CN109490260A

CN109490260A - 一种低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器及其在铅离子检测中的应用

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Publication number: CN109490260A
Application number: CN201811123343.1A
Authority: CN
Inventors: 邓锐杰; 赵志峰; 杨淏; 何强; 夏许寒
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2018-09-26
Publication date: 2019-03-19
Anticipated expiration: 2038-09-26
Also published as: CN109490260B

Abstract

本发明提供了一种低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器，包括分子识别元件和信号转换元件，分子识别元件为铅离子依赖型脱氧核酶，铅离子脱氧核酶由脱氧核酶底物链和脱氧核酶酶链组成，脱氧核酶底物链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，脱氧核酶酶链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示；信号转换元件由5’端被荧光染色基团标记的Sub F和3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q组成，Sub F与Sub Q的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。本发明还提供了一种该荧光传感器在铅离子检测中的应用。本发明提供的荧光传感器可提高现有生物传感器法检测铅离子的灵敏度和对检测环境的耐受性。

Description

一种低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器及其在铅离子检测中的应用

技术领域

本发明属于金属离子检测技术领域，涉及基于功能核酸的荧光传感器及其在铅离子检测中的应用。

背景技术

铅是一种蓄积性的有毒重金属元素，也是人类最早使用的金属之一，在地壳中以稳定的硫化铅(即方铅矿)的形式存在，含量占0.0016％。铅是银白色的金属，十分柔软，易氧化，故经常呈灰色，其化学性质比较稳定，不易被腐蚀，具有良好的延展性等加工特性，因此铅多应用于建筑、铅蓄电池、弹头、焊接物料、渔业用具以及防辐射材料等行业。

我国铅超标问题比较严重，大多来自工业污染，存在食品中铅含量普遍偏高的现象，已逐渐成为食品安全的热点问题。食品中铅的来源主要有以下几个方面：(1)食品制作过程中出现的铅污染，如爆米花在加工过程中在铁罐制作机中造成的铅污染；(2)产品包装和盛放过程造成的铅污染，如用铝合金、陶瓷等材料制备的容器均含铅，在接触食品时会造成污染，特别是酸性食品更容易使容器中的铅离子逸出；(3)环境中的铅也会对食品造成污染，主要来自两方面：①铅矿的开采、冶炼及铅制品制造业产生的“三废”排入环境造成污染；②汽车尾气是日常生活中最为明显的铅污染源；(4)农业上施用的农药和化肥是造成食品污染的另一渠道，长期使用含铅的农药、化肥，将导致土壤中铅的积累。

人体多通过摄取食物、空气、饮用水等方式把铅摄入体内，进入人体的铅90％储存在骨骼，10％随血液循环而分布于全身各组织和器官，影响血红细胞和脑、肾、神经系统功能。铅在大脑中蓄积后的影响尤为严重，在大脑发育的早期(如胚胎期)，可导致大脑发育迟缓、不健全，最终影响智力，铅对胎儿和幼儿生长发育影响最大，是一种强烈的亲神经毒物，婴幼儿吸收铅后，有超过30％保留在体内，儿童血液中铅含量超过0.6μg/mL时，就会出现智能发育障碍和行为异常，铅还可增加先天性缺陷婴儿的发生机率。

目前，重金属铅被列为全球环境监测计划(Global Environmental MonitoringSystem， GEMS)中的食品污染物监测必测项目。对饮用水中Pb²⁺浓度，各国及各环保组织都做出了相关规定，我国的标准是不超过48nM，美国环境保护署规定的最大浓度是72nM。我国食品重金属残留限量国家标准规定铅含量最高上限，例如，鲜乳为0.05μg/mL，蛋类为0.2 μg/mL，肉类为0.5μg/mL。

目前，铅离子的检测方法主要有物理化学方法和生物传感器法，物理化学方法主要有原子吸收光谱(AAS)、电感耦合等离子体发射光谱(ICP-AES)、阳极溶出伏安法(ASV)、X 射线荧光光谱法等，这些方法操作要求高、仪器昂贵、对铅离子的检出限较高，只能实现定性或半定量检测，不能满足较低浓度铅离子的检测需求。现有的生物传感器法是通过生物分子与铅离子之间的特异性结合，定性、定量检测铅离子的方法，具有操作简单、特异性强、检测快速等优点，但还亟需解决其易受检测环境影响及检出限偏高等问题。例如，现有的基于铅离子依赖型脱氧核酶荧光传感器仍然存在高背景、低灵敏度以及易受检测温度影响等缺陷，还不足以实现在临场环境中的可靠检测及对环境中低浓度铅离子的有效检测。因此，迫切需要开发操作简便、特异性强、成本低廉、耐受检测环境影响以及灵敏度更高的现场快速检测铅离子的检测方法，以实现环境中铅污染的实时监测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器，以及该荧光传感器在铅离子检测中的应用，以提高现有生物传感器法检测铅离子的灵敏度和对检测环境的耐受性。

