危急健康人群多，而且还给国家之间相关的食品贸易带来危机，这使得水产品安全问题受到了空前的关注。这些事实也可以充分说明尽管现代科技已经发展到了相当高的水平，但水产品致病菌导致的疾病不论在发达国家还是在发展中国家，都没有很好的被控制，仍然危害着人民的健康。

水产品中的致病菌主要有以下两类：一是其自身原有致病菌，这类细菌广泛分布于水中，如冷源性细菌单核细胞增生李斯特氏菌，噬热性细菌如副溶血弧菌和霍乱弧菌等；二是非自身原有致病菌，即生产过程中被污染的致病菌，主要存在与人和动物肠道内及被人或动物粪便污染的水环境中，常见的包括沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌等(杨文鸽，孙翠玲，潘云娣，等，水产品中致病微生物的快速检测方法，中国食品学报，2006，6(1)：402～406)。统计了卫生部公布的国内近十年公布的微生物性食物中毒病例，综合国家食源性疾病监测网部分资料的分析的动态情况，天津出入境检验检疫局提供的调查统计数据，确定水产品致病菌检测芯片检测范围为下列常见的12类菌：奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、创伤弧菌、蜡样芽孢杆菌群、志贺氏菌(包含福氏志贺氏菌、宋氏志贺氏菌、鲍氏志贺菌和痢疾志贺氏菌共4个种)、小肠结肠炎耶尔森氏菌。

我国目前对于水产品的病原菌检测、鉴定手段仍停留常规的微生物学检验水平，通常以分离培养、生化试验及血清学试验为主，具有操作复杂、手工劳动量大、检验周期长(6-7天)、特异性不强等缺点，在相当大的程度上限制了对食源性疾病病源水产品的快速检测鉴定能力，并且在判断是否为阳性时只靠实验人员肉眼观察，没有足够可靠的依据，降低实验结果的准确性，不能达到新鲜水产品贮藏时间短、需要快速检测的要求。一些简单的分子生物学的方法如PCR、ELISA都有较高的假阳性结果出现，并且运用PCR和ELISA得出的结果都不能作为最终的检测依据。日前丹麦、澳人利亚等一些欧洲和澳洲国家食源性病原菌的检测结果综合了实时荧光PCR和ELISA两种技术在DNA和蛋白质两种水平上检测的结果进行判断，并且实验操作只有1h左右。因此我国有必要建立起水产品致病菌的高通量、快速、准确的监测体系，以确保在相对较短的时间内正确判定水产品的安全性，这是有效地预防和控制食源性疾病的重要前提。只有这样才能在一定程度上提前消除由于水产品中的致病菌所造成的危害，提高我国食源性疾病的检测和控制能力，为加入WTO后尽早与其他国家达成通关协议搭建雄厚的技术平台。

1997年7月，Affymetrix，Inc.(Santa Clara，CA)公司的Thomas R.等人发明的第6,228,575号美国专利公开了以生物芯片技术对微生物进行定种和表型分析的方法。从二十世纪九十年代开始，基因芯片技术作为一种全新的核酸分析检测技术建立起来，并随着人类基因组计划的开展而逐步发展。该技术综合运用了分子生物学、集成电路制造、计算机、半导体、共聚焦激光扫描、荧光标记等技术，使检测过程具有敏感性高、特异性强、大规模集成化、自动化、操作简便快捷、效率高等特点，在基因表达相关研究和生物制药研究等方面得到普遍应用。因此，如果将基因芯片技术用于细菌的鉴定，不仅可以大大简化检测手段，提高检测速度，而且具有高准确性、高灵敏度、高通量、可重复性强等诸多优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测水产品中重要致病菌的基因芯片及其试剂盒，以弥补传统常见水产品致病菌检测技术存在的费时耗力的缺陷，扩展病原菌检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。

本发明提供的用于检测水产品中重要致病菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其中所述寡聚核苷酸探针包含从以下核苷酸序列中选取的一种或多种：

