CN114317788A - 一种用于检测猪源奇异变形杆菌的探针引物组合及其试剂盒和方法 - Google Patents
一种用于检测猪源奇异变形杆菌的探针引物组合及其试剂盒和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测猪源奇异变形杆菌的探针引物组合及其试剂盒和方法，涉及生物检测技术领域，本发明提供了用于检测猪奇异变形杆菌的引物对1～3中的至少一项，引物对1的上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.1～2所示；引物对2的上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.3～4所示；引物对3的上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.5～6所示。本发明通过靶序列设计引物对、对纳米粒子进行调控，并优化PCR体系，显著提高了检测的灵敏度，具有特异性高，稳定性强的优点，为猪奇异变形杆菌的临床诊断提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种用于检测猪源奇异变形杆菌的探针引物组合及其试剂盒和方法。
背景技术
奇异变形杆菌为革兰氏阴性杆菌，属肠杆菌科，变形杆菌属，无荚膜且无芽孢。奇异变形杆具有较强的迁徙能力。广泛分布于自然环境、人体和动物的体表、黏膜、消化道、粪便中。当机体免疫力下降时，可引起动物和人腹泻、化脓性炎症和败血症。已有研究报道，奇异变形杆菌能引起猪发病，且有一定的致死性。奇异变形杆菌感染后临床症状为高热、气喘、呕吐、腹泻，严重时能引起猪的败血症。所以建立猪源奇异变形杆菌的检测方法在临床应用上非常有必要。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种用于检测猪源奇异变形杆菌的探针引物组合及其试剂盒和方法。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种用于检测猪源奇异变形杆菌的探针引物组合，其包括引物对；所述引物对包括(1)～(3)中的至少一项：
(1)上游引物和所述下游引物的序列依次如SEQ ID No.1～2所示；
(2)上游引物和所述下游引物的序列依次如SEQ ID No.3～4所示；
(3)上游引物和所述下游引物的序列依次如SEQ ID No.5～6所示。
第二方面，本发明实施例提供了一种用于检测猪源奇异变形杆菌的试剂盒，其包括如前述实施例所述的用于检测猪源奇异变形杆菌的探针引物组合。
第三方面，本发明实施例提供了一种猪源奇异变形杆菌的扩增方法，其包括：采用如前述实施例所述的用于检测猪源奇异变形杆菌的探针引物组合或采用如前述实施例所述的用于检测猪源奇异变形杆菌的试剂盒对待测样本进行PCR扩增；所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
第四方面，本发明实施例提供了一种猪源奇异变形杆菌的检测方法，其包括：采用如前述实施例所述的猪源奇异变形杆菌的PCR扩增方法对待测样本进行PCR扩增，然后对扩增产物进行检测；所述检测方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了用于检测猪奇异变形杆菌的引物对，其能够用于纳米PCR扩增，显著提高了检测的灵敏度，具有特异性高，稳定性强的优点，为猪奇异变形杆菌的临床诊断提供技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为引物对1猪源奇异变形杆菌PCR扩增图；其中，M为DL5000Marker；1为阴性对照，2～6依次为:52℃、54℃、56℃、58℃和60℃；
图2为引物对2猪源奇异变形杆菌PCR扩增图；其中，M为DL5000Marker；1为阴性对照，2～6依次为:52℃、54℃、56℃、58℃和60℃；
图3为引物对3猪源奇异变形杆菌PCR扩增图；其中，M为DL5000Marker；1为阴性对照，2～6依次为:52℃、54℃、56℃、58℃和60℃；
图4为引物对4猪源奇异变形杆菌PCR扩增图；其中，M为DL5000Marker；1为阴性对照，2～6依次为:52℃、54℃、56℃、58℃和60℃；
图5为引物对5猪源奇异变形杆菌PCR扩增图；其中，M为DL5000Marker；1为阴性对照，2～6依次为:52℃、54℃、56℃、58℃和60℃；
图6为引物对6猪源奇异变形杆菌PCR扩增图；其中，M为DL5000Marker；1为阴性对照，2～6依次为:52℃、54℃、56℃、58℃和60℃；
图7为猪源奇异变形杆菌3对引物对的质粒扩增图；其中，M为DL5000Marker；1为阴性对照，2～4依次为引物对1、引物对2、引物对3重组质粒扩增图片；