本发明提供的低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器，包括分子识别元件和信号转换元件，所述分子识别元件为铅离子依赖型脱氧核酶，铅离子脱氧核酶由脱氧核酶底物链和脱氧核酶酶链组成，所述脱氧核酶底物链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，所述脱氧核酶酶链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ IDNo.4所示；

所述信号转换元件由5’端被荧光染色基团标记的Sub F和荧光猝灭基团3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q组成，Sub F的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示，Sub Q的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示；

所述脱氧核酶底物链与脱氧核酶酶链通过碱基互补配对结合形成铅离子脱氧核酶，铅离子能特异性识别铅离子脱氧核酶并激活脱氧核酶酶链的活性，被激活的脱氧核酶酶链将脱氧核酶底物链切割成核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.7和序列表中SEQ IDNo.8所示的两个切割产物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.7所示的切割产物与5’端被荧光染色基团标记的Sub F结合后产生荧光信号，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.8所示的切割产物与荧光猝灭基团3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q结合后终止切割反应；同时，未被切割的脱氧核酶底物链会与5’端被荧光染色基团标记的Sub F和3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q 临近杂交，并使荧光染色基团与荧光猝灭基团靠近，进而使5’端被荧光染色基团标记的Sub F的荧光被淬灭。

本发明还提供了一种上述低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器在铅离子检测中的应用。

应用上述低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器进行铅离子检测的步骤如下：

(1)制备铅离子依赖型脱氧核酶溶液

将脱氧核酶底物链和脱氧核酶酶链溶解于缓冲液中，在70～85℃孵育3～5min，自然降温至室温，在室温放置至少25min，得到铅离子依赖型脱氧核酶溶液；

(2)绘制标准曲线

①取步骤(1)制备的铅离子依赖型脱氧核酶溶液，向其中加入浓度已知的铅离子标准溶液，在室温放置60～90min进行切割反应，然后加入5’端被荧光染色基团标记的SubF和3’ 端被荧光猝灭基团标记的Sub Q，混匀后在30～40℃孵育25～40min以终止切割反应，得到反应混合液，测定反应混合液的荧光强度，记录该铅离子标准溶液对应的荧光强度峰值；

②使用一系列浓度已知的铅离子标准溶液代替步骤①中的铅离子标准溶液，重复步骤① 的操作，得到一系列铅离子标准溶液的荧光强度峰值，以铅离子标准溶液的铅离子浓度为横坐标，以铅离子标准溶液的荧光强度峰值为纵坐标绘制标准曲线；

(3)待测样品检测

将步骤(2)①中的铅离子标准溶液替换为待测样品，重复步骤(2)①的操作得到待测样品的荧光强度峰值，将待测样品的荧光强度峰值代入标准曲线的回归方程中，计算出待测样品中铅离子的浓度。

应用上述低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器进行铅离子检测时，步骤(2)①、② 和步骤(3)中的反应温度和反应时间应完全一致。

应用上述低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器进行铅离子检测时，步骤(1)中优选按照脱氧核酶酶链与脱氧核酶底物链的摩尔比为1:(1～8)的比例将脱氧核酶酶链和脱氧核酶底物链溶解于缓冲液中。

应用上述低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器进行铅离子检测时，步骤(2)①中优选按照5’端被荧光染色基团标记的Sub F与脱氧核酶底物链的摩尔比为1:(1～2.5)，5’端被荧光染色基团标记的Sub F与3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q的摩尔比为1:(1～6)的比例加入5’端被荧光染色基团标记的Sub F与3’端被荧光猝灭基团标记的SubQ。

应用上述低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器进行铅离子检测时，步骤(1)中的缓冲液是将4-羟乙基哌嗪乙磺酸、NaCl、MgCl₂溶解于超纯水中并调节pH值至7～8得到，4- 羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为40～60mmol/L，NaCl的浓度为40～60mmol/L，MgCl₂的浓度为 3～6mmol/L。

应用上述低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器进行铅离子检测，步骤(2)①中测定荧光强度时，采用的激发波长与发射波长根据所述荧光染色基团的激发波长与发射波长进行确定。

