CN110564881A - 一种重组酶等温扩增技术检测副溶血性弧菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组酶等温扩增技术检测副溶血性弧菌的方法，检测副溶血性弧菌的RAA引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物，上游引物5’端荧光素修饰，下游引物5’端生物素修饰，得到结合试纸条端点检测副溶血性弧菌的RAA特异引物对。本发明将RAA技术与侧流层析试纸条结合，可以准确、高效地检测副溶血性弧菌，灵敏度比常规PCR高出十倍数量级，细菌纯培养物最低检测限可达1.89×103cfu/ml。该方法操作简单，可用于疾病监测、临床诊断和水产品安全检测，便于基层推广使用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种重组酶等温扩增技术检测副溶血性弧菌的方法。
背景技术
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是一种嗜盐性革兰氏阴性弧菌，隶属于γ-变形菌纲，弧菌目，弧菌科，弧菌属，广泛存在于鱼虾、贝类水产品中，在海洋和河口生态环境中的海水和海底沉积物也有分布。副溶血性弧菌污染不仅会对水产养殖造成巨大的经济损失，而且食用生的海鲜或未煮熟的水产品能引起人类肠胃炎，严重者可导致食物中毒，故也将其称为肠炎弧菌。因此，检测水产品中的副溶血性弧菌很有必要和意义。
目前，副溶血性弧菌的检测方法主要是传统培养法和PCR法。传统培养法对仪器设备的要求不高，可操作性成本低，但是耗时、低效、操作繁琐，无法满足当前检测工作的快速性要求。基于PCR技术开发的检测方法显示了高的灵敏度和特异性，但是该方法依赖PCR仪或荧光PCR仪，对操作人员要求高等限制了其在低资源环境和高爆发疫病区副溶血性弧菌的快速检测，不能满足现场快速检测的需求。
重组酶等温扩增技术(Recombinase Aided Amplification，RAA)是通过酶促反应在一定温度下实现解链、配对、延伸等过程。相较其他等温扩增技术而言，该技术所用的重组酶来源广泛，而且是具有我国自主知识产权的一项技术，不受国外专利的限制。RAA技术操作简单、价格低廉、便携式等优点更适合在非实验室环境中使用。目前，这项技术已经应用到病毒、细菌、寄生虫、园艺作物等快速检测中，然而并没有基于副溶血性弧菌toxR基因的检测方法并结合侧流层析试纸条(LF)的视觉化检测。
发明内容
为克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的是提供一种新型重组酶等温扩增技术(RAA)结合侧流层析试纸条端点检测副溶血性弧菌的方法，可在非实验室环境中快速、灵敏以及特异性高的检测出副溶血性弧菌，在低资源环境和检测现场快速实现核酸体外扩增，摆脱仪器束缚，且降低成本。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测副溶血性弧菌的RAA引物，包括靶向toxR基因的上游引物如SEQ ID NO.1所示、下游引物如SEQ ID NO.2所示的引物对序列，或所述引物对序列的互补链序列中单条序列同源性为50％及以上的碱基序列。
进一步，如SEQ ID NO.1所示的上游引物5’端荧光素修饰，如SEQ ID NO.2所示的下游引物5’端生物素修饰，可得到结合试纸条端点检测副溶血性弧菌的RAA特异引物对。
更进一步，所述荧光素采用6-FAM，所述生物素采用Biotin。
一种检测副溶血性弧菌的RAA试剂盒，包括所述检测副溶血性弧菌的RAA引物或所述结合试纸条端点检测副溶血性弧菌的RAA特异引物对，或还包括以冻干粉形式的RAA反应组分和RAA反应缓冲液、无菌去离子水、醋酸镁和侧流层析试纸条。
一种检测副溶血性弧菌的RAA方法，包括如下步骤：提取待测样品的DNA，将所述试剂盒和待测样品基因组DNA配制RAA反应体系，并在37℃恒温扩增反应20min，在试纸条吸收垫位置做好标记，在室温条件下取10μL上述核酸扩增产物滴加到样品垫上，并将试纸条样品垫末端垂直插入含有100μL LF缓冲液的EP管中，5min后取出试纸条，观察并记录结果；其中：
阳性样品试纸条的质控线与检测线均出现清晰可见的红色条带，表明待测样品中含有待检测的核酸片段，且其数量达到或高于试纸条的最低检出量；
阴性样品仅有质控线出现清晰可见的红色条带，表明样本中不含目的核酸，或其数量低于试纸条的最低检出量。
进一步，所述RAA反应体系以50μL为：
| RAA反应缓冲液 | 25μL |
| 10μmol/L上游引物、下游引物 | 各1μL |
| 无菌去离子水 | 19.5μL |
| 冻干粉 | 10mg |
| 模板DNA | 1μL |
| 醋酸镁 | 2.5μL。 |
进一步，上述方法检测副溶血性弧菌纯培养物的最低检测限为1.89×103cfu/mL。