图8为引物对1重组质粒标准品的不同纳米直径和浓度PCR扩增图；其中，A：1为阴性对照，2～6为直径为18-20nm、20-23nm、20-40nm、40-60nm的PCR扩增结果；B：1为阴性对照，2～6依次为纳米浓度为0.8μl、1.2μl、1.6μl、2.0μl和2.4μl的PCR扩增结果；
图9为引物对2重组质粒标准品的不同纳米直径和浓度PCR扩增图；其中，A：1为阴性对照，2～6为直径为18-20nm、20-23nm、20-40nm、40-60nm的PCR扩增结果；B：1为阴性对照，2～6依次为纳米浓度为0.8μl、1.2μl、1.6μl、2.0μl和2.4μl的PCR扩增结果；
图10为引物对3重组质粒标准品的不同纳米直径和浓度PCR扩增图；其中，A：1为阴性对照，2～6为直径为18-20nm、20-23nm、20-40nm、40-60nm的PCR扩增结果；B：1为阴性对照，2～6依次为纳米浓度为0.8μl、1.2μl、1.6μl、2.0μl和2.4μl的PCR扩增结果；
图11为引物对1重组质粒标准品的纳米PCR特异性扩增图；其中，1为阴性对照，2为猪源奇异变形杆菌纳米PCR扩增条带；3～7依次为葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、副猪嗜血杆菌和巴氏杆菌扩增结果；
图12为引物对2重组质粒标准品的纳米PCR特异性扩增图；其中，1为阴性对照，2为猪源奇异变形杆菌纳米PCR扩增条带；3～7依次为葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、副猪嗜血杆菌和巴氏杆菌扩增结果；
图13为引物对3重组质粒标准品的纳米PCR特异性扩增图；其中，1为阴性对照，2为猪源奇异变形杆菌纳米PCR扩增条带；3～7依次为葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、副猪嗜血杆菌和巴氏杆菌扩增结果；
图14为引物对1不同稀释浓度重组质粒标准品PCR和纳米PCR扩增图；其中，A：M为DL5000 Marker；1为阴性对照，2～7依次为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释浓度重组质粒标准品的PCR扩增结果；B：M为DL5000 Marker；1为阴性对照，2～7依次为：10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释浓度重组质粒标准品的纳米PCR扩增结果；
图15为引物对3不同稀释浓度重组质粒标准品PCR和纳米PCR扩增图；其中，A：M为DL5000 Marker；1为阴性对照，2～7依次为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释浓度重组质粒标准品的PCR扩增结果；B：M为DL5000 Marker；1为阴性对照，2～7依次为：10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释浓度重组质粒标准品的纳米PCR扩增结果；
图16为10份疑似奇异变形杆菌感染样品的纳米PCR扩增图；其中，M为DL5000Marker，1～10依次为10份疑似样品的扩增结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
首先，本发明实施例提供了一种用于检测猪源奇异变形杆菌的探针引物组合，其包括引物对1～3中的至少一对：引物对1的上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.1～2所示；引物对2的上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.3～4所示；引物对3的上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.5～6所示。
引物对优选为引物对1和3，检测的灵敏度更高，特异性更强。
更优选为引物对1，检测的灵敏度更高，为普通PCR的100倍，特异性更强，更适用于构建纳米PCR检测体系。
本发明实施例提供了一种用于检测猪源奇异变形杆菌的试剂盒，其包括：如前述任意实施例所述的用于检测猪源奇异变形杆菌的探针引物组合。
优选地，所述试剂盒还包括金纳米颗粒。
可选地，所述金纳米颗粒的直径选自18～60nm，具体可以为18nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm或60nm；更优选地，所述金纳米颗粒的直径选自18～20nm，在该范围下，搭配上述引物对能够更有效地实现对猪源奇异变形杆菌的检测。