本发明通过实验证实，应用本发明提供的低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器进行铅离子检测，具有极高的检测灵敏度；另外，在室温环境，例如实施例测试的20～41℃范围内，随着检测温度的变化，其背景没有发生显著变化，并且保持在非常低的水平，具有非常高的温度稳定性，这非常有利于在现场实现快速准确的检测；同时，采用该荧光传感器进行铅离子检测，不会受到其他离子的干扰，对铅离子具有高度特异选择性。

应用本发明所述低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器进行铅离子检测的原理如下：

如图1所示，铅离子依赖型脱氧核酶由脱氧核酶底物链与脱氧核酶酶链两条寡核苷酸链组成，通过碱基互补配对结合形成特定的二级结构，其脱氧核酶底物链中含有一个腺嘌呤核糖核苷酸，铅离子能够特异性识别铅离子依赖型脱氧核酶，并激活脱氧核酶酶链的活性，在腺嘌呤核糖核苷酸处切割脱氧核酶的底物链，生成两个切割产物。然后引入能够特异性结合切割产物的两个单链DNA探针，其中一个单链DNA探针被荧光染色基团标记(即5’端被荧光染色基团标记的Sub F)，另一个单链DNA探针被荧光猝灭基团标记(即3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q)，两个被标记的单链DNA探针分别与两个切割产物结合生成新的二级结构，与荧光染色基团标记的单链DNA探针结合后产生荧光信号，与荧光猝灭基团标记的单链DNA探针结合后终止切割反应，铅离子的浓度与产生的荧光信号的强度呈正相关关系，因此，通过对荧光信号的检测可以实现对铅离子的定量分析。同时，未被切割的脱氧核酶底物链会与荧光染色基团标记的单链DNA探针和荧光猝灭基团标记的单链DNA探针临近杂交，并使荧光染色基团与荧光猝灭基团靠近，荧光染色基团与荧光猝灭基团相互作用，进而使5’端被荧光染色基团标记的Sub F的荧光被有效淬灭。这种临近杂交的设计能保证本发明提供的荧光传感器输出超低的荧光背景，且该临近杂交反应不受脱氧核酶酶链切割脱氧核酶底物链这步反应的条件影响，所以该传感器能够保证在不同酶切条件下具有稳定的超低背景。

与现有技术相比，本发明的技术方案产生了以下有益的技术效果：

1.本发明提供了一种低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器，包括分子识别元件和信号转换元件，所述分子识别元件为铅离子依赖型脱氧核酶，铅离子脱氧核酶由脱氧核酶底物链和脱氧核酶酶链组成，所述信号转换元件由5’端被荧光染色基团标记的Sub F和3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q组成，也就是信号转换元件由荧光染色基团标记的单链DNA探针和荧光猝灭基团标记的单链DNA探针组成，所述脱氧核酶底物链与脱氧核酶酶链通过碱基互补配对结合形成铅离子脱氧核酶，铅离子能特异性识别铅离子脱氧核酶并激活脱氧核酶酶链的活性，被激活的脱氧核酶酶链将脱氧核酶底物链切割成两个切割产物，一切割产物与荧光染色基团标记的单链DNA探针结合后产生荧光信号，另一切割产物与和荧光猝灭基团标记的单链DNA探针结合后终止切割反应，基于此，在铅离子存在的条件下，通过对荧光信号的检测即可实现对铅离子的定量分析。同时，未被切割的脱氧核酶底物链会与上述两个荧光染色基团及荧光猝灭基团标记的单链DNA探针临近杂交，并使荧光染色基团与荧光猝灭基团靠近，荧光染色基团与荧光猝灭基团相互作用，进而使5’端被荧光染色基团标记的 Sub F的荧光被有效地淬灭。在保证杂交稳定性的情况下(增加Sub F和Sub Q与核酸底物链的杂交长度)，5’端被荧光染色基团标记的Sub F和3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q与脱氧核酶底物链的互补结合具有非常强的温度稳定性，并且能够达到非常有效的荧光猝灭效果，从而使得本发明提供的荧光传感器具有超低的背景以及极强的温度稳定特性。

2.本法还提供了一种上述低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器在铅离子检测中的应用，应用本发明提供的荧光传感器进行铅离子检测，通过手持荧光光谱检测仪便可实现铅离子的快速定量检测，具有操作简单、特异性强、灵敏度高、成本低廉等优点，可以实现对铅离子的高效检测。

3.本发明提供的荧光传感器并未在脱氧核酶的底物链和酶链上进行荧光基团或猝灭基团的标记，而是另外选用经过标记的两个单链DNA探针进行荧光染色，这样极大的降低了背景荧光，显著提高了传感器的检测灵敏度。