本发明相对于现有技术的有益效果包括：
1.本发明克服现有检测技术周期长、依赖设备性强等问题，充分利用分子生物学信息和数据库，设计特异性靶向副溶血性弧菌的引物，建立副溶血性弧菌的RAA扩增并结合试纸条检测方法，将RAA技术与试纸条相结合，可以快速准确的通过肉眼判读出结果，从而确定检出副溶血性弧菌。
2.本发明的RAA-LF方法灵敏度(10fg·μL-1)相较于常规PCR(100fg·μL-1)方法高出十倍数量级，纯菌液培养物最低检测限可达1.89×103cfu/ml，操作简单，经检测发现与其他致病菌无交叉反应，特异性良好。本发明可摆脱仪器的束缚，在37℃、20min后可通过试纸条检测得到结果，在疾病监测、临床诊断和水产品安全等低资源环境中有重大的应用价值，便于在基层推广使用。
附图说明
图1为本发明中RAA反应体系优化结果图。其中，A，B，C分别是温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃)、时间(5min、10min、15min、20min、25min、30min)和引物浓度(400nmol/L、200nmol/L、100nmol/L、50nmol/L、25nmol/L、12.5nmol/L)的优化结果图。
图2为RAA-LF技术特异性验证实验结果图。其中，1-NC；2-Vibrioparahaemolyticus 3；3-Vibrio parahaemolyticus 6；4-Vibrio parahaemolyticusATCC17802；5-Vibrio parahaemolyticus ATCC33846；6-Vibrio parahaemolyticusATCC33847；7-Listeria monocytogenes 12；8-Listeria monocytogenes ATCC19115；9-Staphylococcus aureus 91093；10-Staphylococcus aureus G404；11-Vibrio cholerae6067；12-Salmonella enteritidis CMCC50041；13-Vibrio harveyi ATCC33842；14-Pseudomonas aeruginosa 12；15-Klebsiella pneumoniae G13；16-Klebsiella oxytocaG14。
图3为本发明中RAA-LF技术检测副溶血性弧菌灵敏度结果图。其中，A图是本发明建立的技术检测结果图；B图是常规PCR检测结果图。1-7是倍比稀释副溶血性弧菌基因组DNA(1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL)，8是阴性对照。
图4为本发明中RAA-LF检测细菌纯培养物灵敏度结果图。其中，1-1.89×106
cfu/ml；2-1.89×105cfu/ml；3-1.89×104cfu/ml；4-1.89×103cfu/ml；5-1.89×102
cfu/ml；6-1.89×101cfu/ml；7-1.89×100cfu/ml；NC-negative control。
具体实施方式
为了更加清楚明了本发明的实验方案和优点，下面结合附图用实施例进一步详述本发明。此处仅用实施例来解释本发明，但本发明的实施方式不局限于此。
下述实施例中使用的基础反应单元及基础缓冲液购自江苏奇天基因生物科技有限公司，产品编号为B000000A，其中基础反应单元包含反应所需的重组酶、聚合酶等。使用时，利用缓冲液将其溶解，整个反应在基础反应单元管中进行。
下述实施例中使用的侧流层析试纸条购自杭州优思达生物技术有限公司，产品型号为D003-03，包括试纸条和检测缓冲液。使用时，将滴加有核酸扩增产物的样品垫插入缓冲液中，5min后记录判读区的检测结果。
实施例1：靶基因的选取与RAA引物的设计
以副溶血性弧菌的特异性toxR基因(GenBank:FM202713.1)分析保守序列区域，根据RAA引物设计原则设计引物用于副溶血性弧菌的检测。本实施例中引物由上海生物工程有限公司合成，利用NCBI-BLAST和琼脂糖凝胶电泳扩增效果评价引物序列的特异性。具体如下：
上游引物：5’-TGGTTGCTGTCATGAATGTAGTTCAAAATC-3’，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物：5’-CGTTATTTTATTTTTGGCACTATTACTACCG-3’，如SEQ ID NO.2所示。
在上、下游5’端分别标记荧光素和生物素用于结合纳米粒子进行试纸条检测；其中，荧光素采用6-FAM，生物素采用Biotin，经筛选后的引物对经修饰后序列如下：
上游引物：5’-6-FAM-TGGTTGCTGTCATGAATGTAGTTCAAAATC-3’。
下游引物：5’-Biotin-CGTTATTTTATTTTTGGCACTATTACTACCG-3’。