可选地，所述试剂盒还包括：Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和反应缓冲液中的至少一种。
本发明实施例提供了一种猪源奇异变形杆菌的PCR扩增方法，其包括：采用如前述任意实施例所述的用于检测猪源奇异变形杆菌的探针引物组合或采用如前述任意实施例所述的用于检测猪源奇异变形杆菌的试剂盒对待测样本进行PCR扩增；所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的，例如，当待测样本选自环境样本时，实施检测的直接目的并非是以疾病的诊断或治疗为直接目的。
当仅采用上述引物对进行PCR扩增时，为普通的PCR扩增。
当采用所述试剂盒(包括金纳米颗粒)对待测样本进行PCR扩增时，包括以下步骤：
将待测样本的核酸、上游引物、下游引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和反应缓冲液以及金纳米颗粒混合，进行纳米PCR扩增。
优选地，在PCR扩增的反应体系中，金纳米颗粒的终浓度为0.1～0.5nmol/L，具体可以为0.1nmol/L、0.2nmol/L、0.3nmol/L、0.4nmol/L或0.5nmol/L，更优选为0.3nmol/L。在该浓度下的扩增效果更好。
优选地，在所述PCR扩增的反应体系中，上游引物和下游引物的摩尔比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)，优选为1：1。
优选地，在所述PCR扩增的反应体系中，引物对中上下游引物的终浓度为0.3～0.5mmol/L，具体可以为0.3mmol/L、0.4mmol/L或0.5mmol/L。
优选地，所述PCR扩增的反应条件如下：94～96℃4～6min；94～96℃44～46s，退火温度54～58℃34～36s，71～73℃29～31S，共35个循环；71～73℃9～11min。
在优选的反应体系和条件中，检测的灵敏度和特异性更高，稳定性更好。
此外，本发明实施例还提供了一种猪源奇异变形杆菌的检测方法，其包括：采用如前述任意实施例所述的猪源奇异变形杆菌的PCR扩增方法对待测样本进行PCR扩增，然后对扩增产物进行检测；所述检测方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的，例如，当待测样本选自环境样本时，实施检测的直接目的并非是以疾病的诊断或治疗为直接目的。
优选地，所述检测方法包括对扩增产物的片段大小进行鉴定或基于探针对所述扩增产物进行定量检测。
优选地，对扩增产物的片段大小进行鉴定的步骤包括：将扩增产物的片段大小与引物对对应的扩增产物的片段大小进行对比；引物对1对应的扩增产物的片段大小为290bp；引物对2对应的扩增产物的片段大小为567bp；引物对3对应的扩增产物的片段大小为328bp；若扩增产物的片段与引物对1～3中任一项对应的扩增产物的片段大小相同，则表明样本中含有猪源奇异变形杆菌。
当所述检测方法包括基于探针对所述扩增产物进行定量检测时，探针是基于引物对对应的扩增产物进行设计的，探针的具体序列以及定量检测手段均是可以基于现有的探针设计手段获得的，在此不再赘述。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
试验试剂及仪器
试剂：引物由上海生工生物工程有限公司合成；DP302细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、DNA纯化回收试剂盒均购于北京天根生化科技有限公司，DL5000 DNAMarker购于大连宝生物，胶体金纳米颗粒购自Cytodiagnostics公司，Peasy-T1载体购于全式金生物技术有限公司。
仪器：美国赛默飞微量高速离心机，美国赛默飞ABI Veriti PCR仪，上海天能凝胶成像系统，上海天能水平电泳系统等，梅特勒分光光度计。
病料：实验室自留的猪源奇异变形杆菌阳性样本，某大型养殖场提供的猪源奇异变形杆菌可疑样品。
实施例1
一种猪源奇异变形杆菌的检测方法，其包括以下步骤。
1、引物合成
利用NCBI网站下载猪源奇异变形杆菌16S rRNA基因序列，利用Primer 5.0引物设计软件设计特异性扩增猪源奇异变形杆菌引物对1，引物序列及扩增目的片段。引物序列由上海生工合成。
表1引物信息
备注：F代表上游引物，R代表下游引物。
2、菌种复苏
选用LB液体培养基，用灭菌接种环对保存的猪源奇异变形杆菌进行接种并做好标记，置于37℃培养箱中培养24h后放4℃冰箱保存备用。
3、单重PCR扩增
3.1扩增模板制备
根据天根DP302细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书步骤，提取复苏好的猪源奇异变形杆菌基因组放于4℃备用。
3.2扩增体系建立
