CN101260432A - 利用s1酶切割单链核酸特性的rna定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种利用S1酶切割单链核酸特性的RNA定量检测方法，主要包括以下步骤：首先，将合适浓度的捕获探针固定于预先包被有链亲和素的酶标板上，备用；然后，超声裂解细胞释放胞内RNA，加入信号探针与目标RNA杂交；杂交后加入S1酶切割单链RNA、DNA和RNA/信号探针杂交体中的单链部分，剩下完全互补的目标RNA/信号探针杂交体；变性剩余的杂交体后捕获探针与信号探针杂交，再利用辣根过氧化物酶放大信号。本发明操作简单，特异性强，在常规的实验条件下即可完成对RNA的定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种检测方法，具体是一种利用S1酶切割单链核酸特性的RNA定量检测方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
发展一种能够快速、灵敏、可靠基因检测方法得到了越来越多的重视。传统的Northern杂交和狭缝杂交需要太长的时间，同时操作十分复杂。近年来发展起来的基因芯片技术，尽管能够高通量的检测基因表达，但是是一种成本很高的方法。荧光定量PCR技术具有很高的检测灵敏度，它需要纯化质量非常高的RNA，不然会抑制后续的反转录和PCR反应。三明治杂交技术检测快速，甚至无需核酸纯化，在检测的特异性方面有所欠缺。
S1酶是一种从米曲霉Asperillus oryzae分离出来的单链特异性核酸内切酶，分子量为32KD，在低pH值环境(pH值4～4.5)作用，需Zn2+参加。热稳定性好，在底物存在的条件下，65-70℃还有活性。一般仅作用于单链DNA或RNA，或双链核酸中的单链区，产生带5′-磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。具有高度的单链切割特异性，广泛用于SNP(单核苷酸多态性)的检测。
经对现有技术的文献检索发现，中国专利公开号：CN 100352937C，发明名称：对藻类进行定性与定量分析的方法，该发明提出了一种针对rRNA的S1酶保护分析探针和夹心杂交技术，用来检测海洋藻类的种类和数量，但是该方法所用到的夹心杂交技术步骤比较繁琐，而且所采用的探针数量多，增加了检测成本。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用S1酶切割单链核酸特性的RNA定量检测方法，使其利用S1酶的单链切割特性，开发了一种无需RNA纯化，具有高度特异性的RNA快速检测方法。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明具体包括以下步骤：
第一步：捕获探针固定：将5’端标记有生物素的捕获探针固定于预先包被有链亲和素的酶标板上。此一步骤的关键是固定的捕获探针的量要适中，太少的探针会导致检测信号太小，监测范围减小；太多的捕获探针会造成材料的浪费，同时捕获探针之间会有一定程度的结合，对检测不利。本发明固定的捕获探针的浓度在5nM-50nM。
捕获探针与信号探针是一对互补探针，其长度在于35nt-45nt。探针长度增加会延长杂交时间，探针长度太短不能保证足够的特异性。信号探针与目标RNA的某一特定区域互补。信号探针和捕获探针的5’或3’端带有标记物，常用的标记物有(但不限于)：地高辛、生物素、荧光素等。
第二步：细胞破碎和胞内RNA的释放：本发明采用超声破碎法。由于在细胞破碎的过程中，会引起内源RNA酶的释放，需要抑制这些酶的活性，同时又不能引起后续S1酶活性的丧失。故在裂解杂交液中加入了甲酰胺，用于变性RNA酶，同时在裂解液中还加入了酵母tRNA，双重保护目标RNA不被降解。
本发明使用的裂解杂交液，其组成成分是80％甲酰胺(体积比)，400mM的NaCl(氯化钠)，5mM的Na2EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，1％的SDS(十二烷基磺酸钠)以及0.5％的酵母tRNA。加入的甲酰胺能使RNA酶失活，加入的酵母tRNA能进一步保护目标RNA不被降解，加入的Na2EDTA能结合体系中的重金属离子，加入的NaCl和SDS有利于信号探针与目标RNA的杂交。
所述的裂解杂交液是指菌体超声破碎和信号探针与目标RNA杂交的溶液环境。
第三步：信号探针与目标RNA杂交：取超声破碎后的裂解杂交液，加入信号探针，变性后杂交。
所述变性后杂交，是指在94℃变性5min后杂交。
