CN113736897B - 一种基于双重raa-lfd技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于双重RAA‑LFD技术同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的特异性引物组合、试剂盒和方法，属于食源性致病菌快速检测领域。引物特异性强，能从其他弧菌和其他致病菌中准确的检测出副溶血性弧菌和霍乱弧菌；灵敏度高，基因组灵敏度均达到1fg，纯菌液灵敏度分别为104CFU/mL和103CFU/mL；而且减少了二聚体的影响；在较低的反应温度(37℃)下反应15min，试纸条检测5min便可完成检测，解决副溶血性弧菌和霍乱弧菌检测周期长、仪器设备依赖性高、同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌难度大等问题。对设备要求低，在野外、水产养殖点等现场检测中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术检测领域，具体涉及一种基于双重RAA-LFD技术的同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的改良引物及试剂盒和检测方法。
背景技术
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是水产品中的主要致病菌。副溶血性弧菌广泛存在于鱼类、虾类、贝类等水生动物中，自1950年，Fujino等人首次从沙丁鱼中分离出以来，副溶血性弧菌已被认为是引起全球水产品中毒的重要原因。霍乱弧菌有200多个血清群，O1和O139血清型霍乱弧菌可引起霍乱。霍乱弧菌在条件较差或者发展较落后的地区尤其流行。据估计，全世界每年发生300万至500万病例和10万多例死亡。副溶血性弧菌和霍乱弧菌在水产养殖环境中的存在，会导致虾等水产动物出现反应迟钝、肌肉泛白、食欲减退和鳃部发黄溃烂等症状，死亡率高，给水产养殖业带来经济损失。因此，对副溶血性弧菌和霍乱弧菌进行快速、准确的检测，是有效控制其流行和传播的前提，能够减少水产养殖业的经济损失，保障消费者的健康。
传统培养法是检测弧菌的“金标准”，然而耗时长、工作量大，通常需要一周甚至更长的时间，无法满足快速检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌快速检测的需求。聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)因其检测准确性高、检测速度快等特点被应用于检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌。然而，PCR方法需昂贵的热循环仪器的辅助，这限制了其在野外条件检测和基层实验室中的应用。此外，环介导等温扩增(Loop mediatedisothermal amplification,LAMP)方法具有操作简单和成本效益高的特点，已被开发用于检测水产品养殖环境中的副溶血性弧菌和霍乱弧菌，但LAMP法需要设计4～6对引物，较为复杂。
重组酶等温扩增(Isothermal recombinase aided amplification,RAA)作为一种新型的核酸等温扩增技术，是一种简便、快速、特异、灵敏、经济的鉴定多种病原菌的分子检测方法。目前，基于RAA和侧流层析试纸条(LFD)的方法(RAA-LFD)已成功应用于创伤弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等食源性致病菌的快速检测，实现了野外等偏远地区的现场诊断。然而，目前还没有开发双重RAA-LFD法用于同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌。双重RAA-LFD法对副溶血性弧菌和霍乱弧菌的检测和流行控制等具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术检测方法的不足，建立一种基于双重RAA-LFD技术、能够同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法，以实现在野外等资源有限的环境中快速、特异、准确的检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌。
本发明的技术方案如下：
一种基于双重RAA-LFD技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重特异性引物组合，包括两组引物；第一组引物用于特异性扩增副溶血性弧菌，上游引物序列含有SEQ IDNo.1所示核苷酸序列，下游引物序列含有SEQ ID No.2所示核苷酸序列；
第二组引物用于特异性扩增霍乱弧菌，上游引物序列含有SEQ ID No.3所示核苷酸序列，下游引物序列含有SEQ ID No.4所示核苷酸序列。