引物对用ddH2O进行稀释，浓度为25pmol/L；引物对的PCR反应体系为25μL：10×PCR Buffer 3μl，MgC12(25mM)2μl，dNTP(2.5mM)4μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，上游引物、下游引物各1.0μL，DNA 1.0μL模板，ddH2O补至25μl。
PCR的反应条件：95℃5min；95℃45s，退火温度56℃35s，72℃30S，共35个循环；72℃10min。
PCR扩增结束后，取5μL PCR扩增产物于2％琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
3.3构建重组质粒标准品
利用引物对1，通过普通3.2方法利用退火温度进行产物扩增，50μL，利用胶回收试剂盒，对扩增产物进行胶回收纯化，与Peasy-T1载体连接，然后从-80℃取50ul Trans1-T1感受态细胞，加入5ul连接产物，冰浴30min，42℃热休克90s，冰浴2min，加入500μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃250r/min震荡培养1h。之后用移液枪吸取30μL均匀涂布于含50μg/mL氨苄的LB固体平板上，37℃培养12h。从上述转化培养的平板中挑取白色单菌落，接种于15mL含氨苄的LB液体培养基，37℃250r/min震荡培养过夜(不要超过16h)，离心去上清，收集菌体，提取质粒，提取步骤参照试剂盒。重组质粒利用3.2步骤的PCR方法鉴定。
将鉴定后能够用于检测的引物后于后续的纳米PCR检测。
3.4纳米PCR检测
去离子水作为阴性对照，利用提取好的引物对1的阳性标准品基因组为模板，引物对的总反应体系为25μL，10×PCR Buffer 3μl，MgC12(25mM)2μl，dNTP(2.5mM)4μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，上下游引物(10mmol/L)各1μL，模板1μL，然后添加直径为18-20nm的纳米粒子(浓度为0.3nmol/L的金纳米颗粒)，ddH2O补至25μl进行PCR扩增检测，反应条件见为95℃5min；95℃45s，退火温度56℃35s，72℃30S，共35个循环；72℃10min。
实施例2
一种猪源奇异变形杆菌的检测方法，步骤大致与实施例1相同，区别在于引物对的不同，区别如下：
利用NCBI网站下载猪源奇异变形杆菌16S rRNA基因序列，利用Primer 5.0引物设计软件设计特异性扩增猪源奇异变形杆菌引物对2，引物序列及扩增目的片段见表2。
表2引物信息
实施例3
一种猪源奇异变形杆菌的检测方法，步骤大致与实施例1相同，区别在于引物对的不同，区别如下：
利用NCBI网站下载猪源奇异变形杆菌16S rRNA基因序列，利用Primer 5.0引物设计软件设计特异性扩增猪源奇异变形杆菌引物对3，引物序列及扩增目的片段见表3。
表3引物信息
实施例4
一种猪源奇异变形杆菌的检测方法，步骤大致与实施例1相同，区别在于金纳米颗粒的直径的不同，区别如下：金纳米颗粒的直径为20-23nm。
实施例5
一种猪源奇异变形杆菌的检测方法，步骤大致与实施例1相同，区别在于金纳米颗粒的直径的不同，区别如下：金纳米颗粒的直径为20-40nm。
实施例6
一种猪源奇异变形杆菌的检测方法，步骤大致与实施例1相同，区别在于金纳米颗粒的直径的不同，区别如下：金纳米颗粒的直径为40-60nm。
实施例7
一种猪源奇异变形杆菌的检测方法，步骤大致与实施例1相同，区别在于PCR反应条件中退火温度的不同，区别如下：PCR退火温度为54℃。
实施例8
一种猪源奇异变形杆菌的检测方法，步骤大致与实施例1相同，区别在于PCR反应条件中退火温度的不同，区别如下：PCR退火温度为58℃。
对比例1
一种猪源奇异变形杆菌的检测方法，步骤大致与实施例1相同，区别在于引物对的不同，区别如下：
利用NCBI网站下载猪源奇异变形杆菌16S rRNA基因序列，利用Primer 5.0引物设计软件设计特异性扩增猪源奇异变形杆菌引物对4，引物序列及扩增目的片段见表4。
表4引物信息
对比例2
一种猪源奇异变形杆菌的检测方法，步骤大致与实施例1相同，区别在于引物对的不同，区别如下：
利用NCBI网站下载猪源奇异变形杆菌16S rRNA基因序列，利用Primer 5.0引物设计软件设计特异性扩增猪源奇异变形杆菌引物对5，引物序列及扩增目的片段见表5。
表5引物信息
对比例3
一种猪源奇异变形杆菌的检测方法，步骤大致与实施例1相同，区别在于引物对的不同，区别如下：
利用NCBI网站下载猪源奇异变形杆菌16S rRNA基因序列，利用Primer 5.0引物设计软件设计特异性扩增猪源奇异变形杆菌引物对6，引物序列及扩增目的片段见表6。
