CN109055492A - 一种免标记荧光检测铅离子的方法及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种免标记荧光检测铅离子的方法及检测试剂盒，属于分析检测领域。本发明利用发夹结构复合体(ATMND/HP1)介导的铅离子特异性DNA酶(8‑17 DNAzyme)和核酸外切酶(Exo III)辅助的目标信号级联循环扩增策略，构建了一种免标记荧光检测铅离子的方法及检测试剂盒。所述方法及试剂盒使得检测过程快速和简单、免标记，且灵敏度高，易于大规模推广使用。

Description

一种免标记荧光检测铅离子的方法及检测试剂盒
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种免标记荧光检测铅离子的方法及检测试剂盒。
背景技术
铅离子(Pb2+)作为一种剧毒性的重金属元素，广泛存在于水体、土壤和农产品中。低浓度的铅离子可危害健康和对环境造成污染。世界健康组织和美国环境保护署规定引用水中铅离子的最大允许量不得超过72nM。
目前，常规的铅离子检测方法主要有高效液相色谱法和原子吸收分光光度法、原子荧光光谱等方法。这些方法需要分离富集和操作繁琐、费时，不利于快速现场检测。近年来，利用DNAzyme进行检测重金属离子的方法备受关注，已建立荧光、电化学以及比色法等分析技术，但大多需要进行标记，因而限制了这些技术的广泛应用。
因此，迫切需要构建一种新型检测技术用于铅离子的检测，使检测过程快速和简单、免标记和灵敏度高，从而降低成本，易于推广。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，利用发夹结构复合体(ATMND/HP1)介导的铅离子特异性DNA酶(8-17DNAzyme)和核酸外切酶(Exo III)辅助的目标信号级联循环扩增策略，构建了一种免标记荧光检测铅离子的方法及检测试剂盒。所述方法及试剂盒使得检测过程快速和简单、免标记，且灵敏度高，易于大规模推广使用。
本发明所采取的技术方案是：
一种免标记荧光检测铅离子的检测试剂盒，包括铅离子特异性DNA酶序列8-17DNAzyme、发夹探针HP1、缓冲溶液、5,6,7-三甲基-1,8-萘啶-2-胺和核酸外切酶Exo III，其中铅离子特异性DNA酶序列8-17DNAzyme由底物链S-DNA和催化链E-DNA共同组成，底物链S-DNA和催化链E-DNA的3'端还连接有数个保护性碱基。由于铅离子特异性DNA酶序列8-17DNAzyme的序列是固定的，所以底物链S-DNA和催化链E-DNA也是固定的。本发明试剂盒中添加了核酸外切酶Exo III，为了防止底物链S-DNA和催化链E-DNA组成的铅离子特异性DNA酶序列8-17DNAzyme被酶切，所以需要在底物链S-DNA和催化链E-DNA的3'端连接数个保护性碱基，使得末端不配对。本发明实施例中所用的保护性碱基是TTTTT。
发夹探针HP1从5'端开始依次为A、B、C、D、E、F、G区域，其中A为5'端凸起；C区和E区互补，B区和F区除了一个C-C碱基错配外其余部分互补，且C-C错配的位置不在两端，B、C、E、F共同形成茎环结构的茎；D形成茎环结构的环；G为3'端凸起。
其中发夹探针HP1上的2个胞嘧啶错配碱基(C-C错配)能高效结合ATMND达到猝灭荧光的效果。
优选的，底物链S-DNA的序列如下所示：
S-DNA:5'-ACTCACTATrAGGAAGAGATGTTTTTT-3'(SEQ ID NO：1)。
优选的，催化链E-DNA的序列如下所示：
E-DNA:5'-CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGTTTTTT-3'(SEQ ID NO：2)。
其中，S-DNA中从5'端开始向3'端延伸过程中，包含有一段ACTCACTAT-rA-G-GAAGAGATG(SEQ ID NO：4)的序列；其中rA为切割位点，rA-G的左右2边9个碱基分别与E-DNA的阴影序列互补(CATCTCTTC-TCCGAGCCGGTCGAA-ATAGTGAGT-TTTTT-3)。
E-DNA中从5'端开始向3'端延伸过程中，包含有一段CATCTCTTC-TCCGAGCCGGTCGAA-ATAGTGAGT(SEQ ID NO：5)的序列，其中TCCGAGCCGGTCGAA(SEQ ID NO：6)构成一个凸起部分，凸起部分左右两旁的9个碱基(CATCTCTTC-TCCGAGCCGGTCGAA-ATAGTGAGT-TTTTT-3)与S-DNA互补。
优选的，底物链S-DNA和催化链E-DNA的3'端均连接了5个保护性碱基TTTTT用来防止Exo III酶切。
