CN107884565A - 一种砷离子的检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

一种砷离子的检测方法及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种砷离子的检测方法及检测试剂盒，属于环境分析化学领域。本发明以As3+特异性的核酸适体为分子识别元件，在As3+作用下打开茎环结构DNA，进一步结合核酸内切酶的信号扩增作用，实现对As3+的荧光检测。该方法对As3+的检测具有较高的灵敏度，其检测限为3pM，线性范围为10pM到100nM，同时该方法具有较好的特异性，常见的其他重金属不会干扰检测分析，能用于实际样品的定量检测。整个检测过程可在室温下完成反应，简单混合即可分析，具有操作简单、灵敏度高、经济便宜等优点。

Description

一种砷离子的检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明属于环境分析化学领域，具体涉及一种重金属砷离子的检测方法及检测试剂盒。
背景技术
砷(As)及砷化物是一类常见的环境污染源，具有很强的致癌性，严重危害人体健康及食品安全，可由呼吸道、消化道及皮肤吸收而进入人体，与体内酶蛋白分子结构中的巯基和羟基结合、使酶失去活性，严重危害神经系统、循环系统以及消化系统。砷离子主要以三价和五价形式存在，而三价砷(As3+)毒性最高。因此，对As3+的定量检测已经成为环境重金属污染检测的主要方向。
目前对As3+的检测方法多采用分光光度法、原子吸收光谱法(AAS)和氢化物发生原子荧光光谱法(HG-AFS)等。这些技术需要涉及繁琐的样品前处理，难以区分As3+和As5+，严重限制了它们的广泛应用。也有采用微生物进行检测，通过引入荧光蛋白进行诱导表达实现检测，但检测周期较长。因此，迫切需要建立As3+快速检测新方法，实现无需预处理即可实现高灵敏度地定量分析，这对保护环境安全，预防As3+污染具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种砷离子的检测方法及检测试剂盒，具体涉及一种核酸内切酶介导的信号扩增用于砷离子的检测方法及检测试剂盒，实现无需预处理即可实现高灵敏度地定量分析As3+。
本发明所采取的技术方案是：
一种砷离子的检测试剂盒，包括缓冲液、DNA茎环结构H1、DNA茎环结构H2、核酸DNA1和核酸内切酶；其中：
DNA茎环结构H1依次具有d区域、c区域、a区域和b区域；其中a区域的部分碱基与d区域的全部碱基互补配对，a区域的剩余碱基与c区域的部分碱基互补，共同形成茎环的茎部分，c区域的其余碱基形成茎环的环部分，b区域位于茎环结构外侧；c区域是As3+的核酸适体，能与As3+特异性结合，从而打开茎环结构H1；
DNA茎环结构H2依次具有f区域、b*区域、e*区域和f*区域；其中f区域与f*区域互补配对，形成茎环的茎部分；b*区域、e*区域形成茎环的环部分；b*区域含有核酸内切酶识别的酶切位点序列；H2两端分别修饰荧光基团与淬灭基团；
核酸DNA1包含a*区域和e区域；
其中，a、b、e、f区域分别依次与a*、b*、e*、f*区域序列互补配对。
优选的，H1中a区域碱基数为9～15个，更优选为12个。其中，碱基数过少会导致难以形成茎环结构，检测时背景信号增加；碱基数过长则难以打开茎环结构，导致检测信号下降。
优选的，H1中b区域的碱基数为6～9个，更优选为7个。其中，碱基数过长的话b区域直接与H2的b*区域结合，会增加背景值；过短的话即使b区域与DNA1的e区域相互作用也难以与H2的b*区域结合，导致检测信号下降。
优选的，H2的b*中核酸内切酶识别的酶切位点序列的碱基数为7～9个，更优选为7个。所述酶切位点序列过长的话即使不需要H2的e区域，仍然可能会与H1的b区域结合，增加检测的背景值。
优选的，核酸内切酶包括Nt.BbvCI、Nb.BbvCI等，它们能特异性识别双链DNA中的特定碱基序列，从而切割双链DNA。
优选的，当核酸内切酶为Nt.BbvCI时，H2中b*中相应的酶切位点序列为5'-CCTCAGC-3'。
优选的，H2中e*区域碱基数为6～9个，更优选为7个。e*区域过短的话无法与DNA1的e区域结合，从而无法协同作用，使H2与H1-DNA1结合，导致检测信号下降；过长的话，即使不需要H2的b*区域，e*区域也直接与DNA1的e区域结合，增加检测背景值。
优选的，DNA1中e区域的碱基数为6～9个，更优选的为7个。DNA1中e区域过短的话无法与H1的e*区域结合，从而无法协同作用，使H2与H1-DNA1结合，导致检测信号下降；过长的话，即使不需要H2的b区域，e区域也直接与H1的e*区域结合，增加检测背景值。
优选的，H1的c区域序列为：5’-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTTTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCGAGATAGTAAGTGCAATCT-3’(SEQ ID NO：1)。
优选的，H1的序列为：5’
-TGAGTG-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTTTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCGAGATAGTAAGTGCAATCT-ATTACCCACTCA-GCTGAGG-3’(SEQ ID NO：2)。
优选的，H2的序列为5’-ACTAGCA-CCTCAGC-ATCCGAA-TGCTAGT-3’(SEQ ID NO：3)。
优选的，DNA1的序列为5’-TTCGGAT-TGAGTGGGTAAT-3’(SEQ ID NO：4)。
优选的，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，具体为15mM Tris-HCl，pH为7.4，含有50mMNaCl，10mM MgCl2。
优选的，荧光基团包括但不限于FAM、Cy3、Cy5、JOE。
优选的，相对应的淬灭基团包括但不限于BHQ、TAMRA、Eclipse。
一种砷离子检测方法，包括下列步骤：
(1)用缓冲液分别溶解H1、DNA1和H2，将待测溶液与H1溶液混匀，充分反应；
(2)加入DNA1，充分反应；
(3)加入H2，充分反应；
(4)加入核酸内切酶，充分反应；
(5)检测反应液的荧光强度来确定结果；
其中缓冲液、DNA茎环结构H1、DNA茎环结构H2、核酸DNA1和核酸内切酶如上任一项所述。
本发明的反应原理如下(见图1)：
(1)茎环结构核酸H1中的c部分是As3+的核酸适体，能与As3+特异性结合，从而打开茎环结构H1。