优选的，所述的第一组引物用于特异性扩增副溶血性弧菌，上游引物序列如SEQID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2；
第二组引物用于特异性扩增霍乱弧菌，上游引物序列如SEQ ID No.3所示，下游引物序列如SEQ ID No.4所示。
SEQ ID No.1：tccaaaacgaggctatcaactcatttgcact
SEQ ID No.2：tcgctaaagacggctctacgattgtttctacc
SEQ ID No.3：ccattttcacataagatttctacctctggt
SEQ ID No.4：atgagtcgtcaagttttaaatcactcattc
进一步，所述的第一组引物和第二组引物，其中一组的上游引物5’端修饰生物素类化合物，下游引物5’端修饰标记物1；另一组的上游引物5’端修饰标记物2，下游引物5’端修饰生物素类化合物。所述的标记物1和2为地高辛或荧光素类化合物。
在本发明的一个优选方式中，第一组引物的上游引物5’端修饰生物素类化合物，下游引物5’端修饰荧光素类化合物；第二组引物的上游引物5’端修饰地高辛，下游引物5’端修饰生物素类化合物。
所述的生物素类化合物为生物素，所述的荧光素类化合物为6-羧基荧光素(6-FAM)或异硫氰酸荧光素(FITC)，更优选为6-羧基荧光素。
上述双重特异性引物组合可用于同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌。
上述双重特异性引物组合可用于制备同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的试剂盒。
一种基于双重RAA-LFD技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的试剂盒，含有上述双重特异性引物组合。
优选的，所述试剂盒还含有RAA核酸扩增试剂盒和侧流层析试纸条中的至少一种。
所述的RAA核酸扩增试剂盒包括冻干粉、基础缓冲溶液、醋酸镁、纯化水、阴性质控品和阳性质控品。
所述的侧流层析试纸条的上设有T1检测线和T2检测线，分别用于捕获标记物1和标记物2。
一种基于双重RAA-LFD技术同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法，步骤包括：
(1)将上述特异性引物组合与待测样品混合，配制RAA反应体系，并在36-38℃下扩增反应10-30min；
(2)取扩增产物滴加到侧流层析试纸条的样品垫末端，垂直放入缓冲液中，反应5min后读取结果。
步骤(1)中，反应时间优选为15-20min，更优选为15min。
所述的侧流层析试纸条上设有T1检测线和T2检测线，分别用于捕获标记物1和标记物2。
侧流层析试纸条的T1检测线、T2检测线和质控线上分别标记有抗标记物1的抗体、抗标记物2的抗体和生物素类化合物的配体。优选的，侧流层析试纸条的T1检测线上标记有抗荧光素的抗体，T2检测线上标记有抗地高辛的抗体，质控线上标记有生物素的配体。
步骤(1)中，所述的待测样品经过提取总DNA。更优选的，所述的待测样品经过富集并提取总DNA。
结果的判断如下：
(1)当T1检测线、T2检测线和质控线均出现条带时，说明样品中同时含有副溶血性弧菌和霍乱弧菌；
(2)当只有T1检测线和质控线出现条带时，说明样品中含有副溶血性弧菌，不含霍乱弧菌；
(3)当只有T2检测线和质控线出现条带时，说明样品中含有霍乱弧菌，不含副溶血性弧菌；
(4)当只有质控线出现条带，检测线没有条带时，说明结果为阴性，即样品中不含副溶血性弧菌和霍乱弧菌，或副溶血性弧菌和霍乱弧菌的含量低于双重RAA-LFD法的检出限；
(5)当检测线和质控线均没有出现条带，说明检测结果无效。
本发明首先根据副溶血性弧菌特异性基因(toxR基因)和霍乱弧菌特异性基因(Ompw基因)分别设计引物，结果发现，由于引物二聚体的影响，基于上述引物进行双重RAA-LFD检测会出现假阳性的结果。因此，对所获得的引物进行碱基替换，以避免产生二聚体，并且获得特异性强、灵敏度高的引物，能从其他弧菌和其他致病菌中准确的检测出副溶血性弧菌和霍乱弧菌。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的基于双重RAA-LFD技术的双重特异性引物，经过序列改良后，不会出现因产生引物二聚体而出现假阳性结果的现象，特异性强，灵敏度高；
(2)本发明提供的基于双重RAA-LFD技术的试剂盒，可同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌，操作简便；
(3)本发明提供的基于双重RAA-LFD技术的同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的检测方法，表现出良好的特性，能在其他弧菌和致病菌中准确的检测出副溶血性弧菌和霍乱弧菌，特异性达到100％；