1)从奇异变形杆菌16S-23S rDNA间区、普通变形杆菌16S-23S rDNA间区以及从沙门氏菌invA、副溶血弧菌toxR、霍乱弧菌rfbE、单增李斯特氏菌hlyA、金黄色葡萄球菌nuc、化脓性链球菌speB、创伤弧菌rpoS、蜡样芽孢杆菌群groEL、志贺氏菌ipaH、小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因中选取的DNA序列；

2)上述1)中选取的DNA序列的互补DNA序列；

3)上述1)或2)中选取的DNA序列的互补RNA序列。

本发明的优选实施例中，所述寡聚核苷酸探针具有如SEQ ID NO：2-45所示的核苷酸序列中的至少一种。

本发明所述的基因芯片，还包含固定在该固相载体上的阳性对照探针、阴性对照探针或荧光探针。

所述阳性对照探针选自细菌16S rDNA保守区中的DNA片段或者其互补的DNA或RNA序列。

本发明的优选实施例中，所述阳性对照探针具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明所述的基因芯片可以用于检测水产品中奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、创伤弧菌、蜡样芽孢杆菌群、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌中至少一种致病菌。

在上述检测应用中，还包含使用检测引物，所述检测引物具有SEQ IDNO：46-67所示的核苷酸序列中的至少一种或与SEQ ID NO：46-67所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列中的至少一种。

本发明还提供一种用于检测水产品中重要致病菌的试剂盒，其包含上述的基因芯片。

本发明所述的试剂盒，还可以包括检测引物，所述检测引物具有SEQID NO：46-67所示的核苷酸序列中的至少一种或与SEQ ID NO：46-67所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列中的至少一种。

本发明所述的试剂盒可以用于检测水产品中奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、创伤弧菌、蜡样芽孢杆菌群、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌中至少一种致病菌。

由上述的技术方案可见，本发明将基因芯片技术引入水产品中重要致病菌检测领域同时检测12类致病菌，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的全新的用于检测水产品中重要致病菌的基因芯片及其试剂盒，利用本发明的基因芯片可以达到检测水产品中重要致病菌的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，可用于医学检验、食品安全检验、进出口检验检疫和流行病学调查。

为保证本发明的上述和其它目的特征和优点更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为本发明基因芯片的一个实施例的外形示意图；

图2为本发明基因芯片的一个实施例上单一点阵探针排布规律示意图；

图3A为利用本发明的基因芯片检测化脓性链球时的杂交结果；

图3B为利用本发明的基因芯片检测志贺氏菌时的杂交结果；

图3C为利用本发明的基因芯片检测金黄色葡萄球菌时的杂交结果；

图3D为利用本发明的基因芯片检测沙门氏菌时的杂交结果；

图3E为利用本发明的基因芯片检测单增李斯特氏菌时的杂交结果；

图3F为利用本发明的基因芯片检测副溶血弧菌时的杂交结果；

图3G为利用本发明的基因芯片检测霍乱弧菌时的杂交结果；

图3H为利用本发明的基因芯片检测奇异变形杆菌时的杂交结果；

图3I为利用本发明的基因芯片检测普通变形杆菌时的杂交结果；

图3J为利用本发明的基因芯片检测创伤弧菌时的杂交结果；

图3K为利用本发明的基因芯片检测蜡样芽孢杆菌时的杂交结果；

图3L为利用本发明的基因芯片检测小肠结肠炎耶尔森氏菌时的杂交结果。

具体实施方式

实施例1探针的设计和制备

1.序列获得：

(1)细菌16S rDNA序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到十二种菌(奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、创伤弧菌、蜡样芽孢杆菌群、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌)的全部16S rDNA序列。

(2)16S-23S rDNA间区序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到奇异变形杆菌和普通变形杆菌及它们的近缘菌的所有16S-23S rDNA间区序列。

(3)ipaH基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到志贺氏菌四个种的全部ipaH基因序列。

(4)invA基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到沙门氏菌的全部invA基因序列。

(5)toxR基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到副溶血弧菌的全部toxR基因序列。

(6)rfbE基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到霍乱弧菌的全部rfbE基因序列。

(7)hlyA基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到单增李斯特氏菌的全部hlyA基因序列。