4.本发明提供的荧光传感器可自行终止铅离子切割反应，不需要单独设置步骤来终止切割反应的进行，具有简化铅离子检测操作的特点。

5.本发明提供的荧光传感器对温度具有极高的稳定性，随着温度的变化，其灵敏度不会受到明显影响。

6.本发明提供的荧光传感器对铅离子具有极高的选择特异性，能够抵抗检测环境中高盐浓度的干扰，实现对铅离子的定性与定量分析。

附图说明

图1是采用本发明提供的荧光传感器检测Pb²⁺的原理示意图。

图2是实施例2绘制的标准曲线。

图3是实施例3、4中检测自来水和蛋液中Pb²⁺的结果。

图4是实施例5中荧光传感器对测试温度的稳定性的测试结果。

图5是实施例6中对低浓度其他金属离子的选择性测试结果。

图6是实施例6中对高浓度其他金属离子的选择性测试结果。

图7是实施例6中高浓度多种金属离子的混合干扰Pb²⁺检测的测试结果。

图8是对比例1(图A)和对比例2(图B)中检测Pb²⁺的原理示意图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明提供的低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器及其在铅离子检测中的应用作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于本发明保护的范围。

以下各实施例中，所使用的实验方法和条件，如无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的常规方法和条件，采用的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，氯化钠，氯化镁，乙酸铅等试剂均为市售商品。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

以下实施例中涉及到的脱氧核酶底物链、脱氧核酶酶链、Sub F以及Sub Q的核苷酸序列如表1所示，表1中的各核苷酸序列委托专业合成公司——生工生物工程(上海)股份有限公司合成，以下各实施例中采用的5’端被荧光染色基团标记的Sub F、3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q、5’端被荧光染色基团标记的脱氧核酶底物链、3’端被荧光猝灭基团标记的脱氧核酶酶链、5’端和3’端分别被荧光染色基团与荧光猝灭基团标记的脱氧核酶底物链均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所采用的荧光染色基团由Alexaflour 488提供， Alexa flour 488为美国分子探针公司开发的荧光染料，所采用荧光猝灭基团为BHQ1，BHQ1 是Biosearch Technologies公司开发的荧光淬灭基团。以下实施例中涉及到的脱氧核酶酶链均为核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的脱氧核酶酶链。

表1

注：rA表示腺嘌呤核糖核苷酸；脱氧核酶酶链切割脱氧核酶底物链得到的两切割产物分别与Sub F和Sub Q完全互补配对；铅离子切割位点在脱氧核酶底物链的rA之后。

实施例1

本实施例中，制备铅离子依赖型脱氧核酶溶液，步骤如下：

将3μL浓度为2μM的脱氧核酶底物链母液和6μL浓度为0.5μM的脱氧核酶酶链母液加入到2μL缓冲液(500mM HEPES,500mM NaCl,50mM MgCl₂,pH＝7.26)中，再用超纯水稀释至18μL，摇匀，在80℃下加热3min，然后缓慢降温至室温，整个降温过程持续40min，再在室温放置25min，得到铅离子依赖型脱氧核酶溶液。所述脱氧核酶底物链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，脱氧核酶酶链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

重复前述操作，制备得到若干份铅离子依赖型脱氧核酶溶液，每份18μL。

实施例2

本实施例中，绘制标准溶液曲线，步骤如下：

(1)配制铅离子标准溶液

配制Pb²⁺浓度分别为0、0.8、4、8、40、80nM的乙酸铅标准溶液。

(2)绘制标准曲线

①取实施例1制备的铅离子依赖型脱氧核酶溶液一份(18μL)，向其中加入2μL Pb²⁺浓度为0nM的乙酸铅标准溶液，在室温(25℃)放置80min进行切割反应，切割反应会得到核苷酸序列如7和8所示的两个切割产物，然后加入2μL浓度为2μM的5’端被荧光染色基团标记的Sub F和4μL浓度为2μM的3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q，混匀后在37℃ 孵育35min以终止切割反应，得到反应混合液，然后采用荧光光谱检测仪在激发波长为480 nm，发射波长范围为510～650nm的条件下测定所得反应混合液的荧光强度，记录该铅离子标准溶液的荧光强度峰值；

②依次使用Pb²⁺浓度分别为0.8、4、8、40、80nM的乙酸铅标准溶液代替步骤①中的乙酸铅标准溶液，重复步骤①的操作，得到一系列铅离子标准溶液的荧光强度峰值，以铅离子标准溶液的铅离子浓度为横坐标，以铅离子标准溶液的荧光强度峰值为纵坐标绘制标准曲线，拟合出的标准曲线的回归方程为y＝1411.4x+1647，R²＝0.9993，其中，y代表荧光强度，x 代表Pb²⁺浓度，标准曲线如图2所示。

