CN105734115B

CN105734115B - 一组用于检测假单胞属（Pseudomonas）细菌的探针组合物

Info

Publication number: CN105734115B
Application number: CN201410007430.6A
Authority: CN
Inventors: 杨海麟; 王武; 辛瑜; 夏小乐; 张玲; 杨继伟; 梁洪杰
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-01-08
Filing date: 2014-01-08
Publication date: 2020-04-17
Anticipated expiration: 2034-01-08
Also published as: CN105734115A

Abstract

一组用于检测假单胞菌属（Pseudomonas）细菌的探针组合物，属于核酸检测技术领域。该探针组合物由三种寡核苷酸探针组成，分析探针具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；捕获探针具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，在3´端有生物素标记；信号探针具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，在5´端有异硫氰酸(FITC)标记。该探针组合物具有生物信息学特异性，能够较好地区分假单胞菌、丛毛单胞菌、气单胞菌、不动杆菌、芽孢杆菌和大肠杆菌；探针定量的线性范围是7.08×10³～6.31×10⁶cells/mL，线性方程为y=0.373x‑0.962，R²=0.996，该探针组合物可用于假单胞属细菌的定性定量分析。

Description

一组用于检测假单胞属（Pseudomonas）细菌的探针组合物

技术领域

本发明涉及一组用于检测假单胞属（Pseudomonas）细菌的探针组合物，具体涉及利用一组分子探针进行DNA与RNA杂交及DNA与DNA杂交的核酸杂交，属于核酸检测技术领域。

背景技术

假单胞属细菌普遍存在于土壤及水环境中，是一类革兰氏阴性无芽孢杆菌，其中的一些种具有条件致病性。现有研究结果表明，在污水的生物处理过程中，假单细胞属的某些种能够消耗污水中的含氮磷化合物，具有降低水体氮磷含量，净化污水的作用。由于污水体系复杂，多种微生物共存，因此，如何确定处理体系中脱氮除磷菌的含量显得尤为重要。

现阶段对污水生物处理不同阶段脱氮除磷微生物的研究主要集中在强化生物除磷系统（EBPR）方面，多采用和PCR相关的技术。但是，定时定量PCR技术、DGGE-PCR技术都存在价格昂贵，对DNA纯化效率有很高的要求，重复性难等问题。

根据文献报道，双特异分子探针技术在海洋有害藻类的定性定量分析方面已取得显著成果，且该方法操作简单，成本低。本发明成功将双特异分子探针技术用于假单胞属细菌的定量分析，因此，需要提供一种假单胞属细菌检测探针组合物。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种假单胞属细菌检测探针组合物，该假单胞属细菌检测探针组合物设计巧妙，可以快速定性定量检测假单胞属细菌，且检测方法操作简单、重复性好，适于大规模推广应用。

本发明的技术方案：提供了一种假单胞属（Pseudomonas）细菌检测探针组合物，该探针组合物由三种寡核苷酸探针组成，用于特异性结合假单胞属细菌的rRNA分析探针SEQID NO:1；用于结合在载体上并与所述分析探针特异性结合的捕获探针SEQ ID NO:2，在5´端有生物素标记；以及用于与所述分析探针特异性结合的信号探针SEQ ID NO:3，在3´端有异硫氰酸FITC标记；检测信号与污水中假单胞属细菌数目呈现线性关系R²=0.996，用于污水中假单胞属细菌的定性及定量检测。

所述分析探针可以具有任何合适的序列，其与假单胞属细菌的rRNA特异性结合，较佳地，所述分析探针具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。长度为57bp，生物信息学比对结果显示该分析探针序列只与假单胞属细菌的16S rRNA序列互补，与其他菌属没有同源性。

所述捕获探针可以具有任何合适的序列，其与所述分析探针特异性结合，可以根据所述分析探针进行设计，较佳地，所述捕获探针具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。所述捕获探针可以通过任何方式固定在载体上，较佳地，所述捕获探针具有生物素标记。长度为21bp，其5´端标记有生物素。

所述信号探针可以具有任何合适的序列，其与所述分析探针特异性结合，可以根据所述分析探针进行设计，较佳地，所述信号探针具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。长度为20bp，其3´端标记有异硫氰酸FITC。

所述蛋白标记可以是任何合适的蛋白，较佳地，所述蛋白标记是荧光素标记。

本发明采用上述的假单胞属细菌检测探针组合物检测假单胞属细菌，并具体包括以下步骤：

（1）将所述分析探针与所述rRNA杂交得到杂交产物：分析探针与rRNA分子杂交后形成DNA／RNA杂合体；

（2）在所述DNA／RNA杂合体产物中加入核酸S1酶消化处理得到消化产物：在S1酶的作用下，单链的DNA或RNA以及DNA／RNA杂合体的不匹配部分被消化，留下与目标RNA分子数量上相等的DNA／RNA杂合体；

（3）对所述消化产物进行变性处理得到变性产物：将DNA/RNA杂合体变性为DNA单链和RNA单链，变性方法可以采用该领域常用变性技术，例如热变性方法，这是因为单链RNA非常不稳定，很容易被RNA酶降解掉；