(8)nuc基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到金黄色葡萄球菌的全部nuc基因序列。

(9)speB基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到化脓性链球菌的全部speB基因序列。

(10)rpoS基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到创伤弧菌的全部rpoS基因序列。

(11)groEL基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到蜡样芽孢杆菌群的全部groEL基因序列。

(12)ail基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到小肠结肠炎耶尔森氏菌的全部ail基因序列。

2.探针设计：

(1)细菌的通用探针：12类菌全部的16S rDNA序列及其他菌的16SrDNA序列导入Glustal X软件中，选取靠近间区的一段16S rDNA保守序列作为探针，满足长度35±2bp，T_m75℃±2℃。

(2)间区探针：分别将奇异变形杆菌、普通变形杆菌的所有16S-23SrDNA间区序列导入Glustal X软件中，从而得知该菌的间区序列有几种类型，每种类型选取一条代表序列在公共数据NCBI中作Blast比对，确定可否作为特异靶点以及特异靶点的位置。对照Glustal X比对结果，选取满足不同株间该区段都保守的性质，同时长度35±2bp，T_m75℃±2℃。

(3)特异基因探针：将上述从GenBank公共数据库下载得到的除奇异变形杆菌和普通变形杆菌之外的其它十种菌的特异基因序列，用序列比对软件Glustal X比对，找到各个基因的保守区段，将该保守区段导入OligoArray2.0软件中，参数设定如下：-n 20；-l 30；-L 40；-D 3000；-t 79；-T 90；-s 65℃；-x 65℃；-N 2；-p 33，-P 65；-m GGGGG CCCCC TTTTTAAAAA；-g 15。运行程序在线设计探针。从输出结果中选择长度在35bp±2bp，T_m值75℃±2℃的探针。

3.探针合成：将下表1中的探针序列的5’端延长10个T(表1所示的荧光探针序列中已包含了延长的10个T)并氨基化后委托探针合成公司(北京奥科公司)合成，备用。

4.探针筛选：将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在玻璃片基上制成基因芯片，通过杂交实验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异、灵敏的探针。

在本发明的优选实施例中，选择了48条长度在35bp±2bp、T_m75℃±2℃的探针，并通过360次杂交实验进行探针筛选，最终得到如表1所示的探针。其中，编号为NO.1(SEQ ID NO：1)的探针序列选自所有细菌的16S rDNA，作为阳性对照用来检测是否有细菌，编号为NO.2的探针作为荧光探针，编号为NO.3的探针为多聚T片段，用作阴性对照，编号为NO.3的探针为50％DMSO，用作空白对照，编号NO.43-NO.48的6条探针序列(SEQ ID NO：40-SEQ ID NO：45)选自奇异变形杆菌和普通变形杆菌的16S-23S rDNA间区，编号NO.5-NO.8(SEQ ID NO：2-SEQID NO：5)的4条探针序列分别选自沙门氏菌invA基因，NO.9-NO.13(SEQID NO：6-SEQ ID NO：10)化脓性链球菌speB基因，NO.14-NO.16(SEQ IDNO：11-SEQ ID NO：13)金黄色葡萄球菌nuc基因，NO.17-NO.19(SEQ IDNO：14-SEQ ID NO：16)小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因，NO.20-NO.27(SEQ ID NO：17-SEQ ID NO：24)霍乱弧菌rfbE基因，NO.28-NO.31(SEQID NO：25-SEQ ID NO：28)创伤弧菌rpoS基因，NO.32-NO.34(SEQ IDNO：29-SEQ ID NO：31)单增李斯特氏菌hlyA基因，NO.35-NO.36(SEQ IDNO：32-SEQ ID NO：33)副溶血弧菌toxR基因，NO.37-NO.38(SEQ IDNO：34-SEQ ID NO：35)蜡样芽孢杆菌群groEL基因，NO.39-NO.42(SEQID NO：36-SEQ ID NO：39)志贺氏菌ipaH基因。