(2)DNA1的a*部分与打开后的H1的a部分互补，形成部分双链DNA。
(3)加入茎环结构H2，H2的两端分别修饰荧光基团与淬灭基团，没有打开H2时，荧光被淬灭。H2的b*部分能与H1的b部分互补，H2的e*部分能与DNA1的e部分互补，两部分协同互补才能使H2的环部分与H1-DNA1结合。
(4)加入核酸内切酶(Nt.BbvCI)后，可识别互补后的H2中双链DNA中的酶切位点(如图1中H2的b*部分红色标记处)，切割H2，使H2变成两部分单链，从而使荧光基团与淬灭基团分离，检测体系具有较强的荧光。形成的H1-DNA1复合物可不断循环切割H2，从而达到信号放大的目的，实现高灵敏度检测As3+。
本发明的有益效果是：
(1)本发明方法无需使用抗体，以核酸适体为分子识别元件，易于保存。
(2)本发明方法采用工具酶进行信号循环扩增，灵敏度高，无需预处理可检测到痕量浓度的As3+离子。
(3)可在室温完成反应，无需对温度进行精确控制，操作简单。
(4)无需分离洗涤过程，直接混合即可检测。
附图说明
图1为检测砷离子反应原理示意图；
图2为对不同浓度As3+的检测结果；
图3为特异性实验结果图。
具体实施方式
本发明的反应原理如下(见图1)：
(1)茎环结构核酸H1中的c部分是As3+的核酸适体，能与As3+特异性结合，从而打开茎环结构H1。
(2)DNA1的a*部分与打开后的H1的a部分互补，形成部分双链DNA。
(3)加入茎环结构H2，H2的两端分别修饰荧光基团与淬灭基团，没有打开H2时，荧光被淬灭。H2的b*部分能与H1的b部分互补，H2的e*部分能与DNA1的e部分互补，两部分协同互补才能使H2的环部分与H1-DNA1结合。
(4)加入核酸内切酶(Nt.BbvCI)后，可识别互补后的H2中双链DNA中的酶切位点(如图1中H2的b*部分红色标记处)，切割H2，使H2变成两部分单链，从而使荧光基团与淬灭基团分离，检测体系具有较强的荧光。形成的H1-DNA1复合物可不断循环切割H2，从而达到信号放大的目的，实现高灵敏度检测As3+。
下面通过具体实施例对本发明进一步阐述，但不限于此。
实施例1
一种砷离子检测试剂盒，包括以下成分：
(1)核酸H1、DNA1、H2的序列如下：
H1：5’-TGAGTG(d)-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTTTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCGAGATAGTAAGTGCAATCT(c)-ATTACCCACTCA(a)-GCTGAGG(b)-3’(SEQ ID NO：2)。
H2:5’-ACTAGCA(f)-CC↓TCAGC(b*)-ATCCGAA(e*)-TGCTAGT-3’(f*)(箭头表示切割位点)(SEQ ID NO：3)。
DNA1：5’-TTCGGAT(e)-TGAGTGGGTAAT(a*)-3’(SEQ ID NO：4)。
(2)As3+标准溶液。
(3)核酸内切酶Nt.BbvCI。
(4)反应缓冲液，包含15mM Tris-HCl，pH为7.4，含有50mM NaCl，10mM MgCl2。
实施例2
一种砷离子检测方法，按照如下步骤进行：
(1)先用Tris-HCl缓冲液(15mM Tris-HCl，pH为7.4，含有50mM NaCl，10mM MgCl2)分别溶解H1、DNA1和H2。500nM的H1与不同浓度的As3+充分混匀，室温反应40分钟。
(2)加入500nM的DNA1，充分混匀，室温反应30分钟。
(3)加入300nM的H2，充分混匀，室温反应30分钟。
(4)加入10U的核酸内切酶Nt.BbvCI，充分混匀，室温反应90分钟。
(5)检测反应液的荧光强度，如果H2分别修饰的是FAM和BHQ1，则激发峰为490nm，记录发射峰525nm处的荧光；荧光强度跟As3+浓度呈正相关。从而达到检测As3+的目的。
其中茎环结构H1、茎环结构H2、核酸DNA1如实施例1所述。
实施例3
对不同浓度As3+的检测：
配制As3+标准溶液，浓度分别为10pM、100pM、1nM、10nM、100nM、500nM。
As3+溶液分别加到实施例2中所述的反应体系中，充分反应后检测荧光强度。如图2A所示，随着As3+浓度的增加，对应的荧光强度逐渐增加，当As3+浓度超过100nM时，体系逐渐达到饱和，荧光强度趋于平稳。如图2B所示，以As3+浓度的对数(lgC)为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，二者具有很好的线性关系，线性范围是从10pM到100nM，线性方程是：F＝45.6+92.4lgC(R2＝0.975)(F为荧光强度，C为As3+浓度)，按照3倍信噪比标准(3S/N)，检测限为3pM。
实施例4
特异性实验：
配制浓度为10nM的不同干扰离子标准溶液，分别是Cu2+、Pb2+、Fe3+、Mn2+、Cr3+、Co2+、Cd2+和Zn2+。
将10nM的不同干扰物标准溶液和10nM As3+标准溶液分别加到实施例2中所述的反应体系中，充分反应后检测荧光强度，如图3所示，10nM的Cu2+、Pb2+、Fe3+、Mn2+、Cr3+、Co2+、Cd2+和Zn2+的荧光强度与空白样品相比，变化不大，对检测不产生影响。只有当加入As3+才会使荧光强度明显增加，这证明该方法对As3+的检测具有很好的特异性，其他干扰离子对检测不产生影响。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省生态环境技术研究所
<120> 一种砷离子的检测方法及检测试剂盒
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttttacagaa caaccaacgt 60
cgctccgggt acttcttcat cgagatagta agtgcaatct 100
<210> 2
<211> 125
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgagtgggta atacgactca ctatagggag ataccagctt attcaatttt acagaacaac 60
caacgtcgct ccgggtactt cttcatcgag atagtaagtg caatctatta cccactcagc 120
tgagg 125
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
actagcacct cagcatccga atgctagt 28
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttcggattga gtgggtaat 19