实施例3

本实施例中，在自来水中添加Pb²⁺并检测Pb²⁺浓度，步骤如下：

(1)取自来水配制Pb²⁺浓度分别为0、4、8、40、80nM的Pb²⁺样品溶液，依次记作1#～5# 样品溶液。

(2)Pb²⁺样品溶液检测

①取实施例1制备的铅离子依赖型脱氧核酶溶液一份(18μL)，向其中加入1#样品溶液，在室温(25℃)放置80min进行切割反应，切割反应会得到核苷酸序列如7和8所示的两个切割产物，然后加入2μL浓度为2μM的5’端被荧光染色基团标记的Sub F和4μL浓度为2μM的3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q，混匀后在37℃孵育35min以终止切割反应，得到反应混合液，然后采用荧光光谱检测仪在激发波长为480nm，发射波长范围为510～650 nm的条件下测定所得反应混合液的荧光强度，记录该样品溶液的荧光强度峰值；

②依次使用2#～5#样品溶液代替步骤①中的1#样品溶液，重复步骤①的操作，得到2#～5# 样品溶液的荧光强度峰值并记录；

③将1#～5#样品溶液的荧光强度峰值分别代入标准曲线的回归方程中，计算出各样品溶液中的Pb²⁺浓度，结果如图3所示，其回收率为89.91％～114.16％。

实施例4

本实施例中，在蛋液中添加Pb²⁺并检测Pb²⁺浓度，步骤如下：

(1)取0.45g鲜鸡蛋液置于锥形瓶中，加入10mL质量分数为65％～68％的硝酸在常温下消化1h后加入0.5mL质量分数为70％～72％的高氯酸，然后在可调式电热炉上加热至微沸进行消解。待消化液呈无色透明或略带黄色，且即将蒸干之时停止加热，冷却后用超纯水定容至100mL，混匀备用。取少许所得溶液，稀释50倍，用稀释后的溶液配制Pb²⁺浓度分别为0、4、8、40、80nM的Pb²⁺样品溶液，依次记作6#～10样品溶液。

(2)Pb²⁺样品溶液检测

①取实施例1制备的铅离子依赖型脱氧核酶溶液一份(18μL)，向其中加入6#样品溶液，在室温(25℃)放置80min进行切割反应，切割反应会得到核苷酸序列如7和8所示的两个切割产物，然后加入2μL浓度为2μM的5’端被荧光染色基团标记的Sub F和4μL浓度为2μM的3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q，混匀后在37℃孵育35min以终止切割反应，得到反应混合液，然后采用荧光光谱检测仪在激发波长为480nm，发射波长范围为510～650 nm的条件下测定所得反应混合液的荧光强度，记录该样品溶液的荧光强度峰值；

②依次使用7#～10#样品溶液代替步骤①中的1#样品溶液，重复步骤①的操作，得到2#～5# 样品溶液的荧光强度峰值并记录；

③将6#～10#样品溶液的荧光强度峰值分别代入标准曲线的回归方程中，计算出各样品溶液中的Pb²⁺浓度，结果如图3所示，其回收率为87.09％～101.24％。

实施例5

本实施例中，考察本发明提供的荧光传感器对测试温度的稳定性，步骤如下：

(1)①取实施例1制备的铅离子依赖型脱氧核酶溶液一份(18μL)，向其中加入2μLPb²⁺浓度为20μM的铅离子标准溶液，在20℃放置80min进行切割反应，切割反应会得到核苷酸序列如7和8所示的两个切割产物，然后加入2μL浓度为2μM的5’端被荧光染色基团标记的Sub F和4μL浓度为2μM的3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q，混匀后在37℃孵育35min以终止切割反应，得到反应混合液，然后采用荧光光谱检测仪在激发波长为480nm，发射波长范围为510～650nm的条件下测定所得反应混合液的荧光强度，记录该铅离子标准溶液的荧光强度峰值。

②将步骤①中的铅离子标准溶液替换为等量的超纯水，重复步骤①的操作，记录荧光强度峰值。

(2)①将步骤(1)中在20℃放置80min进行切割反应中的温度调整为23℃、26℃、29℃、32℃、35℃、38℃、41℃，重复步骤(1)①的操作，记录荧光强度峰值。

②将步骤(2)①中的铅离子标准溶液替换为等量的超纯水，重复步骤(2)①的操作，记录荧光强度峰值。

在不用温度条件下进行切割反应，终止切割反应后所得样品的荧光强度峰值如图4所示，由图4可知，本发明提供的荧光传感器的灵敏度随着温度的变化未出现明显差异，具有十分优异的温度稳定性。