第四步：S1酶消化多余探针：杂交完成后，加入S1酶消化液。由于杂交的环境不适合S1酶消化，需要对S1酶消化液进行优化，使得S1酶消化液加入体系后，溶液体系适合S1酶的消化。由于S1酶切割单链核酸的特性，S1酶能将体系中的游离信号探针、RNA以及RNA/信号探针杂交体的单链部分切割，剩下与目标RNA完全杂交的目标RNA/信号探针杂交体。
所述的S1酶消化液，是指含有S1酶的，加入到杂交后的溶液中消化游离信号探针、RNA以及RNA/信号探针杂交体的单链部分，是本发明的关键。优化后的S1酶消化液组成如下：2U/μl的S1酶，25mM的ZnSO4，50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH4.2。
第五步：捕获探针与信号探针结合：S1酶消化反应完成后，往体系中加入变性液，变性解离目标RNA/信号探针杂交体。将变性后的溶液加入到第一步固定好捕获探针的酶标板中进行捕获探针与信号探针的杂交反应。
所述变性液，其组成为：62.5mM氢氧化钠，30mM Na2EDTA、149mM Na2HPO4和351mM NaH2PO4，pH 7.2。
第六步：信号检测：第五步杂交完成后，利用辣根过氧化物酶催化的显色反应来放大信号。即：PBST(用含0.5％的土温-20的磷酸缓冲液)洗涤酶标板，然后加入辣根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体与信号探针上标记的FAM(荧光素)结合。PBST洗涤后加入TMB(3，3’5，5’-四甲基联苯胺二盐酸)显色液进行显色反应。反应终止后进行信号检测。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：1)方法简单，易于操作：本发明不需要昂贵的仪器和试剂，利用常规的实验设备即可完成检测；2)检测特异性高：由于引入了S1酶，本发明具有很高的特异性；3)结果稳定。
本发明实施例所使用的荧光假单胞菌M18，已在中国专利局指定的保藏单位：北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCCNO.0462，2000.6.27。
附图说明
图1为本发明的流程图；
图2为捕获探针浓度的优化；
图3为本发明检测荧光假单胞菌M18的16s RNA的检测极限和线性范围；
图4为本发明检测荧光假单胞菌M18的16s RNA在不同生长时期含量的变化。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
如图1所示，本发明实施的原理图，以下实施例根据附图中的流程进行实施。
实施例1
不同浓度的捕获探针对检测信号的影响：
1.1、设计针对荧光假单胞菌的信号探针和捕获探针：
在NCBI搜索AY394845的序列，得到AY394845，Pseudomonas sp.M18 16Sribosomal RNA gene，partial sequence.将所得序列输入到软件primerprimier 5中，进行探针搜索，设定探针长度为40+-3bp(其他参数默认)，在所得探针中按照rating从高到低选择GC含量在40-60％的探针，得到39个碱基的针对M1816s RNA的探针：
捕获探针：
5’-(biotin)-AGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCG
信号探针：
5’-(FAM)-CGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCT
1.2、捕获探针固定：
将用磷酸缓冲液分别稀释得到浓度为的0.1nM、1nM、5nM、10nM和50nM的捕获探针，分别取100μl加入到预先包被有链亲和素的酶标板中，37℃、200rpm结合2小时，用磷酸缓冲液冲洗3次，4℃保存备用。
1.3、稀释信号探针：
用1∶1∶5的裂解杂交液、S1酶消化缓冲液(25mM的ZnSO4，50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH4.2)和变性液稀释信号探针，得到浓度为1nM、100pM、10pM、1pM、0.1pM的信号探针。
1.4、信号探针与捕获探针杂交：
取100μl的稀释好的各浓度信号探针，加入到固定有不同浓度捕获探针的酶标板中，50℃、200rpm反应30分钟，PBST洗5次。
1.5、信号检测：