当有铅离子存在时，催化链切割底物链，切割位点为rA，切割后的底物链分割为两部分，其中靠近S-DNA的3'端部分记名为信号转导探针(STP：5-GGAAGAGATG-TTTTTT-3)(SEQID NO：7)，用于启动下一步反应。如果没有铅离子存在，那么催化链和底物链还是继续互补结合在一起。
优选的，发夹探针HP1中A区包含4-6个碱基，B区包含3-7个碱基，C区包含10个碱基，D区包含4-8个碱基，E区包含10个碱基，F区包含3-7个碱基，G区包含4-6个碱基。
优选的，发夹探针HP1的C区序列为：GGAAGAGATG(SEQ ID NO：8)。
C区序列和S-DNA切割位点rA后的序列GGAAGAGATG相同，也即和信号转导探针STP除去保护性碱基以外的序列相同。
优选的，A和G区序列共同与序列GGAAGAGATG互补。
A和G区序列连在一起共同与STP除去保护性碱基以外的序列(GGAAGAGATG)互补。
A区的5'端可以多几个碱基，但是从经济效益一般越少越好。
优选的，发夹探针HP1的A区序列为CATC(SEQ ID NO：9)，G区序列为TCTTCC(SEQ IDNO：10)。
优选的，B区序列为CGCC(SEQ ID NO：11)。
优选的，F区的序列为GCCG(SEQ ID NO：12)。
优选的，发夹探针HP1的序列如下所示：
HP1:5'-CATC(A区)-CGCC(B区)-GGAAGAGATG(C区)-AAAA(D区)-CATCTCTTCC(E区)-GCCG(F区)-TCTTCC(G区)-3'(SEQ ID NO：3)。
其中B区序列为CGCC，F区的序列为GCCG，第三个C-C错配。
发明人经过研究发现，B区序列设计为*GCC，而F区序列设计为*CCG得到的C-C错配效率，能获得最佳的荧光淬灭效果。其效果来说，B区序列*GCC＞*CCC＞*ACG。
优选的，缓冲溶液包括Tris-Ac缓冲溶液，pH＝7.0-7.5。
优选的，缓冲溶液包括20mM Tris-Ac缓冲溶液中，其中含有150mM NaAc，pH＝7.4。
这是模拟生理条件，用于碱基配对。缓冲液的成分、种类和pH可以有微小范围波动，但总体基本稳定。
优选的，缓冲溶液还包括1×NEBuffer缓冲液，作为Exo III酶切缓冲液。
反应原理如下：
存在铅离子时，8-17DNAzyme结合铅离子切割S-DNA，导致STP释放。STP与HP1的AG区结合，使HP1的3’端G区形成双链DNA的平末端。接着Exo III从HP1的3’端逐渐酶切双链DNA，最后切完到D区，释放出STP、二级STP类似物(ABCD区)和ATMND。随后二级STP类似物的C区同样与HP1的AG区结合引发类似STP的反应过程。最后，在STP和二级STP类似物(ABCD区)的不断循环下，释放大量的ATMND(λex＝356nm,λem＝408nm；λex为激发光波长，λem为发射光波长峰值)。在最佳条件下，该方法的线性范围从100pM到10μM，检测限为50pM。该方法还对其他可能的干扰离子表现出显著的选择性。地下水实际样品铅离子分析表明，该方法具有较好的精密度和准确度。
一种免标记荧光检测铅离子的方法，包括以下步骤：
(1)8-17DNAzyme的形成：在室温条件下，将S-DNA和E-DNA按1:1-1:10的浓度比(不同的混合比例会得到不同的信噪比，信噪比越大对实验结果效果越好)加入20mM Tris-Ac缓冲溶液中(150mM NaAc,pH＝7.4)，孵育1.5-2.5h使之彻底形成8-17DNAzyme。
(2)ATMND/HP1复合体的形成。将浓度为1-10μM的发夹探针HP1(不同的浓度比例会得到不同的信噪比，信噪比越大对实验结果效果越好)和ATMND(5,6,7-三甲基-1,8-萘啶-2-胺)按照1:1-10:1的浓度比(不同的混合比例会得到不同的信噪比，信噪比越大对实验结果效果越好)混合在Tris-Ac缓冲溶液中(150mM NaAc,pH＝7.4)中，95℃加热5-10分钟。随后缓慢冷却至室温，以致形成稳定的ATMND/HP1复合体。
每个实验条件对实验结果有很大的影响。每个反应条件的最佳条件即对应的信噪比达到最大。这样在最适条件下，实验的效果达到最优。
(3)铅离子检测。
将20uL待测溶液加入在含有DNAzyme、ATMND/HP1和30U Exo III的180uL Tris-Ac缓冲溶液，室温反应90分钟。根据释放的ATMND浓度与荧光强度成线性关系(λex＝356nm,λem＝408nm)，从而达到检测铅离子的目的。
其中，铅离子特异性DNA酶序列8-17DNAzyme、发夹探针HP1、缓冲体系、5,6,7-三甲基-1,8-萘啶-2-胺和核酸外切酶Exo III如上任一项所述。