实施例6

本实施例中，考察本发明提供的荧光传感器对其他金属离子选择性，步骤如下：

1.对低浓度其他金属离子的选择性

(1)用超纯水分别配制10、50、100、200nM的Pb²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Cd²⁺、 Ni²⁺的金属离子溶液。

(2)取实施例1制备的铅离子依赖型脱氧核酶溶液若干份，每份18μL，分别向各份铅离子依赖型脱氧核酶溶液中加入2μL不同浓度、不同离子种类的上述金属离子溶液的一种作为实验组，向其中一份铅离子依赖型脱氧核酶溶液中加入2μL超纯水作为空白对照组，在室温(25℃)放置40min进行切割反应，切割反应会得到核苷酸序列如7和8所示的两个切割产物，然后分别向各份溶液中加入2μL浓度为2μM的5’端被荧光染色基团标记的SubF 和4μL浓度为2μM的3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q，混匀后在37℃孵育35min以终止切割反应，得到反应混合液，然后采用荧光光谱检测仪在激发波长为480nm，发射波长范围为510～650nm的条件下测定所得反应混合液的荧光强度，记录各样品的荧光强度峰值。

在不同的低浓度的金属离子单独存在的条件下进行切割反应，终止切割反应后所得样品产物的荧光强度峰值如图5所示，由图5可知，10～200nM的Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Cd² ⁺、 Ni²⁺组的荧光强度峰值与空白对照组的荧光强度相当，而Pb²⁺组的荧光强度峰值显著高于低浓度的Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺组和空白对照组的荧光强度，说明低浓度的Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺不会干扰Pb²⁺的检测。

2.对高浓度其他金属离子的选择性

(1)用超纯水分别配制50nM的Pb²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺溶液以及250nM、1μnol/L、 5μM、25μM的Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺溶液。

在不同的高浓度的金属离子单独存在的条件下进行切割反应，终止切割反应后所得样品产物的荧光强度峰值如图6所示，由图6可知，50nM～25μM的Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺组的荧光强度峰值与空白对照组的荧光强度相当，而Pb²⁺组的荧光强度峰值显著高于高浓度的Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺组和空白对照组的荧光强度，说明高浓度的Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺也不会干扰Pb²⁺的检测。

3.高浓度多种金属离子的混合干扰

(1)用超纯水配制含有Pb²⁺的混合溶液A(50nM Pb²⁺,25μM Zn²⁺,25μM Mn²⁺,25μM,25μM Ca²⁺,25μM Co²⁺,25μM Cd²⁺,25μM Ni²⁺)以及不含有Pb²⁺的混合溶液B(25μM Zn²⁺,25μMMn²⁺,25μM,25μM Ca²⁺,25μM Co²⁺,25μM Cd²⁺,25μM Ni²⁺)。

(2)取实施例1制备的铅离子依赖型脱氧核酶溶液3份，每份18μL，分别向各份铅离子依赖型脱氧核酶溶液中加入2μL混合溶液A、混合溶液B作为实验组，向其中一份铅离子依赖型脱氧核酶溶液中加入2μL超纯水作为空白对照组，在室温(25℃)放置40min进行切割反应，切割反应会得到核苷酸序列如7和8所示的两个切割产物，然后分别向各份溶液中加入2μL浓度为2μM的5’端被荧光染色基团标记的Sub F和4μL浓度为2μM的3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q，混匀后在37℃孵育35min以终止切割反应，得到反应混合液，然后采用荧光光谱检测仪在激发波长为480nm，发射波长范围为510～650nm的条件下测定所得反应混合液的荧光强度，记录各样品的荧光强度峰值。

在高浓度的混合金属离子存在的条件下进行切割反应，终止切割反应后所得样品产物的荧光强度峰值如图7所示，由图7可知，不含Pb²⁺的混合溶液B组与空白对照组的荧光强度相当，而含Pb²⁺的混合溶液A组的荧光强度峰值显著高于混合溶液B组和空白对照组的荧光强度，说明在高浓度的其他金属离子共存的条件下也不会干扰Pb²⁺的检测。

综合本实施例的实验结果可知，本发明提供的荧光传感器对铅离子具有高度特异选择性。

实施例7

本实施例中，考察本发明提供的荧光传感器的信噪比，步骤如下：

(1)取实施例1制备的铅离子依赖型脱氧核酶溶液一份(18μL)，向其中加入2μLPb²⁺浓度为20μM的铅离子标准溶液，在室温(25℃)放置80min进行切割反应，切割反应会得到核苷酸序列如7和8所示的两个切割产物，然后加入2μL浓度为2μM的5’端被荧光染色基团标记的Sub F和4μL浓度为2μM的3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q，混匀后在 37℃孵育35min以终止切割反应，得到反应混合液，然后采用荧光光谱检测仪在激发波长为480nm，发射波长范围为510～650nm的条件下测定所得反应混合液的荧光强度，记录该铅离子标准溶液的荧光强度峰值。