将腊根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体(1∶5000用含5％绵羊血清的生理盐水稀世)100μl加入到酶标板中，37℃、200rpm反应30分钟，PBST洗5次。加入100μl的TMB显色液，37℃、200rpm反应15分钟，迅速用100μl的1M的硫酸终止反应。用酶标仪于450nm/630nm双波长检测信号。
1.6、检测结果：
如图2所示，固定的捕获探针浓度为0.1nM和1nM时，检测信号偏小，5nM、10nM、50nM的检测信号接近。所以，固定5nM-50nM的捕获探针都可以。
实施例2
荧光假单胞菌M18的16s RNA的检测极限和线性范围(所用荧光假单胞菌株M18，已在中国专利局指定的保藏单位：北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC NO.0462，2000.6.27)：
2.1、设计针对荧光假单胞菌的信号探针和捕获探针：
在NCBI搜索AY394845的序列，得到AY394845，Pseudomonas sp.M18 16Sribosomal RNA gene，partial sequence.将所得序列输入到软件primerprimier 5中，进行探针搜索，设定探针长度为40+-3bp(其他参数默认)，在所得探针中按照rating从高到低选择GC含量在40-60％的探针，得到39个碱基的针对M18 16s RNA的探针：
捕获探针：
5’-(biotin)-AGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCG
信号探针：
5’-(FAM)-CGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCT2.2.2、平板计数法
检测液体培养24小时的M18菌体的浓度：
将菌液用0.7％的生理盐水进行1/10稀释到10-7，取0.1ml进行平板涂布。每个浓度涂5块板。28℃，24小时培养后，除去菌落数最多和最少的两块平板，剩下的3块平板取平均值，得到菌液浓度为2.5×1010CFU/ml。
2.3、捕获探针固定：
将用磷酸缓冲液稀释的5nM的捕获探针100μl加入到预先包被有链亲和素的酶标板中，37℃、200rpm结合2小时，用磷酸缓冲液冲洗3次，4℃保存备用。
2.4、菌体破碎：
取1mlKB培养基液体培养24小时的M18菌液，8000rpm离心5分钟后，倒去上清，加入5ml的裂解杂交液(80％的甲酰胺，400mM的氯化钠，5mM的Na2EDTA，1％的SDS，0.5％的酵母tRNA，pH为6.4)重新悬浮细胞，超声4分钟破碎菌体。取1ml的菌体裂解液用裂解杂交液依次1/2稀释到2-10，另设一裂解杂交液的空白对照。
2.5、信号探针与目标RNA的杂交：
取各种稀释度的菌体裂解液90μl(三组平行实验)加入10μl的100nM的信号探针，95℃变性5分钟，37℃杂交2小时。
2.6、S1酶消化：
各管加入100μl的S1酶消化液(2U/μl的S1酶)消化1小时，加入500μl的终止液(62.5mM氢氧化钠，30mM Na2EDTA、149mM Na2HPO4和351mM NaH2PO4，pH 7.2)终止反应。94℃变性10分钟解离目标RNA/信号探针杂交体。
2.7、捕获探针和信号探针的结合：
取200μl的1.6步骤的反应液，加入到1.3固定有捕获探针的酶标板中，50℃、200rpm反应30分钟，PBST洗5次。
2.8、信号检测：
将腊根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体(1∶5000用含5％绵羊血清的生理盐水稀世)100μl加入到酶标板中，37℃、200rpm反应30分钟，PBST洗5次。加入100μl的TMB显色液，37℃、200rpm反应15分钟，迅速用100μl的1M的硫酸终止反应。用酶标仪于450nm/630nm双波长检测信号。
2.9、检测结果：
检测结果如图3所示，检测的线性范围在0.71×106-22.0×106个细胞，检测极限为0.71×106个细胞。
实施例3
荧光假单胞菌M18不同生长时期的16s RNA含量的测定：
3.1、菌体培养和平板计数：
将平板活化后的M18菌株接种到100ml的KB液体培养基中，28℃、160rpm摇床培养，分别于12小时、24小时、36小时以及60小时用平板计数法检测菌体浓度以及液氮速冻保存菌体。利用平板计数法测得的菌体浓度分别为0.97×1010CFU/ml、2.5×1010CFU/ml、7.4×1010CFU/ml和9.5×1010CFU/ml。