Claims (10)

1.一种砷离子的检测试剂盒，其特征在于：包括缓冲液、DNA茎环结构H1、DNA茎环结构H2、核酸DNA1和核酸内切酶；其中：
DNA茎环结构H1依次具有d区域、c区域、a区域和b区域；其中a区域的部分碱基与d区域的全部碱基互补配对，a区域的剩余碱基与c区域的部分碱基互补，共同形成茎环的茎部分，c区域的其余碱基形成茎环的环部分，b区域位于茎环结构外侧；c区域是As3+的核酸适体，能与As3+特异性结合，从而打开茎环结构H1；
DNA茎环结构H2依次具有f区域、b*区域、e*区域和f*区域；其中f区域与f*区域互补配对，形成茎环的茎部分；b*区域、e*区域形成茎环的环部分；b*区域含有核酸内切酶识别的酶切位点序列；H2两端分别修饰荧光基团与淬灭基团；
核酸DNA1包含a*区域和e区域；
其中，a、b、e、f区域分别依次与a*、b*、e*、f*区域序列互补配对。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：H1中a区域碱基数为9～15个，b区域的碱基数为6～9个。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：H2的b*中核酸内切酶识别的酶切位点序列的碱基数为7～9个，H2中e*区域碱基数为6～9个。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：核酸内切酶包括Nt.BbvCI、Nb.BbvCI。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：当核酸内切酶为Nt.BbvCI时，H2中b*中相应的酶切位点序列为5'-CCTCAGC-3'。
6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：DNA1中e区域的碱基数为6～9个。
7.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于：H1的序列为5’-TGAGTG-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTTTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCGAGATAGTAAGTGCAATCT-ATTACCCACTCA-GCTGAGG-3’。
8.根据权利要求1-5任一项所述的检测试剂盒，其特征在于：H2的序列为5’-ACTAGCA-CCTCAGC-ATCCGAA-TGCTAGT-3’。
9.根据权利要求1-6任一项所述的检测试剂盒，其特征在于：DNA1的序列为5’-TTCGGAT-TGAGTGGGTAAT-3’。
10.一种砷离子检测方法，其特征在于，包括下列步骤：
用缓冲液分别溶解H1、DNA1和H2，将待测溶液与H1溶液混匀，充分反应；
加入DNA1，充分反应；
加入H2，充分反应；
加入核酸内切酶Nt.BbvCI，充分反应；
检测反应液的荧光强度来确定结果；
其中缓冲液、DNA茎环结构H1、DNA茎环结构H2、核酸DNA1和核酸内切酶如权利要求1-9任一项所述。
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