表1：本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及可检测出的致病菌

探针编号	SEQID	探针序列(5’-3’)	可检测出的致病菌
				NO.1	NO：1	TTGTACACACCGCCCGTCACACCAT	细菌正对照
NO.2		Cy3_TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT	荧光探针
				NO.3		TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT	阴性对照
NO.4		50％DMSO	空白对照
				NO.5	NO：2	CTCTTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGTAG	沙门氏菌
NO.6	NO：3	GTTGATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGG	沙门氏菌
				NO.7	NO：4	GCAACGTCAATGAATATTTCGGTATTCAGGAAAC	沙门氏菌
NO.8	NO：5	GAATTACGAGCAGTAATGGTATCTGCTGAAGTTG	沙门氏菌
				NO.9	NO：6	CAGCAGCTATCAAAGCAGGTGCAC	化脓性链球
		GAAG	菌
				NO.10	NO：7	CAATATTTCTACTGGAGGATTTGTTATCGTTTCAGGAG	化脓性链球菌
NO.11	NO：8	CGTTCTCCAGAAATTCTAGGATACTCTACCAGCGG	化脓性链球菌
				NO.12	NO：9	GGTAACCCTTACAACCTATTGACACCTGTTATTGAAA	化脓性链球菌
NO.13	NO：10	CCATATTTCAACCATCCTAAGAACTTGTTTGCAGC	化脓性链球菌
				NO.14	NO：11	GATACACCTGAAACAAAGCATCC	金黄色葡萄球菌
NO.15	NO：12	GTGTAGAGAAATATGGTCCTGA	金黄色葡萄球菌
				NO.16	NO：13	GACAAAGGTCAAAGAACTGAT	金黄色葡萄球菌
NO.17	NO：14	GATTTCTTCTATGGCAGTAATAAGTTTGGTCA	小肠结肠炎耶尔森氏菌
				NO.18	NO：15	ATGATTTCTTCTATGGCAGTAATAAGTTTGGTC	小肠结肠炎耶尔森氏菌
NO.19	NO：16	GGAAAGGTTAAGGCATCTGTATTTGATGAATC	小肠结肠炎耶尔森氏菌
				NO.20	NO：17	CCAAGGGGTAGTGGCAGGGAAGC	霍乱弧菌
NO.21	NO：18	CTTTAAGAGATCTGTGTGATGAGCACGGC	霍乱弧菌
				NO.22	NO：19	GGGGTAGTGGCAGGGAAGCGCT	霍乱弧菌
NO.23	NO：20	CATCACATCGGGCGAGGGTGG	霍乱弧菌
				NO.24	NO：21	ACCATCACATCGGGCGAGGGTG	霍乱弧菌
NO.25	NO：22	AACCAAGGGGTAGTGGCAGGGAAG	霍乱弧菌
						C
NO.26	NO：23	CATCACATCGGGCGAGGGTGGTAT	霍乱弧菌
				NO.27	NO：24	CCAGTGTGGTGCGTTACCCGTTTTTG	霍乱弧菌
NO.28	NO：25	CAGACTCGAACCATCCGTTTACCTATCCA	创伤弧菌
				NO.29	NO：26	ATGAGCCAACCGCTGAAGAGATCGC	创伤弧菌
NO.30	NO：27	GGATATTCCGGTTGACGATGTGAGCA	创伤弧菌
				NO.31	NO：28	TGGGCAAGAGATTGGTTTAACTCGTGA	创伤弧菌
NO.32	NO：29	CCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAA	单增李斯特氏菌
				NO.33	NO：30	GATGACGAAATGGCTTACAGTGAATCACAAT	单增李斯特氏菌
NO.34	NO.31	ACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCA	单增李斯特氏菌
				NO.35	NO.32	AGTTGTACGATTAGGAAGCAACGAAAGCCGTATACTC	副溶血弧菌
NO.36	NO：33	AAGTTTTAACCCGTAACGAGCTTCACGAGTTTGTTT	副溶血弧菌
				NO.37	NO：34	AAAATCTGCTACAGTTGAATCTTTAGGACGC	蜡样芽孢杆菌
NO.38	NO：35	GCCGTGACTTAAAATCTGCTACAGTTGAATC	蜡样芽孢杆菌
				NO.39	NO：36	GATAATGATACCGGCGCTCTGCTCTCC	志贺氏菌
NO.40	NO：37	AGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCA	志贺氏菌
						GACCA
NO.41	NO：38	AGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCG	志贺氏菌
				NO.42	NO：39	ACCATGGCATGCTGTACTGAAGCGTAC	志贺氏菌
NO.43	NO：40	GAGCAGCCGCTCAGTATTGAGGAAAA	奇异变形杆菌
				NO.44	NO：41	GAATAACTAAGCTAATTCAAATGAGTTATCTTACT	奇异变形杆菌
NO.45	NO：42	CCACCCAGATAGTCTTTGAAAGAGACACTTT	奇异变形杆菌
				NO.46	NO：43	AAAAGGAGTGGTTATACGGGTATTAAAACATTA	奇异变形杆菌
NO.47	NO：44	AGCGCACAGTCAGCGCAACATACATTA	普通变形杆菌
				NO.48	NO：45	CCCAGACGTCATTAAGAAGAAACATCT	普通变形杆菌