3.2、捕获探针固定：
将用磷酸缓冲液稀释的5nM的捕获探针100μl加入到预先包被有链亲和素的酶标板中，37℃、200rpm结合2小时，用磷酸缓冲液冲洗3次，4℃保存备用。
3.3、菌体破碎：
取一份-70℃保存的液体培养12小时的M18菌体(由1ml的菌液离心所得)，加入1.94ml的裂解杂交液重新悬浮细胞，超声4分钟破碎菌体；
取一份-70℃保存的液体培养24小时的M18菌体(由1ml的菌液离心所得)，加入5ml的裂解杂交液重新悬浮细胞，超声4分钟破碎菌体；
取一份-70℃保存的液体培养12小时的M18菌体(由1ml的菌液离心所得)，加入14.8ml的裂解杂交液重新悬浮细胞，取5ml进行超声4分钟破碎菌体；
取一份-70℃保存的液体培养12小时的M18菌体(由1ml的菌液离心所得)，加入19ml的裂解杂交液重新悬浮细胞，取5ml进行超声4分钟破碎菌体。
3.4、信号探针与目标RNA的杂交：
将上述菌体破碎液用裂解杂交液稀释到5.0×108/ml，取90μl加入10μl的100nM的信号探针，95℃变性5分钟，37℃杂交2小时。
3.5、S1酶消化：
各管加入100μl的S1酶消化液(2U/μl的S1酶)消化1小时，加入500μl的终止液(62.5mM氢氧化钠，30mM Na2EDTA、149mM Na2HPO4和351mM NaH2PO4，pH 7.2)终止反应。94℃变性10分钟解离目标RNA/信号探针杂交体。
3.6、捕获探针和信号探针的结合：
取200μl的2.5步骤地反应液，加入到2.2固定有捕获探针的酶标板中，50℃、200rpm反应30分钟，PBST洗5次。
3.7、信号检测：
将腊根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体(1∶5000用含5％绵羊血清的生理盐水稀世)100μl加入到酶标板中，37℃、200rpm反应30分钟，PBST洗5次。加入100μl的TMB显色液，37℃、200rpm反应15分钟，迅速用100μl的1M的硫酸终止反应。用酶标仪于450nm/630nm双波长检测信号。
3.8、检测结果：
检测结果如图4所示，M18液体培养12小时、24小时、36小时和60小时后的单位细菌的16s RNA含量的比值为1.938∶1.346∶0.754∶0.554。
Claims (10)
1、一种利用S1酶切割单链核酸特性的RNA定量检测方法，其特征在于包括如下步骤：
第一步：捕获探针的固定：将5’端标记有生物素的捕获探针固定于预先包被有链亲和素的酶标板上；
第二步：细胞破碎和胞内RNA的释放：采用超声破碎法，在裂解杂交液中加入甲酰胺和酵母tRNA，使裂解杂交液能够失活RNA酶，保护目标RNA不被降解，同时不会引起后续S1酶的活性丧失；
第三步：信号探针与目标RNA杂交：取超声破碎后的裂解杂交液，加入信号探针，变性后杂交；
第四步：S1酶消化多余探针：第三步杂交完成后，加入S1酶消化液，S1酶能够将游离的信号探针、RNA以及RNA/信号探针杂交体的单链部分消化，剩下与目标RNA完全互补的RNA/信号探针杂交体；
第五步：捕获探针与信号探针结合：S1酶消化反应完成后，往体系中加入变性液，变性解离目标RNA/信号探针杂交体，将变性后的溶液加入到第一步固定好捕获探针的酶标板中进行捕获探针与信号探针的杂交反应；
第六步：信号检测：第五步杂交完成后，利用辣根过氧化物酶催化的显色反应来放大信号。
2、如权利要求1所述的利用S1酶切割单链核酸特性的RNA定量检测方法，其特征是，第一步中，固定的捕获探针的浓度在5nM-50nM。
3、如权利要求1或2所述的利用S1酶切割单链核酸特性的RNA定量检测方法，其特征是，第一步中，捕获探针与信号探针是一对互补探针，其长度在于35nt-45nt，信号探针和捕获探针的5’或3’端带有标记物，标记物为地高辛、生物素、荧光素中的一种。
4、如权利要求1所述的利用S1酶切割单链核酸特性的RNA定量检测方法，其特征是，所述的裂解杂交液是指菌体超声破碎和信号探针与目标RNA杂交的溶液环境。
5、如权利要求1或4所述的利用S1酶切割单链核酸特性的RNA定量检测方法，其特征是，第二步中，所述裂解杂交液，其组成成分是：80％体积比的甲酰胺，400mM的氯化钠，5mM的Na2EDTA，1％的十二烷基磺酸钠以及0.5％的酵母tRNA。
6、如权利要求1所述的利用S1酶切割单链核酸特性的RNA定量检测方法，其特征是，第三步中，所述变性后杂交，是指在95℃变性5min后杂交。