结合琼脂糖凝胶电泳评价特异性良好的引物对后通过侧流层析试纸条对扩增产物进行检测。将上述设计的引物对经RAA核酸扩增试剂盒37℃，20min反应后通过2％琼脂糖凝胶电泳检测，在273bp位置有清晰明亮的目的条带，选择该引物对作为后续试验。
在某些实施方式中，可替代实施例1中上下游引物的至少一种，或替代实施例1中上游引物、下游引物序列或上游引物、下游引物序列的互补链序列中单条序列同源性为50％及以上的碱基序列，皆在本专利保护范围之内。
实施例2：副溶血性弧菌RAA检测条件优化
将副溶血性弧菌菌株从-80℃甘油管接种至LB(3％NaCl)培养基中37℃过夜培养，离心收集菌体，采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根)进行基因组DNA提取，按照操作说明略做调整。基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测浓度和纯度，保存至-20℃备用。
RAA反应按照RAA核酸扩增试剂盒(奇天-江苏)使用说明配制反应体系，总体积为50μL。
RAA扩增体系如下：先将基础缓冲液25μL、100nmol/L的上下游引物各1μL、模板DNA1μL、无菌去离子水19.5μL配制混匀后加入反应单元管，轻轻混匀后在管盖滴加2.5μL醋酸镁。
RAA反应条件：混匀上述组分后置于39℃条件下反应30min。
本发明主要通过温度、时间、引物浓度进行优化，反应温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃)，反应时间(5min、10min、15min、20min、25min、30min)，引物浓度(400nmol/L、200nmol/L、100nmol/L、50nmol/L、25nmol/L、12.5nmol/L)进行优化，反应体系参照试剂盒进行确定最佳反应条件。在试纸条吸收垫位置做好标记，在室温条件下取10μL上述核酸扩增产物滴加到样品垫上，并将试纸条样品垫末端垂直插入含有100μL LF缓冲液的EP管中，5min后取出试纸条进行观察并记录结果；其中：
阳性样品试纸条的质控线与检测线均出现清晰可见的红色条带，表明待测样品中含有待检测的核酸片段，且其数量达到或高于试纸条的最低检出量；
阴性样品仅有质控线出现清晰可见的红色条带，表明样本中不含目的核酸，或其数量低于试纸条的最低检出量。
扩增结果如图1所示，50μL的反应体系中引物浓度为100nM，置恒定孵育温度37℃反应20min。后取10μL扩增产物加样到试纸条检测端，在室温下放置5min后取出记录判读区的检测结果。
实施例3：RAA-LF检测副溶血性弧菌特异性
为了验证RAA的特异性，分别提取5株副溶血性弧菌菌株和10株非副溶血性弧菌菌株的基因组DNA，进行RAA扩增(模板浓度均为10ng/μL)，验证本发明中副溶血性弧菌RAA引物对与非靶标菌株的交叉反应。采用侧流层析试纸条对所有的扩增产物进行视觉化分析。
表1：用于RAA-LF检测特异性分析的菌株
| 菌株名称 | 菌株编号 | 菌种来源 |
| 副溶血性弧菌 | VP3 | 临床菌株 |
| 副溶血性弧菌 | VP6 | 临床菌株 |
| 副溶血性弧菌 | ATCC17802 | 购自美国ATCC菌种保藏中心 |
| 副溶血性弧菌 | ATCC33846 | 购自美国ATCC菌种保藏中心 |
| 副溶血性弧菌 | ATCC33847 | 购自美国ATCC菌种保藏中心 |
| 霍乱弧菌 | 6067 | 本实验室保存 |
| 哈维氏弧菌 | ATCC33842 | 购自美国ATCC菌种保藏中心 |
| 单增李斯特菌 | 12 | 本实验室保存 |
| 单增李斯特菌 | ATCC19115 | 购自上海疾控中心 |
| 金黄色葡萄球菌 | G404 | 本实验室保存 |
| 金黄色葡萄球菌 | CDC AB91093 | 购自上海疾控中心 |
| 肠炎沙门氏菌 | CMCC50041 | 购自中科院微生物所 |
| 肺炎克雷伯氏菌 | G13 | 本实验室保存 |
| 产酸克雷伯氏菌 | G14 | 本实验室保存 |
| 铜绿假单胞杆菌 | 12 | 本实验室保存 |
以表1中菌株基因组DNA作为反应模板，利用实施例1中的引物进行扩增。
RAA扩增体系如下：先将基础缓冲液25μL、100nmol/L的上下游引物1μL、模板DNA 1μL、纯化水19.5μL配制混匀后加入到基础反应单元管，轻轻混匀后在管盖滴加2.5μL醋酸镁。
RAA反应条件：混匀上述组分后置于37℃条件下反应20min，取10μL扩增产物加样到试纸条检测端，在室温下放置5min后取出记录判读区的检测结果。
特异性检测的实验结果如图2所示，除了以副溶血性弧菌DNA为模板扩增出明显的目的条带之外，其余十株病原菌均只有质控线出现条带，说明该方法设计的引物无非特异性扩增，与其他病原菌无交叉反应，RAA-LF检测的特异性良好。