实施例2引物的设计和制备

1.序列获得：同前设计探针的序列。

2.设计引物：

(1)扩增间区序列引物的设计：从公共数据库NCBI中下载得到的十二种细菌的16S rDNA用序列比对软件Glustal X比对后，选取靠近间区的一段16S rDNA保守序列作为上游引物，长度符合T_m值50℃±5℃、长度17bp±2bp、Hairpin：NONE、Dimer：NONE、False Priming：NONE、CrossDimer：NONE，且包含细菌通用探针序列在内。

(2)扩增特异基因序列引物的设计：将上述从GenBank公共数据库下载得到的除奇异变形杆菌和普通变形杆菌以外的其它十种菌的特异基因序列，用序列比对软件Glustal X比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入引物设计软件Primer Premier 5.0软件中，相应参数设定如下：Search For：PCR Primers，Search types：Both.Search Ranges：SensePrimer 1 to 672，Anti-sense Primer 1 to 672，PCR Product Size：100 bp to 1000bp.Primer Length：20bp±2bp.Search Mode：Automatic。从输出结果中选取Tm值50℃±5℃、长度17bp±2bp、Hairpin：NONE、Dimer：NONE、FalsePriming：NONE、Cross Dimer：NONE且包含特异探针序列在内的引物。

3.引物合成：将下表2中的引物序列委托引物合成公司(北京英骏)合成，备用。

4.引物筛选：将合成好的引物溶解并适量稀释，一方面通过PCR反应分别扩增16S-23S rDNA间区和特异基因序列检测引物的扩增性，另一发面，分别用八对引物和四对引物同时对12类菌中的八种菌和四种菌的不同菌株进行扩增检测两对引物的相容性，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异、灵敏的引物。

在本发明的优选实施例中，选取了既包含探针又适合扩增12类水产品中重要致病菌(奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、创伤弧菌、蜡样芽孢杆菌群、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌)DNA的引物22条，为适应同时多对引物的PCR，经生物信息学初筛并通过大量PCR实验筛选，筛选出如表2所示的适用引物。