(2)将步骤(1)中的铅离子标准溶液替换为等量的超纯水，重复步骤(1)的操作，记录荧光强度峰值。

(3)计算步骤(1)与步骤(2)中测得的荧光强度峰值的比值，即得信噪比，结果如表2所示。

对比例1

本对比例中，采用5’端被荧光染色基团标记的脱氧核酶底物链和3’端被荧光猝灭基团标记的脱氧核酶酶链制备得到荧光传感器，并采用该荧光传感器进行铅离子检测，考察其信噪比。

检测原理：如图8(A)所示，本对比例中的铅离子依赖型脱氧核酶由上述荧光染色基团标记的脱氧核酶底物链以及荧光猝灭基团标记的脱氧核酶酶链组成，通过碱基互补配对结合形成特定的二级结构，此时荧光信号被猝灭；其脱氧核酶的底物链中含有一个腺嘌呤核糖核苷酸，铅离子能够特异性识别铅离子依赖型脱氧核酶，激活脱氧核酶酶链的活性，在腺嘌呤核糖核苷酸处切割脱氧核酶的底物链，生成切割产物，荧光基团与猝灭基团分开，从而产生荧光信号，通过对荧光信号的检测可以实现对铅离子的定量分析。

实验步骤如下：

(1)将3μL浓度为2μM的5’端被荧光染色基团标记的脱氧核酶底物链母液和6μL浓度为0.5μM的3’端被荧光猝灭基团标记的脱氧核酶酶链母液加入到2μL的缓冲液(500mMHEPES,500mM NaCl,50mM MgCl₂,pH＝7.26)中，用超纯水稀释至18μL，在80℃下加热 3min，然后缓慢降温至室温，整个降温过程持续40min，再在室温放置25min，得到铅离子依赖型脱氧核酶溶液。

重复该步骤的前述操作，制备得到若干份铅离子依赖型脱氧核酶溶液，每份18μL。

(2)取步骤(1)制备的铅离子依赖型脱氧核酶溶液一份(18μL)，向其中加入2μLPb²⁺浓度为20μM的铅离子标准溶液，在室温(25℃)放置80min进行切割反应，得到包括切割产物在内的反应混合液，然后采用荧光光谱检测仪在激发波长为480nm，发射波长范围为 510～650nm的条件下测定所得反应混合液的荧光强度，记录该铅离子标准溶液的荧光强度峰值。

(3)将步骤(2)中的铅离子标准溶液替换为等量的超纯水，重复步骤(1)的操作，记录荧光强度峰值。

(4)计算步骤(2)与步骤(3)中测得的荧光强度峰值的比值，即得信噪比，结果如表2所示。

对比例2

本对比例中，采用5’端和3’端分别被荧光染色基团与荧光猝灭基团标记的脱氧核酶底物链，以及3’端被荧光猝灭基团标记的脱氧核酶酶链制备得到荧光传感器，并采用该荧光传感器进行铅离子检测，考察其信噪比。

检测原理：如图8(B)所示，本对比例中的铅离子依赖型脱氧核酶由荧光染色基团和荧光猝灭基团标记的脱氧核酶底物链，以及荧光猝灭基团标记的脱氧核酶酶链组成，通过碱基互补配对结合形成特定的二级结构，此时荧光信号被猝灭；其脱氧核酶的底物链中含有一个腺嘌呤核糖核苷酸，铅离子能够特异性识别铅离子依赖型脱氧核酶，激活脱氧核酶其酶链的活性，在腺嘌呤核糖核苷酸处切割脱氧核酶的底物链，生成切割产物，荧光基团与猝灭基团分开，从而产生荧光信号，通过对荧光信号的检测可以实现对铅离子的定量分析。

实验步骤如下：

(1)将3μL浓度为2μM的5’端和3’端分别被荧光染色基团与荧光猝灭基团标记的脱氧核酶底物链母液，以及6μL浓度为0.5μM的3’端被荧光猝灭基团标记的脱氧核酶酶链母液加入到2μL缓冲液(500mM HEPES,500mM NaCl,50mM MgCl₂,pH＝7.26)中，用超纯水稀释至18μL，在80℃下加热3min，然后缓慢降温至室温，整个降温过程持续40min，再在室温放置25min，得到铅离子依赖型脱氧核酶溶液。

