CN106093023A - 一种检测汞离子的比色传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测汞离子的比色传感器。采用如下步骤制备而成：探针的杂交，信号放大和比色检测，本发明制备的传感器实现了对目标物汞离子的高特异性检测；利用核酸工具酶，起到了信号放大的作用。
Description
技术领域
本发明涉及传感器技术领域，特别涉及一种检测汞离子的比色传感器。
背景技术
汞是银白色闪亮的重质液体，化学性质稳定，不溶于酸也不溶于碱。汞常温下即可蒸发，汞蒸气和汞的化合物多有剧毒（慢性）。汞是自然生成的元素，见于空气、水和土壤中。汞是一种剧毒非必需元素，广泛存在于各类环境介质和食物链（尤其是鱼类）中，其踪迹遍布全球各个角落。汞可以在生物体内积累，很容易被皮肤以及呼吸道和消化道吸收。水俣病是汞中毒的一种。汞破坏中枢神经系统，对口、粘膜和牙齿有不良影响。长时间暴露在高汞环境中可以导致脑损伤和死亡。尽管汞沸点很高，但在室内温度下饱和的汞蒸气已经达到了中毒剂量的数倍。因而对食品、药品及饮用水中金属汞进行检测是十分必要的。
检测汞的传统方法主要有三种，分别是原子荧光光谱分析法、冷原子吸收光谱法和二硫腙比色法，这些方法有仪器操作复杂，需要专业操作人员等缺点。
发明内容
本发明针对现有检测方法中仪器操作复杂，需要专业操作人员的缺点，提供了一种检测汞的比色传感器。
本发明是通过以下步骤得到的：
本发明中一共用到了2条probe链，其序列分别是：
Probe 1：5’-TCTTGCTT TAGTA-3’（SEQ ID NO：1）；
Probe2：5’-AACCCAACCCGCCCTACCCCCTCAGCTTGGGTTATCGTACTA TTGCTTGA -3’ （SEQ IDNO：2）；
其中Probe 1的斜体部分是Hg的识别，下划线部分标注的是5个无汞的不稳定碱基。Probe 2中5’端为血红素适配体的互补列，中间下划线部分为切割位点，黑色斜体标注的部分与5’端互补成发卡，斜体下划线部分为汞的识别。
本发明中用到了两种酶：phi29 DNA聚合酶和Nb.BbvCI内切酶。phi29 DNA聚合酶在引物与模板的作用下，沿着模板链从5’端向3’端生长，聚合出与模板链碱基完全互补的系列。Nb.BbvCI内切酶可以在特异性位点实现对DNA双链的特异性切割，其特异性的切割识别序列是：CCTCAGC，切割位点是最后两个碱基之间。
本发明中汞的检测是在均相溶液中实现的，通过循环的方式来实现信号的放大，从而实现汞的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。
均相中发生的反应主要有：HAP (即Probe2)由三部分组成：血红素aptamer，内切酶Nb.BbvCI 的识别序列和引物（primer）的互补序列。当有汞存在时，由于血红素aptamer与目标物之间的特异性识别与结合，可以将发卡打开，使HAP上内切酶Nb.BbvCI的识别序列和引物（primer）的互补序列以单链的形式暴露在外面。随后均相中的primer可以通过碱基互补配对与打开的HAP杂交成一定的双链。在phi29DNA聚合酶的作用下，primer以打开的HAP为模板生长成完全互补的杂交双链，并释放出目标物汞离子，游离出来的汞离子可以继续打开别的发卡，然后重复上述过程。此为第一步循环放大（目标物诱导的循环放大）。
第二步放大仍是在均相中产生的，上述循环放大的结果是产生大量的血红素aptamer。在有大量血红素aptamer的情况下加入血红素，在血红素存在的条件下，血红素绑定住血红素aptamer，然后将均相反应后的产物滴加ABTS及双氧水。产生明显的颜色变化。其具体原理如图1。
在均相反应中，反应条件为37℃，反应时间是2h。
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）对DNA探针进行杂交；
（2）对检测的特异性序列进行信号的放大；
（3）对序列进行比色检测；
所述的制备方法，步骤（1）具体操作步骤如下：将2μLProbe 1与2μLProbe 2的混合液，在37℃下孵育0.5h。
所述的制备方法，步骤（2）具体操作步骤为将（1）中孵育好的混合溶液取出，在这混合溶液中加入dNTPs,phi29DNA聚合酶与Nb.BbvCI内切酶，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；
所述的制备方法，对酶添加在低温下进行，确保酶的活性。
该发明的检测方式是比色检测，利用紫外光谱仪进行检测。在检测之前，将步骤（2）中产生的大量的血红素aptamer与血红素混合，然后在37℃孵育1h使其产生信号。最后加入ABTS和双氧水使信号进行显色，用紫外光谱仪来检测待测目标物。
本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，具有链置换功能的phi29DNA聚合酶，核酸内切酶在特异性位点对核酸链的切割作用，链置换等温放大以及底物显色剂。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补汞现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的检测。
本发明的有益效果：
1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用血红素的aptamer作为识别物质实现了对目标物汞的高特异性检测；
2、利用具有链置换功能的phi29 DNA聚合酶，实现了目标物的循环利用，放大了检测信号，提高了检测的灵敏度；
3、利用核限制性核酸内切酶对特异性序列的识别和切割作用，结合聚合酶，生成了大量可作为二级目标物的血红素aptamer，实现了第二步循环放大，进一步提高了检测的灵敏度；
4、 该传感器的反应条件温和，反应速度快；
5、 检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；
6、制备方法简单，性能稳定，重复性好，适用于食品，水中汞的检测和生物传感器产业化的实际应用；
7、制作的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
附图说明
图1为本发明的原理图；
图2为汞离子特异性优化检测结果图；
图3为 酶特异性检测结果图；
图4为灵敏度检测的工作曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）对DNA探针进行杂交；；
（2）对检测的特异性序列进行信号的放大；
（3）对序列进行比色检测。