实施例4：RAA-LF检测副溶血性弧菌灵敏度
将提取的副溶血性弧菌基因组DNA进行10倍梯度稀释，获得10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL和1fg/μL的基因组DNA溶液。根据RAA核酸扩增试剂盒反应体系进行，以相同体积的无菌去离子水作为阴性对照，在37℃恒温扩增反应20min，扩增产物通过侧流层析试纸条(LF)进行端点检测。同时以梯度稀释的基因组DNA为模板，进行常规PCR扩增，比较本发明建立的RAA-LF技术和PCR技术的检测灵敏度。
RAA扩增体系如下：先将基础缓冲液25μL、50nmol/L的上下游引物1μL、模板DNA 1μL、纯化水19.5μL配制混匀后加入到基础反应单元管，轻轻混匀后在管盖滴加2.5μL醋酸镁。
RAA反应条件：混匀上述组分后置于37℃条件下反应20min，取10μL扩增产物加样到试纸条检测端，在室温下放置5min后取出记录判读区的检测结果。
灵敏度的实验结果如图3所示，常规PCR最低检出限是100fg·μL-1(图3A)，本发明建立的RAA-LF最低检出限为10fg·μL-1(图3B)，说明本发明建立的检测方法灵敏度比常规PCR高十倍数量级。
实施例5：采用RAA-LF方法检测副溶血性弧菌纯培养物
将1.89×108cfu/ml的副溶血性弧菌菌液，用3％氯化钠碱性蛋白胨水(3％APW)进行10倍梯度稀释后，分别移取1mL至1.5mL离心管中，100℃加热煮沸10min后，迅速置于冰上冷却，该裂解液为RAA扩增的模板。
RAA扩增体系如下：先将基础缓冲液25μL、50nmol/L的上下游引物1μL、模板DNA 1μL、无菌去离子水19.5μL配制混匀后加入到基础反应单元管，轻轻混匀后在管盖滴加2.5μL醋酸镁。
RAA反应条件：混匀上述组分后置于37℃条件下反应20min。
纯培养物检测结果如图4所示，该方法检测细菌纯培养物的最低检测限为1.89×103cfu/ml。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应视为包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海海洋大学
<120> 一种重组酶等温扩增技术检测副溶血性弧菌的方法
<141> 2019-10-21
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
tggttgctgt catgaatgta gttcaaaatc 30
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
cgttatttta tttttggcac tattactacc g 31
Claims (8)
1.一种检测副溶血性弧菌的RAA引物，其特征在于，包括靶向toxR基因的上游引物如SEQ ID NO.1所示、下游引物如SEQ ID NO.2所示的引物对序列，或所述引物对序列的互补链序列中单条序列同源性为50％及以上的碱基序列。
2.如权利要求1所述的检测副溶血性弧菌的RAA引物，其特征在于，如SEQ ID NO.1所示的上游引物5’端荧光素修饰，如SEQ ID NO.2所示的下游引物5’端生物素修饰，可得到结合试纸条(LF)端点检测副溶血性弧菌的RAA特异引物对。
3.如权利要求2所述的检测副溶血性弧菌的RAA引物，其特征在于，所述荧光素采用6-FAM，所述生物素采用Biotin。
4.一种检测副溶血性弧菌的RAA方法，其特征在于，包括权利要求1所述RAA引物或权利要求2所述结合试纸条端点检测副溶血性弧菌的RAA特异引物对。
5.如权利要求4所述的RAA试剂盒，其特征在于，包括以冻干粉形式的RAA反应组分、RAA反应缓冲液、无菌去离子水、醋酸镁和侧流层析试纸条。
6.一种检测副溶血性弧菌的RAA方法，其特征在于，包括如下步骤：提取待测样品的DNA，将权利要求4或5所述试剂盒和待测样品基因组DNA配制RAA反应体系，并在37℃恒温扩增反应20min，在试纸条吸收垫位置做好标记，在室温条件下取10μL上述核酸扩增产物滴加到样品垫上，并将试纸条样品垫末端垂直插入含有100μL LF缓冲液的EP管中，5min后取出试纸条进行观察并记录结果；其中：
当阳性样品试纸条的质控线与检测线均出现清晰可见的红色条带时，待测样品中含有待检测的核酸片段，且其数量达到或高于试纸条的最低检出量；
当阴性样品仅有质控线出现清晰可见的红色条带时，样本中不含目的核酸，或其数量低于试纸条的最低检出量。
7.如权利要求6所述检测副溶血性弧菌的RAA方法，其特征在于，所述RAA反应体系以50μL计，为：
。
8.如权利要求6所述检测副溶血性弧菌的RAA方法，其特征在于，副溶血性弧菌纯培养物的最低检测限为1.89×103cfu/mL。
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