表6引物信息
对比例4
一种猪源奇异变形杆菌的检测方法，步骤大致与实施例1相同，区别在于PCR反应条件中退火温度的不同，区别如下：PCR退火温度为52℃。
对比例5
一种猪源奇异变形杆菌的检测方法，步骤大致与实施例1相同，区别在于PCR反应条件中退火温度的不同，区别如下：PCR退火温度为58℃。
对比例6
一种猪源奇异变形杆菌的检测方法，步骤大致与实施例1相同，区别在于PCR反应条件中退火温度的不同，区别如下：PCR退火温度为60℃。
验证例1
采用实施例1～3、对比例1～3提供的引物对，分别在退火温度为2℃,54℃,56℃,58℃,60℃的条件下进行普通PCR扩增，引物对1～3、对比例1～3的扩增结果分别如图1～6所示。
由结果可知，引物对1、引物对2和引物对3能扩增出目的片段，分别为290bp、567bp、328bp，且最佳退火温度分别为54℃、58℃、56℃，目的片段清晰，无杂带；引物对4、引物对5虽然能扩增出目的片段，但是有杂带，特异性不强；引物对6没有扩增出目的片段；说明只有引物对1、引物对2、引物对3可以应用于实验室的单重PCR检测，引物对4和引物对5缺乏扩增特异性，有杂带；引物对6没有扩增出目的片段。
验证例2
采用实施例1～3提供的引物对1～3对实施例1中构建的重组质粒标准品进行检测。结果如图7所示。
由结果可知，引物对1、引物对2和引物对3都能跑出目的片段。
验证例3
基于实施例1～3提供的检测方法，按照不同的金纳米颗粒的直径(18-20nm、20-23nm、20-40nm、40-60nm)和反应体系中的不同金纳米量(0.8ul、1.2ul、1.6ul、2.0ul、2.4ul)，每个金纳米添加量的纳米终浓度分别为0.1nmol/L、0.2nmol/L、0.3nmol/L、0.4nmol/L或0.5nmol/L；设置多组实验组，进行纳米PCR检测，引物对1～3的检测结果依次见图8～10。
由结果可知，引物对1的最佳的纳米直径为18-20nm，最佳纳米的反应量为1.6μL(图8)；引物对2的最佳的纳米直径为20-23nm，最佳纳米的反应量为2.0μL(图9)；引物对3的最佳的纳米直径为18-20nm，最佳纳米的反应量为2.0μL(图10)。
验证例4
特异性验证。
采用实施例1～3提供的引物对1～3及其检测方法，分别对葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、副猪嗜血杆菌和巴氏杆菌进行扩增，验证结果见图11～13。
由结果可知，引物对1和引物对3除了扩增出奇异变形杆菌的目的条带，无其他条带扩增出，扩增结果见图11和图13；说明引物对1和引物对3建立的纳米PCR方法有较强的特异性；而引物对2除了扩增出奇异变形杆菌的目的条带，对葡萄球菌、大肠杆菌和巴氏杆菌进行扩增，会产生扩增条带(图12)。
验证例5
灵敏度验证。
利用风光度计测量引物对1(实施例1)和引物对3(实施例3)构建的阳性质粒标准品的初始浓度分别为4.78×109拷贝/μL、5.02×109拷贝/μL。
分别以10倍倍比稀释两种质粒标准品，以其为模板，然后进行10倍倍比稀释，稀释度分别为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8。进行普通PCR和纳米PCR检测。
引物对1普通PCR可检测到奇异变形杆菌最低拷贝数分别为4.78×104拷贝/μL，而纳米PCR可检测到4.78×102拷贝/μL(图14)，纳米PCR检测方法的敏感性比普通PCR高了100倍。
引物对3普通PCR可检测到奇异变形杆菌最低拷贝数分别为5.02×104拷贝/μL，而纳米PCR可检测到5.02×103拷贝/μL(图15)，纳米PCR检测方法的敏感性比普通PCR高了10倍；
通过对比可知，发现引物对1的敏感性比引物对3的高了10倍，说明引物对1优于引物对3，且纳米PCR的敏感性高于普通PCR。
验证例6
对10份疑似样品进行猪源奇异变形杆菌分离，之后利用引物对1(实施例1)进行纳米PCR验证，验证结果见图16。10份疑似样品有3份扩增出了目的片段(有一个片段比较模糊)，并将这3份样品进行测序，和NCBI猪源基因序列进行比对，同源性都为99％；说明设计的猪奇异变形杆菌引物能很好的进行纳米双重PCR扩增，可以为猪奇异变形杆菌的临床诊断提供技术支持。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 漳州傲农现代农业开发有限公司
泰和县傲牧育种有限公司
吉安市傲宝生物科技有限公司
福建傲农生物科技集团股份有限公司