表2用于水产品中12类常见致病菌检测DNA的PCR扩增的引物序列

引物编号	SEQID	引物序列(5’-3’)	扩增作用
				P-1	NO：46	CCAAATAGTAATTCGCTCG	副溶血弧菌toxR基因上游引物
P-2	NO：47	CGTGATAATGATGGCTAAAC	副溶血弧菌toxR基因下游引物
				P-3	NO：48	CGCTATCACATTTATCCAA	化脓连speB基因上游引物
P-4	NO：49	AATACCAACATCAGCCATC	化脓连speB基因下游引物
				P-5	NO：50	GAAAGGGCAATACGCAAAGA	金黄色葡萄球菌nuc基因上游引物
P-6	NO：51	AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC	金黄色葡萄球菌nuc基因下游引物
				P-7	NO：52	CTGGCACTGCTTGATTTG	创伤弧菌rpoS基因上游引物
P-8	NO：53	TCAGAACTTCACGGAGGC	创伤弧菌rpoS基因下游引物
				P-9	NO：54	TAAAGCACGCCACAACAG	霍乱弧菌rfbE基因上游引物
P-10	NO：55	CAGCACATAGATTCGTCATTC	霍乱弧菌rfbE基因上游引物
				P-11	NO：56	TAAACCGCTTCTTATCATTG	蜡样芽孢杆菌groEL基因上游引物
P-12	NO：57	ATTTGACGAACTGGCTCT	蜡样芽孢杆菌groEL基因下游引物
				P-13	NO：58	CAGGTGCTCTCGTGAAAG	单增李斯特氏菌hlyA基因上游引物
P-14	NO：59	TTCCCACTTACGGCAGC	单增李斯特氏菌hlyA基因下游引物
				P-15	NO：60	CCTTTGACGGTGCGATG	沙门氏菌invA基因上游引物
P-16	NO：61	CCTTTA/GCGAATAACATCCT	沙门氏菌invA基因下游引物
				P-17	NO：62	TGGGGATACATTGGATAA	小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因上游引物
P-18	NO：63	GGTGCCAACTTTTGTGCT	小肠结肠炎耶尔森氏
							菌ail基因下游引物
P-19	NO：64	TGTACACACCGCCCGTC	16s-23s间区上游引物
				P-20	NO：65	GGTACTTAGATGTTTCAGTTC	16s-23s间区下游引物
P-21	NO：66	TTCCTTGACCGCCTTTC	志贺氏菌ipaH基因上游引物
				P-22	NO：67	GCCAGTACCTCGTCAGTCA	志贺氏菌ipaH基因下游引物

实施例3基因芯片制备——芯片点样

1.溶解探针：将实施例1中合成的探针分别溶解于50％DMSO溶液中，稀释使探针的终浓度达到1μg/μl。

2.加板：将溶解好的探针加入384孔板的相应位置，每孔10μl。

3.点样：将如图1所示的57.5mm×25.5mm×1mm(长×宽×高)的洁净的醛基化玻片(CapitalBio Corp.，China)放到芯片点样仪(Spotarray 72)的载物台上，使用SpotArray的控制软件(Telechem smp3 stealty pin)，运行程序，按图2所示的排布方式点在醛基化的玻片上4.5mm×4.5mm的点样区内，构成中低密度DNA微矩阵，玻片上的六个点阵区内阵列排布规律相同。点阵区域尺寸3mm×2mm，该点阵内点间距250μm，矩阵：12×8，12×250μm＝3mm，8×250μm＝2mm，标准片基尺寸：75.5mm×25.5mm×1mm。

4.干燥：将点好的芯片室温下过夜干燥，然后在45℃烘箱干燥2小时。

5.交联：用交联仪(uvpcl-2000M ultraciolet Crosslinker)600J交联2次。将交联好的芯片放回洁净芯片盒中，备用。

由图2可见，每个点样区内为12(行)×8(列)个探针点。NO.1框区示意的位置为检测细菌的正对照探针，NO.2框区示意的位置为荧光探针，NO.3框区示意的位置为负对照探针，NO.4框区示意的是空白对照，其它为各致病菌的特异探针(对应于表1中的相应探针编号)。

实施例4利用基因芯片快速检测水产品中重要致病菌

1.样品处理：按照国标的操作方法，用灭菌棉签，无菌操作，涂抹鱼、虾、蟹等水产品的腮和肠道等部位，棉签放入生理盐水中充分振荡。取100μl加入前增菌培养基，37℃，220rpm培养6小时，然后取10ml转接到100ml选择性培养基中，37℃，220rpm培养12小时。

表3样品处理方法

2.提取基因组：1ml过夜培养的样品12000rpm离心5分钟沉淀可能存在的致病菌菌体，弃上清(尽量控干)。向沉淀中加入500ul去离子水重悬，12000rpm，离心5分钟，去除上清。加入100ul的裂解液(配方如下)，100℃沸水浴15分钟，12000rpm离心3分钟，上清即为粗提的DNA模板。