(2)取步骤(1)制备的铅离子依赖型脱氧核酶溶液一份(18μL)，向其中加入2μL的Pb²⁺浓度为20μM的铅离子标准溶液，在室温(25℃)放置80min进行切割反应，得到包括切割产物在内的反应混合液，然后采用荧光光谱检测仪在激发波长为480nm，发射波长范围为510～650nm的条件下测定所得反应混合液的荧光强度，记录该铅离子标准溶液的荧光强度峰值。

表2 实施例7与对比例1、2的信噪比

项目	信噪比
		对比例1	2.23
对比例2	4.15
		实施例7	23.63

由表2可知，本发明提供的荧光传感器的信噪比明显高于对比例1和对比例2，说明本发明提供的传感器的灵敏度等性能有显著提高。

序列表

<110> 四川大学

<120> 一种低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器及其在铅离子检测中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

attcagtcta gattctgctc actataggaa gagatgatgt ctgtattcac tagtc 55

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

catctctgaa gtagcgccgc cgtatagtg 29

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

tcatctctga agtagcgccg ccgtatagtg a 31

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atcatctctg aagtagcgcc gccgtatagt gag 33

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tatagtgagc agaatctaga ctgaat 26

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gactagtgaa tacagacatc atctcttcc 29

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

attcagtcta gattctgctc actat 25

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

ggaagagatg atgtctgtat tcactagtc 29

Claims

1.一种低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器，包括分子识别元件和信号转换元件，其特征在于：

所述分子识别元件为铅离子依赖型脱氧核酶，铅离子脱氧核酶由脱氧核酶底物链和脱氧核酶酶链组成，所述脱氧核酶底物链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，所述脱氧核酶酶链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示；

所述信号转换元件由5’端被荧光染色基团标记的Sub F和3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q组成，Sub F的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示，Sub Q的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示；

所述脱氧核酶底物链与脱氧核酶酶链通过碱基互补配对结合形成铅离子脱氧核酶，铅离子能特异性识别铅离子脱氧核酶并激活脱氧核酶酶链的活性，被激活的脱氧核酶酶链将脱氧核酶底物链切割成核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.7和序列表中SEQ ID No.8所示的两个切割产物，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.7所示的切割产物与5’端被荧光染色基团标记的Sub F结合后产生荧光信号，核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.8所示的切割产物与3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q结合后终止切割反应；同时，未被切割的脱氧核酶底物链会与5’端被荧光染色基团标记的Sub F和3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q临近杂交，并使荧光染色基团与荧光猝灭基团靠近，进而使5’端被荧光染色基团标记的Sub F的荧光被淬灭。

2.权利要求1所述低背景和温度稳定的功能核酸荧光传感器在铅离子检测中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于步骤如下：

(1)制备铅离子依赖型脱氧核酶溶液

(2)绘制标准曲线

①取步骤(1)制备的铅离子依赖型脱氧核酶溶液，向其中加入浓度已知的铅离子标准溶液，在室温放置60～90min进行切割反应，然后加入5’端被荧光染色基团标记的Sub F和3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q，混匀后在30～40℃孵育25～40min以终止切割反应，得到反应混合液，测定反应混合液的荧光强度，记录该铅离子标准溶液对应的荧光强度峰值；

②使用一系列浓度已知的铅离子标准溶液代替步骤①中的铅离子标准溶液，重复步骤①的操作，得到一系列铅离子标准溶液的荧光强度峰值，以铅离子标准溶液的铅离子浓度为横坐标，以铅离子标准溶液的荧光强度峰值为纵坐标绘制标准曲线；

(3)待测样品检测

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，控制步骤(2)①、②和步骤(3)中的反应温度和反应时间完全一致。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，步骤(1)中按照脱氧核酶酶链与脱氧核酶底物链的摩尔比为1:(1～8)的比例将脱氧核酶酶链和脱氧核酶底物链溶解于缓冲液中。

6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，步骤(2)①中按照5’端被荧光染色基团标记的Sub F与脱氧核酶底物链的摩尔比为1:(1～2.5)，5’端被荧光染色基团标记的Sub F与3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q的摩尔比为1:(1～6)的比例加入5’端被荧光染色基团标记的Sub F与3’端被荧光猝灭基团标记的Sub Q。

7.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，步骤(1)中的缓冲液是将4-羟乙基哌嗪乙磺酸、NaCl、MgCl₂溶解于超纯水中并调节pH值至7～8得到，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为40～60mmol/L，NaCl的浓度为40～60mmol/L，MgCl₂的浓度为3～6mmol/L。

8.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，步骤(2)①中测定荧光强度时，采用的激发波长与发射波长根据所述荧光染色基团的激发波长与发射波长进行确定。