<120> 一种用于检测猪源奇异变形杆菌的探针引物组合及其试剂盒和方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agtcagatgt gaaagccccg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aacgcgttaa gctcccagaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcttgtgaga gcgggggata 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccggcagtct cctttgagtt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caaaggagac tgccggtgat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aacgatgagt aagcgccctc 20
Claims (10)
1.一种用于检测猪源奇异变形杆菌的探针引物组合，其特征在于，其包括：引物对1～3中的至少一对：
引物对1的上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.1～2所示；
引物对2的上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.3～4所示；
引物对3的上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.5～6所示。
2.一种用于检测猪源奇异变形杆菌的试剂盒，其特征在于，其包括：如权利要求1所述的用于检测猪源奇异变形杆菌的探针引物组合。
3.根据权利要求2所述的用于检测猪源奇异变形杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括金纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的用于检测猪源奇异变形杆菌的试剂盒，其特征在于，所述金纳米颗粒的直径选自：18～60nm；
优选地，所述金纳米颗粒的直径选自：18～20nm。
5.根据权利要求2～4任一项所述的用于检测猪源奇异变形杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和反应缓冲液中的至少一种。
6.一种猪源奇异变形杆菌的PCR扩增方法，其特征在于，其包括：采用如权利要求1所述的用于检测猪源奇异变形杆菌的探针引物组合或采用如权利要求2～5任一项所述的用于检测猪源奇异变形杆菌的试剂盒对待测样本进行PCR扩增；所述扩增方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
7.根据权利要求6所述的猪源奇异变形杆菌的PCR扩增方法，其特征在于，当采用所述试剂盒对待测样本进行PCR扩增时，包括以下步骤：将待测样本的核酸、上游引物、下游引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和反应缓冲液以及金纳米颗粒混合，进行纳米PCR扩增。
8.根据权利要求6所述的猪源奇异变形杆菌的PCR扩增方法，其特征在于，在所述PCR扩增的反应体系中，金纳米颗粒的终浓度为0.1～0.5nmol/L。
9.根据权利要求6～8任一项所述的猪源奇异变形杆菌的PCR扩增方法，其特征在于，在所述PCR扩增的反应体系中，上游引物和下游引物的摩尔比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)；
优选地，在所述PCR扩增的反应体系中，引物对中上下游引物的终浓度为0.3～0.5mmol/L；优选地，所述PCR扩增的反应条件如下：94～96℃4～6min；94～96℃44～46s，退火温度52～60℃34～36s，71～73℃29～31S，共35个循环；71～73℃9～11min。
10.一种猪源奇异变形杆菌的检测方法，其特征在于，其包括：采用如权利要求6～9任一项所述的猪源奇异变形杆菌的PCR扩增方法对待测样本进行PCR扩增，然后对扩增产物进行检测；所述检测方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的；
优选地，所述检测方法包括对扩增产物的片段大小进行鉴定或基于探针对所述扩增产物进行定量检测；
优选地，对扩增产物的片段大小进行鉴定的步骤包括：将扩增产物的片段大小与引物对对应的扩增产物的片段大小进行对比；引物对1对应的扩增产物的片段大小为290bp，引物对2对应的扩增产物的片段大小为567bp，引物对3对应的扩增产物的片段大小为328bp；若扩增产物的片段与引物对1～3中任一项对应的扩增产物的片段大小相同，则表明样本中含有猪源奇异变形杆菌。
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