附：裂解液配方：

1×PCR缓冲液(含Mg²⁺)

0.5％的NP 40

0.5％的Tween 20

3.扩增靶序列：取上述基因组提取方法提取的5ul上清作为模板加入PCR反应混合液中，PCR反应混合液配方如下表4-表5所示。(注：以下表4-表5中的PCR缓冲液、MgCl₂、dNTP混合物，Taq酶均购自Sangon公司)

表4A组Multiplex PCR反应混合液配方

表5B组Multiplex PCR反应混合液配方

注：表中P-1至P-22为表2中所列的引物。

将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：

94℃ 5分钟

94℃ 30秒

50℃ 30秒

72℃ 1分钟回到第二步，共35个循环

72℃ 5分钟

4℃ 20分钟

3.纯化：将上述获得的PCR扩增产物用纯化柱(MILIPORE公司)纯化，具体步骤如下：

(1)将PCR产物转移至纯化柱中，加水补足至400μl。

(2)25℃、6000rpm离心15分钟，丢弃收集管。

(3)将纯化柱转移到新的1.5ml的离心管中，加入25μl的超纯水(MilliQ)，37℃放置5分钟。

(4)将纯化柱倒置放在1.5ml的离心管上，6000rpm离心2分钟，收集产物。

4.标记靶序列：取12μl纯化产物，加入标记混合液中，标记反应混合液配方如下表6-表7所示。

表6A组标记混合液配方

表7B组标记混合液配方

注：表中P-2、P-4、P-6、P-8、P-10、P-12、P-14、P-16、P-18、P-20、P-22均为表2中所列的引物。

将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：

94℃ 5分钟

94℃ 30秒

50℃ 30秒

72℃ 1分钟回到第二步，共35个循环

72℃ 5分钟

4℃ 20分钟

5.烘干：将标记产物置65℃烘箱烘干。

6.杂交：向杂交盒(博奥公司)内预加入70μl ddH₂O以保持湿度。20μl杂交液(配方如下所示)回溶烘干产物并加在实施例三中制备的肠道中常见致病菌检测基因芯片的探针阵列区域，盖上定制的盖片(博奥公司)(注意盖片和载玻片之间不能有气泡)，盖紧杂交盒，43℃水浴锅中杂交16小时。

7.洗涤：杂交到时，取出杂交盒，去除盖片，将基因芯片依次在洗液A中洗涤3分钟，洗液B中洗涤3分钟，洗液C中洗涤90秒，空气中风干。

杂交液配方：10％硫酸葡聚糖(dextran Sulfate)；25％甲酰胺(formamide)；0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)；6×SSPE

洗液A：1×SSC(氯化钠-柠檬酸钠溶液)；0.1％SDS

洗液B：0.05×SSC

洗液C：95％乙醇

8.扫描：用GenePix personal 4100A生物芯片扫描仪(AXONinstrument)扫描，所用参数如下：

软件及版本：GenePix Pro 6.0

official name：575DF35

PMT Gain：550

扫描分辨率：10μm

扫描结果存为JPG、TIF、GPR格式

用本发明的基因芯片分别检测常见的肠道中致病菌(奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、创伤弧菌、蜡样芽孢杆菌群、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌)时的杂交扫描结果如图3A-3L所示。

9.分析判读：由于此芯片检测的目标菌有12种，探针48条，属于低密度芯片，检测结果可由肉眼判断。根据扫描出的杂交图像，以正对照探针的位置作为图像坐标，判断出现荧光信号的特异探针的位置，对照点阵排布图判断出致病菌。若只有正对照探针有信号，则不存在此12种致病菌。

实施例5对基因芯片进行特异性鉴定和灵敏度检测

对实施例3中制备的水产品中重要致病菌检测基因芯片的特异性进行鉴定如下：

总计用132株致病菌的代表性菌株和检出株以及他们的近缘菌株来鉴定实施例3中制备的水产品中重要致病菌检测基因芯片的特异性。在该特异性鉴定试验中，使用的所有菌株情况见表8。利用本发明的基因芯片和上述检测方法进行杂交检测，均显示了正确的杂交结果，这说明本发明的基因芯片具有良好的特异性。