所述的制备方法，步骤（1）的具体的操作步骤如下：将2μLProbe 1与2μLProbe 2的混合液，在37℃下孵育0.5h。
所述的制备方法，优选将均相反应产物修饰到电极表面的操作步骤如下：
将（1）中孵育好的混合溶液取出，在这混合溶液中加入dNTPs,phi29DNA聚合酶与Nb.BbvCI内切酶，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；
所述的制备方法，对酶添加在低温下进行，确保酶的活性。
在检测之前，将步骤（2）中产生的大量的血红素aptamer与血红素混合，然后在37℃孵育1h使其产生信号。最后加入ABTS和双氧水使信号进行显色，用紫外光谱仪来检测待测目标物。
本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，具有链置换功能的phi29DNA聚合酶，核酸内切酶在特异性位点对核酸链的切割作用，链置换等温放大以及底物显色剂。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补汞现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的检测。具体原理图如图1所示。
特异性优化实验：
链循环的主要步骤如下：
a、在加入目标物的离心管中加入2μL的DNTP，2μLPhi29DNA聚合酶，2μLNb.BbvCI内切酶；
b、振荡均匀后，在37℃孵育1h。
下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：
c、将灭菌水，10×的buffer缓冲液、probe2（2μL）, probe1(2μL)，phi29 DNA聚合酶（2μL），dNTPs（2 μL），Nb.BBvcI 内切酶（2 μL）和待测目标物hg2+及Cr3+,Cd2+,Fe2+,Ca2+,Cu2+,Pb2+,Ag+,Zn2+,Mg2+,加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h。
d、将水浴好的混合溶液加入phi29 DNA聚合酶与Nb.BBvcI 内切酶及dNTPs；
e、将（d）中的混合溶液继续放在37℃的恒温箱中孵育1h。
d、用ABTS及紫外光谱仪进行检测
加入汞离子的样品中吸光度的峰值最大，加入其他离子的样品中吸光度的峰值与空白相差无几。以此检测目标物具有特异性。
结果见图2。
酶特异性选择实验
a、在离心管中加入2μL的PHI29的buffer（buffer为购买PHI29DNA聚合酶的配套缓冲液）；
b、将8μL的灭菌水和目标物加入离心管中，并振荡均匀；
c、在加入目标物的离心管中加入2μL的DNTP，2μLPhi29DNA聚合酶，2μLNb.BbvCI内切酶和1μL血红素；
d、其它的管中，加入2μL的DNTP，2μLPhi29DNA聚合酶：2μL的DNTP，2μLNb.BbvCI内切酶；2μL的DNTP，1μL的血红素；
全部在室温下孵育一小时，根据图3可以看出，2μLPhi29DNA聚合酶，2μLNb.BbvCI内切酶和1μL血红素在实验中扮演了重要的作用，缺一不可。证明只有在核酸工具酶的作用下，汞离子才能产生血红素的适配体，从而能和血红素发生反应，得以对汞离子进行特异性的检测。
灵敏度实验
1）在8个离心管中加入2μL的probe1和probe2，及2μLPHI29的buffer（buffer为购买PHI29DNA聚合酶的配套缓冲液）和8μL的灭菌水，1号到7号分别依次加入10-5M，10-6M，10-7M，10-8M，10-9M，10-10M，10-11M浓度的汞离子溶液2μL，0号加入2μL的灭菌水，在37度水浴箱中反应1小时；
2）在0到7号的离心管中加入终浓度为2*10-8M的DNTP，20units的Phi29DNA聚合酶，20units Nb.BbvCI内切酶，在37度水浴箱中反应一小时：
3）在0到7号的离心管中加入终浓度为10-9mol的血红素，37度反应一小时；
4）最后加入ABTS为6*10-7 mol，双氧水3%浓度的双氧水3μL，即可通过紫外光谱仪进行检测。
结果如图4所示，通过图4可知，当汞离子的浓度到10-11M/L时，峰值和空白相差不大，当汞离子的浓度到10-5 M/L时，峰值和10-6M/L相差不大，所以汞离子的检测范围是在10-5 M/L到10-11M/L之间。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>济南大学
<120>一种检测汞离子的比色传感器及其制备方法
<160>2
<210>1
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<212>DNA
<213>人工序列
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<222>(1)..(13)
<223>引物
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<212>DNA
<213>人工序列
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<221>misc_feature
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<223>引物
<400>2
AAC CCA ACC CGC CCT ACC CCC TCA GCT TGG 30
GTT ATC GTA CTA TTG CTT G 49
Claims (4)
1.一种检测汞离子的比色传感器，其特征在于，其制备包括以下步骤：
（1）对探针进行杂交；
（2）信号的放大；
（3）比色检测。
2.根据权利要求1所述的检测汞离子的比色传感器，其特征在于，步骤（1）的具体工艺为：将2μLProbe 1与2μLProbe 2的混合液，在37℃下孵育0.5h。
3.根据权利要求1所述的检测汞离子的比色传感器，其特征在于，步骤（2）的具体工艺为：将步骤（1）制备孵育液加入dNTPs，phi29DNA聚合酶与Nb.BbvCI内切酶，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h。
4.根据权利要求1所述的检测汞离子的比色传感器，其特征在于，步骤（3）为将（2）中的混合溶液与血红素一同混合，并继续放在37℃的恒温箱中孵育1h，采用紫外光谱仪进行比色检测。
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