当没有铅离子时，混合液无荧光变化；当有铅离子时，混合液中DNAzyme与铅离子结合切割S-DNA并释放出STP。随后，释放的STP与ATMND/HP1结合导致Exo III酶切。在酶切作用下，ATMND/HP1释放STP、二级STP类似物和ATMND。释放的STP与二级STP类似物不断与ATMND/HP1结合，持续释放出ATMND。根据释放的ATMND浓度与荧光强度成线性关系(λex＝356nm,λem＝408nm)，从而达到检测铅离子的目的。
本发明的有益效果是：
本发明是以铅离子特异性识别DNA酶的核酸适体为感应元件，通过设计(8-17DNAzyme)和发夹结构HP1，结合核酸外切酶(Exo III)辅助目标信号级联再循环扩增策略。以ATMND为信号报告分子，可现实免标记检测重金属铅离子，简化了操作，降低了成本。整个检测过程响应迅速，无需专业训练即可掌握操作流程，便于快速推广使用。
本发明所述的检测方法和检测试剂盒对环境或食品中铅离子的快速检测具有重要意义。
附图说明
图1为本发明所述的检测方法的原理图；
图2为对不同浓度的铅离子检测的结果图；
图3为特异性实验结果图。
具体实施方式
一种免标记荧光检测铅离子的检测试剂盒，包括铅离子特异性DNA酶序列8-17DNAzyme、发夹探针HP1、缓冲溶液、5,6,7-三甲基-1,8-萘啶-2-胺和核酸外切酶Exo III，其中铅离子特异性DNA酶序列8-17DNAzyme由底物链S-DNA和催化链E-DNA共同组成，底物链S-DNA和催化链E-DNA的3'端还连接有数个保护性碱基。由于铅离子特异性DNA酶序列8-17DNAzyme的序列是固定的，所以底物链S-DNA和催化链E-DNA也是固定的。本发明试剂盒中添加了核酸外切酶Exo III，为了防止底物链S-DNA和催化链E-DNA组成的铅离子特异性DNA酶序列8-17DNAzyme被酶切，所以需要在底物链S-DNA和催化链E-DNA的3'端连接数个保护性碱基，使得末端不配对。本发明实施例中所用的保护性碱基是TTTTT。
发夹探针HP1从5'端开始依次为A、B、C、D、E、F、G区域，其中A为5'端凸起；C区和E区互补，B区和F区除了一个C-C碱基错配外其余部分互补，且C-C错配的位置不在两端，B、C、E、F共同形成茎环结构的茎；D形成茎环结构的环；G为3'端凸起。
其中发夹探针HP1上的2个胞嘧啶错配碱基(C-C错配)能高效结合ATMND达到猝灭荧光的效果。
优选的，底物链S-DNA的序列如下所示：
T-DNA:5'-ACTCACTATrAGGAAGAGATGTTTTTT-3'(SEQ ID NO：1)。
优选的，催化链E-DNA的序列如下所示：
E-DNA:5'-CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGTTTTTT-3'(SEQ ID NO：2)。
其中，S-DNA中从5'端开始向3'端延伸过程中，包含有一段ACTCACTAT-rA-G-GAAGAGATG(SEQ ID NO：4)的序列；其中rA为切割位点，rA-G的左右2边9个碱基分别与E-DNA的阴影序列互补(CATCTCTTC-TCCGAGCCGGTCGAA-ATAGTGAGT-TTTTT-3)。
F-DNA中从5'端开始向3'端延伸过程中，包含有一段CATCTCTTC-TCCGAGCCGGTCGAA-ATAGTGAGT(SEQ ID NO：5)的序列，其中TCCGAGCCGGTCGAA(SEQ ID NO：6)构成一个凸起部分，凸起部分左右两旁的9个碱基(CATCTCTTC-TCCGAGCCGGTCGAA-ATAGTGAGT-TTTTT-3)与S-DNA互补。
优选的，底物链S-DNA和催化链E-DNA的3'端均连接了5个保护性碱基TTTTT用来防止Exo III酶切。
当有铅离子存在时，催化链切割底物链，切割位点为rA，切割后的底物链分割为两部分，其中靠近S-DNA的3'端部分记名为信号转导探针(STP：5-GGAAGAGATG-TTTTTT-3)(SEQID NO：7)，用于启动下一步反应。如果没有铅离子存在，那么催化链和底物链还是继续互补结合在一起。
优选的，发夹探针HP1中A区包含4-6个碱基，B区包含3-7个碱基，C区包含10个碱基，D区包含4-8个碱基，E区包含10个碱基，F区包含3-7个碱基，G区包含4-6个碱基。
优选的，发夹探针HP1的C区序列为：GGAAGAGATG(SEQ ID NO：8)。
C区序列和S-DNA切割位点rA后的序列GGAAGAGATG相同，也即和信号转导探针STP除去保护性碱基以外的序列相同。
优选的，A和G区序列共同与序列GGAAGAGATG互补。