7、如权利要求1所述的利用S1酶切割单链核酸特性的RNA定量检测方法，其特征是，第四步中，所述的S1酶消化液，是指含有S1酶的，加入到杂交后的溶液中消化游离信号探针、RNA以及RNA/信号探针杂交体的单链部分。
8、如权利要求1或7所述的利用S1酶切割单链核酸特性的RNA定量检测方法，其特征是，第四步中，所述的S1酶消化液，其组成如下：2U/μl的S1酶，25mM的ZnSO4，50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH4.2。
9、如权利要求1所述的利用S1酶切割单链核酸特性的RNA定量检测方法，其特征是，第五步中，所述变性液，其组成为：62.5mM氢氧化钠，30mM Na2EDTA、149mM Na2HPO4和351mM NaH2PO4，pH 7.2。
10、如权利要求1所述的利用S1酶切割单链核酸特性的RNA定量检测方法，其特征是，第六步中，信号检测具体操作为：用含0.5％的土温-20的磷酸缓冲液洗涤酶标板，然后加入辣根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体与信号探针上标记的荧光素结合，用含0.5％的土温-20的磷酸缓冲液洗涤后加入TMB显色液进行显色反应，反应终止后进行信号检测。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101942513A (zh) * | 2010-08-27 | 2011-01-12 | 深圳博尔美生物科技有限公司 | 生物芯片及其制备方法 |
| CN102010911A (zh) * | 2010-11-29 | 2011-04-13 | 深圳博睿祥晖生物技术有限公司 | 检测靶dna序列的方法和采用该方法的基因芯片及应用 |
| CN102250876A (zh) * | 2011-05-18 | 2011-11-23 | 李学敬 | 从生物材料中分离纯化rna的方法 |
| CN105734115A (zh) * | 2014-01-08 | 2016-07-06 | 江南大学 | 一组用于检测假单胞属（Pseudomonas）细菌的探针组合物 |
| CN106119371A (zh) * | 2016-06-12 | 2016-11-16 | 深圳市人民医院 | 一种利用单链特异性核酸酶检测microRNA含量的方法 |
| CN110462059A (zh) * | 2017-01-19 | 2019-11-15 | 新加坡科技研究局 | 用于核酸样品标准化的方法 |
-
2008
- 2008-04-10 CN CNA2008100358317A patent/CN101260432A/zh active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101942513A (zh) * | 2010-08-27 | 2011-01-12 | 深圳博尔美生物科技有限公司 | 生物芯片及其制备方法 |
| CN102010911A (zh) * | 2010-11-29 | 2011-04-13 | 深圳博睿祥晖生物技术有限公司 | 检测靶dna序列的方法和采用该方法的基因芯片及应用 |
| CN102250876A (zh) * | 2011-05-18 | 2011-11-23 | 李学敬 | 从生物材料中分离纯化rna的方法 |
| CN102250876B (zh) * | 2011-05-18 | 2014-08-13 | 李学敬 | 从生物材料中分离纯化rna的方法 |
| CN105734115A (zh) * | 2014-01-08 | 2016-07-06 | 江南大学 | 一组用于检测假单胞属（Pseudomonas）细菌的探针组合物 |
| CN105734115B (zh) * | 2014-01-08 | 2020-04-17 | 江南大学 | 一组用于检测假单胞属（Pseudomonas）细菌的探针组合物 |
| CN106119371A (zh) * | 2016-06-12 | 2016-11-16 | 深圳市人民医院 | 一种利用单链特异性核酸酶检测microRNA含量的方法 |
| CN110462059A (zh) * | 2017-01-19 | 2019-11-15 | 新加坡科技研究局 | 用于核酸样品标准化的方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080910 |