(4)灵敏度高，本发明的引物组合、试剂盒及方法，对副溶血性弧菌和霍乱弧菌基因组DNA的检出限均达到1fg，对副溶血性弧菌和霍乱弧菌纯菌液的检出限分别达到104CFU/mL和103CFU/mL；当经过富集后，可以检测到低至100CFU/g的副溶血性弧菌和霍乱弧菌；
(5)本发明提供的基于双重RAA-LFD技术的同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的检测方法，对仪器设备要求低，在较低的反应温度如37℃下孵育15min便能完成扩增，再用试纸条检测5min即可完成检测。同时，其扩增产物通过LFD检测后，结果肉眼可得，结果判定简单，适用于在野外等资源有限的环境中快速检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中，软件设计的引物其中1：toxR-F/R：Ompw-F/R＝1.25μM：2.5μM；NT：阴性对照。
图2为本发明双重RAA-LFD法引物组合筛选结果图，其中1：M-toxR-F/R：Ompw-F/R＝1.25μM：2.5μM；2：toxR-F/R：M-Ompw-F/R＝1.25μM：2.5μM；3：M-toxR-F/R：M-Ompw-F/R＝1.25μM：2.5μM；NT：阴性对照。
图3为实施例3双重RAA-LFD法反应时间优化结果图，其中1-5分别代表反应时间为10min，15min，20min，25min，30min；NT为阴性对照。
图4为本发明双重RAA-LFD法特异性结果图，其中1：霍乱弧菌GIM1.449+副溶血性弧菌ATCC17802；2：副溶血性弧菌ATCC17802；3：副溶血性弧菌SH06；4：霍乱弧菌GIM1.449；5：霍乱弧菌CICC23794；6-13：河流弧菌JS-X-S-4-2，拟态弧菌CM-X-W-2-1，地中海弧菌JS-X-5-2-3，金黄色葡萄球菌ATCC29213，单增李斯特菌ATCC19115，肠炎沙门氏菌SAL4，肺炎克雷伯氏菌BS-X-S-1；铜绿假单胞菌；NT为阴性对照。
图5为本发明双重RAA-LFD法检测灵敏度结果图，其中A为基因组灵敏度结果图；1-7分别代表副溶血性弧菌和霍乱弧菌DNA浓度1ng,100pg,10pg,1pg,100fg,10fg,1fg，NT-阴性对照；B为纯菌液灵敏度结果图；1-8分别代表副溶血性弧菌和霍乱弧菌纯菌液浓度107CFU/ml-100CFU/ml，NT-阴性对照。
图6为本发明双重RAA-LFD法模拟样品结果图，其中A代表富集时间为0h；B代表富集时间为2h；C代表富集时间为4h；D代表富集时间为6h；1-8分别代表副溶血性弧菌和霍乱弧菌污染量107CFU/g～100CFU/g，NT-阴性对照。
具体实施方式
下面将结合具体实施例和附图对本发明申请中的技术方案进行进一步说明和解释。显然，此处所描述的具体实施例仅是本申请的部分实施例，并不是所有的实施例。本领域技术人员可在未进行创作性劳动前提下对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均属于本发明的保护范围。
若未特别指明，实施例中的原料、化学试剂均为常规市售商品，技术手段为本领域技术人员所用的常规手段。
实施例1设计双重RAA-LFD反应引物
从GenBank上下载副溶血性弧菌的特异性基因(toxR基因)和霍乱弧菌的特异性基因(Ompw基因)序列作为引物设计的靶点，用DNAMAN寻找其保守序列，根据RAA引物设计原则用Primer Premier 5设计引物，分别对引物toxR-F和toxR-R的5’端标记生物素(Biotin)和羧基荧光素(6-FAM)，对引物Ompw-F和Ompw-R的5’端标记地高辛(DIG)和生物素(Biotin)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见下表：
进行双重RAA-LFD法检测，发现有假阳性现象出现。
RAA反应按照说明书操作(RAA核酸扩增试剂盒，Jiangsu Qitian)，略有改进。反应体系(50μL)如下：
缓冲液25μL，1.25μM toxR-F 1μL，1.25μM toxR-R 1μL，2.5μM Ompw–F 1μL，2.5μMOmpw–R 1μL，纯化水16.5μL。充分混匀后，分装45.5μL于冻干粉中，待充分溶解冻干粉后将液体转移到1.5mL的离心管中，然后分别加入副溶血性弧菌和霍乱弧菌的总DNA模板1μL，最后在每个离心管盖上滴加2.5μL醋酸镁溶液，轻微振荡并离心。将反应管放入水浴锅中37℃反应15min后取10μL的扩增产物滴加于侧流层析试纸条的样品垫上，将侧流层析试纸条的样品垫末端垂直放入加有100μL缓冲液的离心管中，反应5min后读取结果。
如图1，试纸条从下到上依次为T1检测线(副溶血弧菌)、T2检测线(霍乱弧菌)和质控线(C)。使用引物(toxR-F/R和Ompw-F/R)扩增后，阴性对照的两条T线上出现条带(假阳性结果)，尤其是T2。