A和G区序列连在一起共同与STP除去保护性碱基以外的序列(GGAAGAGATG)互补。
A区的5'端可以多几个碱基，但是从经济效益一般越少越好。
优选的，发夹探针HP1的A区序列为CATC(SEQ ID NO：9)，G区序列为TCTTCC(SEQ IDNO：10)。
优选的，B区序列为CGCC(SEQ ID NO：11)。
优选的，F区的序列为GCCG(SEQ ID NO：12)。
优选的，发夹探针HP1的序列如下所示：
HP1:5'-CATC(A区)-CGCC(B区)-GGAAGAGATG(C区)-AAAA(D区)-CATCTCTTCC(E区)-GCCG(F区)-TCTTCC(G区)-3'(SEQ ID NO：3)。
其中B区序列为CGCC，F区的序列为GCCG，第三个C-C错配。
发明人经过研究发现，B区序列设计为*GCC，而F区序列设计为*CCG得到的C-C错配效率，能获得最佳的荧光淬灭效果。其效果来说，B区序列*GCC＞*CCC＞*ACG。
优选的，缓冲溶液包括Tris-Ac缓冲溶液，pH＝7.0-7.5。
优选的，缓冲溶液包括20mM Tris-Ac缓冲溶液中，其中含有150mM NaAc，pH＝7.4。
这是模拟生理条件，用于碱基配对。缓冲液的成分、种类和pH可以有微小范围波动，但总体基本稳定。
优选的，缓冲溶液还包括1×NEBuffer缓冲液，作为Exo III酶切缓冲液。
反应原理如下(见图1)：
存在铅离子时，8-17DNAzyme结合铅离子切割S-DNA，导致STP释放。STP与HP1的AG区结合，使HP1的3’端G区形成双链DNA的平末端。接着Exo III从HP1的3’端逐渐酶切双链DNA，最后切完到D区，释放出STP、二级STP类似物(ABCD区)和ATMND。随后二级STP类似物的C区同样与HP1的AG区结合引发类似STP的反应过程。最后，在STP和二级STP类似物(ABCD区)的不断循环下，释放大量的ATMND(λex＝356nm,λem＝408nm；λex为激发光波长，λem为发射光波长峰值)。在最佳条件下，该方法的线性范围从100pM到10μM，检测限为50pM。该方法还对其他可能的干扰离子表现出显著的选择性。地下水实际样品铅离子分析表明，该方法具有较好的精密度和准确度。
一种免标记荧光检测铅离子的方法，包括以下步骤：
(1)8-17DNAzyme的形成：在室温条件下，将S-DNA和E-DNA按1:1-1:10的浓度比(不同的混合比例会得到不同的信噪比，信噪比越大对实验结果效果越好)加入20mM Tris-Ac缓冲溶液中(150mM NaAc,pH＝7.4)，孵育1.5-2.5h使之彻底形成8-17DNAzyme。
(2)ATMND/HP1复合体的形成。将浓度为1-10μM的发夹探针HP1(不同的浓度比例会得到不同的信噪比，信噪比越大对实验结果效果越好)和ATMND(5,6,7-三甲基-1,8-萘啶-2-胺)按照1:1-10:1的浓度比(不同的混合比例会得到不同的信噪比，信噪比越大对实验结果效果越好)混合在Tris-Ac缓冲溶液中(150mM NaAc,pH＝7.4)中，95℃加热5-10分钟。随后缓慢冷却至室温，以致形成稳定的ATMND/HP1复合体。
每个实验条件对实验结果有很大的影响。每个反应条件的最佳条件即对应的信噪比达到最大。这样在最适条件下，实验的效果达到最优。
(3)铅离子检测。
将20uL待测溶液加入在含有DNAzyme、ATMND/HP1和30U Exo III的180uL Tris-Ac缓冲溶液，室温反应90分钟。根据释放的ATMND浓度与荧光强度成线性关系(λex＝356nm,λem＝408nm)，从而达到检测铅离子的目的。
其中，铅离子特异性DNA酶序列8-17DNAzyme、发夹探针HP1、缓冲体系、5,6,7-三甲基-1,8-萘啶-2-胺和核酸外切酶Exo III如上任一项所述。
当没有铅离子时，混合液无荧光变化；当有铅离子时，混合液中DNAzyme与铅离子结合切割S-DNA并释放出STP。随后，释放的STP与ATMND/HP1结合导致Exo III酶切。在酶切作用下，ATMND/HP1释放STP、二级STP类似物和ATMND。释放的STP与二级STP类似物不断与ATMND/HP1结合，持续释放出ATMND。根据释放的ATMND浓度与荧光强度成线性关系(λex＝356nm,λem＝408nm)，从而达到检测铅离子的目的。
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不局限于此。
实施例1
一种免标记荧光检测铅离子的检测试剂盒，包括下列成分：
(1)铅离子特异性DNA酶序列(8-17DNAzyme)，序列如下：