表8：特异性试验用到的菌株

a，中国兽医微生物菌种保藏管理中心National Center for Veterinary Culture Collections(CVCC)，Beijing，China.

b，中国医学微生物菌种保藏管理中心National Center for Medical Culture Collections(CMCC)，Beijing，China.

c，美国标准生物品收藏中心American Type Culture Collection(ATCC)，USA

d，中国科学院微生物所Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences(AS)，Beijing，China.

e，中国军事医学科学院Academy of military medical sciences.

f，中国天津出入境检验检疫局Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin.China.

g，澳大利亚悉尼大学(分子和微生物科学学院)School of Molecular and MicrobialBiosciences(G08)，University of Sydney，Sydney，NSW 2006，Australia.(Reeves)Aus＝Aus-new

h，中国疾病预防控制中心Chinese Center For Disease Control And Prevention.

i，日本顺天堂大学

j，中国台湾台北东吴大学Soochow University，Taipei，Taiwan，China.

k，中国农业微生物菌种保藏管理中心Agricultural Culture Collection of China(ACCC)，Beijing，China.

l，瑞典哥德堡大学Cultrue Collection of the University of Goeteborg(CCUG)，Sweden.m，捷克国家标准菌库Czech Culture Collection of Type Culture，Institute of Hygiene，Prague(Prk)，Czech Republic.

n，波兰罗兹大学微生物和免疫研究院Department of Immunobiology of BacteriaInstitute of Microbiology and Immunology University of Lodz，Loda，Poland.

o，天津中医大学Tianjin university of traditional chinese medicine.China.

p，英国国家标准菌库National Collection of Type Cultures(NCTC)，Central PublicHealth Laboratory，London，United Kingdom

q，德国国家生物材料研究所The German National Resource Centre for BiologicalMaterial

r，上海CDC

s，天津市公安医院

t，德国国家材料测试研究院Federal institute for Risk Assessment(BfR)NationalReference Laboratory for Escherichia coli，Berlin Germany

对实施例3中制备的水产品中重要致病菌检测基因芯片的灵敏度进行检测如下：

该基因芯片的检测灵敏度经过158次杂交实验的验证，10ng的微量基因组DNA就可保证上述12种致病菌具有稳定、良好的杂交结果，这说明本发明的基因芯片具有很高的检测灵敏度。

根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可以做出各种可能的等同改变或替换，而所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。

Claims

1.一种用于检测水产品中重要致病菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于，所述寡聚核苷酸探针包含从以下核苷酸序列中选取的一种或多种：

2)上述1)中选取的DNA序列的互补DNA序列；

3)上述1)或2)中选取的DNA序列的互补RNA序列。

2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述寡聚核苷酸探针具有如SEQ ID NO：2-45所示的核苷酸序列中的至少一种。

3.根据权利要求1或2所述的基因芯片，其特征在于，还包含固定在该固相载体上的阳性对照探针、阴性对照探针或荧光探针。

4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于，所述阳性对照探针选自细菌16S rDNA保守区中的DNA片段或者其互补的DNA或RNA序列。

5.根据权利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述阳性对照探针具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

6.权利要求1所述的基因芯片在检测水产品中奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、创伤弧菌、蜡样芽孢杆菌群、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌中至少一种致病菌中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包含使用检测引物，所述检测引物具有SEQ ID NO：46-67所示的核苷酸序列中的至少一种或与SEQ ID NO：46-67所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列中的至少一种。

8.一种用于检测水产品中重要致病菌的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的基因芯片。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括检测引物，所述检测引物具有SEQ ID NO：46-67所示的核苷酸序列中的至少一种或与SEQ ID NO：46-67所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列中的至少一种。

10.权利要求8所述的试剂盒在检测水产品中奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、创伤弧菌、蜡样芽孢杆菌群、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌中至少一种致病菌中的应用。