推测3’端形成引物二聚体会影响检测结果，出现假阳性。当引物toxR-F与引物toxR-R，引物toxR-R与引物Ompw-R形成引物二聚体(携带Biotin和6-FAM)时，会在试纸条T1检测线处出现条带，影响结果的判定；同样地，当引物Ompw-F与引物Ompw-R，引物toxR-F与引物Ompw-F形成引物二聚体(携带Biotin和DIG)时，会在试纸条T2检测线处出现条带，影响结果的判定。因此，为减少RAA扩增体系中引物二聚体的干扰，对引物toxR-F/R与引物Ompw-F/R进行改良。
分析引物toxR-F与引物toxR-R、toxR-R与引物Ompw-R、引物Ompw-F与引物Ompw-R、引物toxR-F与引物Ompw-F形成的3’端引物二聚体，并根据分析结果进行引物碱基的替换，以减少引物二聚体产生的可能性。
分别对引物toxR-F和引物Ompw-R进行了改良。即将引物toxR-F中的第28个碱基“t”替换成“c”，将引物Ompw-R中的第28个碱基“a”替换成“t”。分别对引物toxR-F和引物Ompw-R中的一个碱基进行替换后，减少了3’端引物二聚体的产生。改良后的引物序列见下表：
实施例2双重RAA-LFD反应引物组合的筛选
为验证改良后引物的扩增效率，将未改良的引物与改良后的引物两两组合，进行双重RAA-LFD法检测，筛选出最佳的引物组合。组合分别为：toxR-F/R和Ompw-F/R，M-toxR-F/R和Ompw-F/R，toxR-F/R和M-Ompw-F/R，M-toxR-F/R和M-Ompw-F/R。
RAA反应按照说明书操作同实施例1。
其结果如图2所示，使用改良后的引物(toxR-F/R和M-Ompw-F/R，M-toxR-F/R和M-Ompw-F/R)扩增后，试纸条上均显示出正确的阳性信号(阴性对照扩增正常且未影响阳性扩增结果)。但使用引物M-toxR-F/R和M-Ompw-F/R扩增后两条T线上的亮度差别较大。因此，选用引物toxR-F/R和M-Ompw-F/R进行后续实验。
由此可见，将引物toxR-F中的第28个碱基“t”替换成“c”，将引物Ompw-R中的第28个碱基“a”替换成“t”后减少了产生3’端引物二聚体的可能性。
实施例3双重RAA-LFD反应时间的优化
体系的配制同实施例2，对RAA的扩增时间进行了优化。
将反应管在37℃下分别孵育10min、15min、20min、25min、30min后取10μL的扩增产物进行试纸条检测。其结果如图3所示，试纸条两条检测线上的亮度随反应时间的增加而变化。随着反应时间的增加，T1检测线上的条带亮度逐渐增加，当反应时间为10min时，T1检测线上没有出现条带，当反应时间为20min时T1检测线上的条带亮度达到稳定。与此相反的是，T2检测线上的条带亮度随着反应时间的增加而递减，反应时间越长，条带上的亮度越暗。由于反应15min后，T1和T2检测线上条带的亮度相当，因此，双重RAA-LFD法的最佳反应时间为15min。
实施例4双重RAA-LFD法特异性评价
在最佳的反应条件下，对两株霍乱弧菌、两株副溶血性弧菌和8株其他食源性致病菌(见下表)进行双重RAA-LFD法检测，以评价双重RAA-LFD法的特异性。
双重RAA-LFD特异性评价结果如图4所示，只有副溶血性弧菌和霍乱弧菌产生阳性条带，而其他8株病原菌均只出现质控线，说明该方法可同时用于检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌，且与其他病原菌无交叉反应，特异性良好。
实施例5双重RAA-LFD灵敏度评价
(1)基因组灵敏度评价
对霍乱弧菌和副溶血性弧菌基因组DNA进行十倍系列稀释，各取1μL DNA在最佳RAA反应条件下进行双重RAA-LFD法检测，以确定其检出限。
双重RAA-LFD法的基因组灵敏度如图5-A所示，随着DNA浓度的递减，T1检测线上的条带亮度逐渐递减，而T2检测线上的条带亮度却呈现出先递增再递减的趋势，这可能是由于在双重RAA反应体系中两种引物存在反应原料竞争。尽管如此，当DNA浓度低至1fg时两条检测线上均能看到条带，因此双重RAA-LFD法检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的基因组检出限均为1fg。
(2)纯菌液灵敏度评价
用生理盐水对霍乱弧菌和副溶血性弧菌纯菌液进行十倍系列稀释，得到107CFU/mL-100CFU/mL的纯菌液，取1mL不同浓度的纯菌液于1.5mL离心管中，用煮沸法提取DNA。将提取得到的DNA用于双重RAA-LFD检测。
双重RAA-LFD法的纯菌液灵敏度如图5-B所示，随着菌液浓度的递减，T1检测线上的条带亮度逐渐递减，当副溶血性弧菌纯菌液浓度为104CFU/mL时，T1检测线上可观察到条带，因此，双重RAA-LFD法检测副溶血性弧菌纯菌液的检出限为104CFU/mL；随着菌液浓度的递减，T2检测线上的条带亮度呈现出先递增再递减的趋势，当霍乱弧菌纯菌液浓度递减至102CFU/mL时，T2检测线上没有可见的条带，因此，双重RAA-LFD法检测霍乱弧菌纯菌液的检出限为103CFU/mL。