S-DNA:5'-ACTCACTATrAGGAAGAGATGTTTTTT-3'(SEQ ID NO：1)；
E-DNA:5'-CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGTTTTTT-3'(SEQ ID NO：2)；
(2)ATMND/HP1复合体，
其中，ATMND购自乌克兰。
HP1序列如下：
HP1:5'-CATC(A区)-CGCC(B区)-GGAAGAGATG(C区)-AAAA(D区)-CATCTCTTCC(E区)-GCCG(F区)-TCTTCC(G区)-3'(SEQ ID NO：3)。
(3)Exo III及1×NEBuffer缓冲液。
(4)所示试剂盒还包括pH＝7.4的Tris-Ac缓冲溶液。
一种免标记荧光检测铅离子的方法按照如下步骤进行：
(1)8-17DNAzyme的形成。在室温条件下，50nM S-DNA和100nM E-DNA加入20mMTris-Ac缓冲溶液中(150mM NaAc,pH＝7.4)，孵育2h使之彻底形成DNAzyme。
(2)ATMND/HP1复合体的形成。HP1(浓度为1μM)和ATMND按照6:1的比例混合在Tris缓冲溶液中，95℃加热7分钟。随后缓慢冷却至室温，以致形成稳定的ATMND/HP1复合体。
(3)铅离子检测。在含有DNAzyme和ATMND/HP1的180uL Tris-Ac缓冲溶液，混合20uL含有铅离子和30U Exo III的重金属溶液。混合液中DNAzyme与铅离子结合切割S-DNA并释放出STP。随后，释放的STP与ATMND/HP1结合导致Exo III酶切。在酶切作用下，ATMND/HP1释放STP、二级STP类似物(ABCD区)和ATMND(请看示意图1左下角的说明)。释放的STP与二级STP类似物不断与ATMND/HP1结合，持续释放出ATMND。根据释放的ATMND浓度与荧光强度成线性关系(λex＝356nm,λem＝408nm)，从而达到检测铅离子的目的。
实施例2
对不同浓度铅离子的检测：
配制铅离子标准溶液，浓度分别为0、102pM、103pM、104pM、105pM和106pM和107pM，4℃保存。
将不同浓度的铅离子溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察荧光强度，如图2(图2A：在λex＝356nm条件下，不同铅离子浓度所对应的发射光波普图；图2B：在λex＝356nm条件下，Fλem＝408nm得到的荧光标准曲线图；)所示，50pM的铅离子可产生明显的荧光变化，说明其检测限为50pM。随着铅离子浓度增加，荧光强度也增加，并逐渐趋于饱和。
实施例3
特异性实验：
配制10nM不同离子的标准溶液，它们分别是As3+,Cd2+,Ag+,Mg2+,Zn2+,Mn2+,Ni2+和Cu2+。
将10nM的不同干扰物标准溶液和1nM铅离子溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察颜色变化，如图3所示，10nM的As3+,Cd2+,Ag+,Mg2+,Zn2+,Mn2+,Ni2+和Cu2+荧光强度均远远低于1nM的铅离子，这证明该方法对铅离子的检测具有较好的特异性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省生态环境技术研究所
<120> 一种免标记荧光检测铅离子的方法及检测试剂盒
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
actcactatr aggaagagat gtttttt 27
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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<210> 3
<211> 42
<212> DNA
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<400> 3
catccgccgg aagagatgaa aacatctctt ccgccgtctt cc 42
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
actcactatr aggaagagat g 21
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
catctcttct ccgagccggt cgaaatagtg agt 33
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tccgagccgg tcgaa 15
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggaagagatg tttttt 16
<210> 8
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggaagagatg 10
<210> 9
<211> 4
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
catc 4
<210> 10
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tcttcc 6
<210> 11
<211> 4
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cgcc 4
<210> 12
<211> 4
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gccg 4

Claims (10)

1.一种免标记荧光检测铅离子的检测试剂盒，其特征在于，包括铅离子特异性DNA酶序列8-17 DNAzyme、发夹探针HP1、缓冲溶液、5,6,7-三甲基-1,8-萘啶-2-胺和核酸外切酶ExoIII，其中铅离子特异性DNA酶序列8-17 DNAzyme由底物链S-DNA和催化链E-DNA共同组成，底物链S-DNA和催化链E-DNA的3'端还连接有数个保护性碱基，发夹探针HP1从5'端开始依次为A、B、C、D、E、F、G区域，其中A为5'端凸起；C区和E区互补，B区和F区除了一个C-C碱基错配外其余部分互补，且C-C错配的位置不在两端，B、C、E、F共同形成茎环结构的茎；D形成茎环结构的环；G为3'端凸起。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：发夹探针HP1中A区包含4-6个碱基，B区包含3-7个碱基，C区包含10个碱基，D区包含4-8个碱基，E区包含10个碱基，F区包含3-7个碱基，G区包含4-6个碱基。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：发夹探针HP1的C区序列为：GGAAGAGATG。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：A和G区序列共同与序列GGAAGAGATG互补。
5.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：发夹探针HP1的B区序列为CGCC。
6.根据权利要求1-5任一项所述的检测试剂盒，其特征在于：发夹探针HP1的序列如下所示：
HP1:5'-CATC-CGCC-GGAAGAGATG-AAAA-CATCTCTTCC-GCCG-TCTTCC-3'。
7.根据权利要求1-5任一项所述的检测试剂盒，其特征在于：底物链S-DNA的序列如下所示：
S-DNA:5'-ACTCACTATrAGGAAGAGATGTTTTTT-3'。
8.根据权利要求1-5任一项所述的检测试剂盒，其特征在于：催化链E-DNA的序列如下所示：
E-DNA:5'-CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGTTTTTT-3'。
9.根据权利要求1-5任一项所述的检测试剂盒，其特征在于：缓冲溶液包括Tris-Ac缓冲溶液，pH＝7.0-7.5。
10.一种免标记荧光检测铅离子的方法，其特征在于，包括下列步骤：
在室温条件下，将S-DNA和E-DNA按照1:1-1:10的浓度比混合，加入到缓冲溶液中，孵育1.5-2.5h，得到8-17DNAzyme；
将浓度为1-10μM的发夹探针HP1和5,6,7-三甲基-1,8-萘啶-2-胺按照1:1-10:1的浓度比混合在缓冲溶液中，95℃加热5-10分钟；随后缓慢冷却至室温；
将20uL待测溶液加入在含有8-17DNAzyme、5,6,7-三甲基-1,8-萘啶-2-胺/HP1和30UExo III的180uL Tris-Ac缓冲溶液，室温反应85-95分钟；然后检测λex＝356nm以及λem＝408nm的荧光强度，分析待检测溶液中的铅离子情况；
其中，铅离子特异性DNA酶序列8-17 DNAzyme、发夹探针HP1、缓冲体系、5,6,7-三甲基-1,8-萘啶-2-胺和核酸外切酶Exo III如权利要求1-9任一项所述。
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