实施例5模拟样品检测
将霍乱弧菌GIM1.449和副溶血性弧菌ATCC17802划线于TCBS平板中，在37℃培养过夜后接种于5mL的含3％氯化钠的碱性蛋白胨水中，然后在37℃下培养6h。
称取5g虾肉于无菌的培养皿中，向虾表面滴加100μL的副溶血性弧菌和200μL霍乱弧菌，以实现100CFU/g～107CFU/g的污染量。将污染了不同浓度副溶血性弧菌和霍乱弧菌的虾肉移入装有45mL的2％APW的无菌均质袋中，用拍打器拍打2min后，取5mL于试管中，在37℃/200rpm下分别富集0、2、4、6h后取1mL滤液煮沸法提取DNA。将得到的DNA进行双重RAA-LFD法检测。
模拟样品检测结果如图6所示。未富集时，双重RAA-LFD法可检测到虾肉中污染了105CFU/g的副溶血性弧菌和霍乱弧菌；富集2h后，双重RAA-LFD法可检测到虾肉中污染了102CFU/g的副溶血性弧菌和霍乱弧菌；虾肉中污染了低至100CFU/g的副溶血性弧菌富集4h后可被双重RAA-LFD法检测到，而含有100CFU/g霍乱弧菌的虾肉富集6h后能被双重RAA-LFD法检测到。
以上实施例说明本发明基于双重RAA-LFD技术同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的扩增引物特异性强，灵敏度高；对扩增引物的碱基修改后减少了引物二聚体对实验的干扰，且并没有影响到RAA的扩增特异性；该法在体温(37℃)下反应15min，试纸条检测5min便可实现对副溶血性弧菌和霍乱弧菌的同时检测，检测速度快，对设备要求低，在野外等现场检测中具有良好的应用前景。
序列表
<120> 一种基于双重RAA-LFD技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的引物组、试剂盒及方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccaaaacga ggctatcaac tcatttgcac t 31
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgctaaaga cggctctacg attgtttcta cc 32
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccattttcac ataagatttc tacctctggt 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgagtcgtc aagttttaaa tcactcattc 30
Claims (5)
1.一种基于双重RAA-LFD技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的特异性引物组合，其特征在于，包括两组引物；第一组引物用于特异性扩增副溶血性弧菌，上游引物序列如SEQ IDNo.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；
第二组引物用于特异性扩增霍乱弧菌，上游引物序列如SEQ ID No.3所示，下游引物序列如SEQ ID No.4所示；第一组引物的上游引物5’端修饰生物素，下游引物5’端修饰6-羧基荧光素；第二组引物的上游引物5’端修饰地高辛，下游引物5’端修饰生物素。
2.权利要求1所述的特异性引物组合用于制备同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的试剂盒，或者用于非诊断目的同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌。
3.一种基于双重RAA-LFD技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述双重特异性引物组合，还含有RAA核酸扩增试剂盒和侧流层析试纸条。
4.一种基于双重RAA-LFD技术非诊断目的检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法，其特征在于，步骤包括：
(1)将权利要求1所述的双重特异性引物组合与待测样品混合，配制RAA反应体系，并在36-38℃下扩增反应10-30min；
(2)取扩增产物滴加到侧流层析试纸条的样品垫末端，垂直放入缓冲液中，反应5min后读取结果；所述的侧流层析试纸条上设有T1检测线和T2检测线，分别用于捕获6-羧基荧光素和地辛高。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，反应时间为15-20min。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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