（4）将所述变性产物与固定在载体上的所述捕获探针杂交，然后洗涤；杂交后形成DNA/DNA杂合体，洗涤是为了除去非特异性吸附；

（5）加入所述信号探针与所述分析探针杂交，然后洗涤；杂交后形成“三明治”杂交复合体，洗涤同样是为了除去非特异性吸附；

（6）加入带酶标记的抗所述蛋白标记的抗体与所述蛋白标记进行杂交，然后洗涤；

（7）加入所述酶标记的底物以显色。

所述捕获探针可以通过任何方式固定在载体上，较佳地，所述捕获探针通过生物素-链霉亲和素相互作用固定在所述载体上。

所述蛋白标记可以是任何合适的蛋白，较佳地，所述蛋白标记是荧光素标记，所述抗体是抗荧光素标记的抗体。

所述酶标记可以是任何合适的酶，较佳地，所述酶标记是辣根过氧化物酶标记，所述底物是四甲基联苯胺。酶和底物组成显色系统，显然，显色系统还可以采用其它显色系统，例如邻苯二胺等。

本发明的有益效果：

（1）特异性好：由于污水处理系统中成分复杂，假单胞属细菌也只是其中的一部分，且在污水处理的不同阶段其数量会发生变化。现有的研究方法主要集中在定性研究方面，而定量研究较少，但是假单胞菌的数量多少对污水氮磷去除率有很大影响。本发明采用分析探针可以特异性识别靶序列，最后通过一系列反应显色，建立吸光度与菌浓之间的标准曲线，准确度可达90%以上，大大提高了检测精准度。

（2）稳定性高：由于检测过程中设计的分析探针会将细菌体内不稳定的RNA信号转化为等量的DNA信号，将保证RNA分子在整个过程不被降解，其他步骤均是针对DNA进行的，从而大大提高了检测的稳定性。

（3）价格便宜：对设备要求低，仅需水浴锅，摇床，离心机，酶标仪等常规仪器，而且优化检测条件后，平均每个样品检测时间短，耗去材料药品费用非常低，非常适用于工业化检测。

附图说明

图1是采用本发明的假单胞属细菌检测探针组合物对污水中存在的不同细菌检测显色结果。

图2是采用本发明的假单胞属细菌检测探针组合物对假单胞属细菌检测的标准曲线。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，目的在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。在本实施例中，采用特异性探针对城市污水处理中脱氮除磷菌进行检测，制作其标准曲线，并对其特异性进行验证。

1、假单胞属细菌16rRNA特定区域探针的设计与合成：

将假单胞属细菌16rRNA序列与其他污水细菌序列进行比对，找到与假单胞菌属所有种都能互补，而与其他主要污水细菌核苷酸无同源性，确定为特征区域，设计分析探针为：

SEQ ID NO:1：

5’-CGGCTAGTTG ACATCGTTTA CGGCGTGGAC TACCAGGGTA TCTAATCCTG TTTGCTC -3’（见SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列）；

根据上述探针设计合成检测所需其他探针：

捕获探针为SEQ ID NO:2：

5’-GAGCAAACAG GATTAGATAC C-3’（见SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列），与分析探针的3'端互补，在5'端有生物素(Biotin)标记；

信号探针为SEQ ID NO:3：

5’-TAAACGATGT CAACTAGCCG-3’（见SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列），与分析探针的5'端互补，在3'端有异硫氰酸FITC标记。

2、准备阶段：

亲和素包被板制备：

链霉亲和素用包被液（CBS）配成5μg/mL，向微孔板各孔内加入100μL，用封口膜封好后于4℃过夜，次日取出，用PBST(含0.5%Tween-20的0.01mol/L的PBS缓冲液 )洗涤液洗涤3次，再用0.1% BSA（含0.01mol/L PBS溶液，pH为7.2）250μL，在37℃下封闭60min，最后用PBST洗涤液洗涤3次，干燥后封好于4℃下保存待用，可保存2月。

捕获探针固定化：

取捕获探针，溶于pH 7.2的PBS中，得到500nmol/L的捕获探针溶液，取100μL捕获探针溶液加入链霉素包被微孔板，于37℃下保温2h，并用洗涤液PBST冲洗3次，随后储存于4℃下。

细菌胞内物质获取：

取对数期假单胞菌（以恶臭假单胞菌Pseudomonas putita为实验菌）显微镜计数计算菌浓，取2mL离心（2000r/min,2min），取上清液离心(12000r/min,10min)，除去上清液，加2mL裂解缓冲液（80%甲酰胺，450mM NaCl，5mM Na₂EDTA，1mg/mL yeast tRNA，1% SDS，pH6.4）并超声破碎（50%占空比，共8min），收集滤液待用。

进行假单胞菌的检测曲线分析时，将过滤收集到的假单胞菌样品用含有S1酶保护分析探针的裂解液5倍逐级稀释7次共获得8个样品。

进行假单胞菌的特异性验证时，将其他污水细菌，如气单胞菌、丛毛单胞属、芽孢杆菌属10⁵个细胞分别进行上述处理作为对照。

3、RNA信号转化阶段：

分析探针与目标序列结合：

加入100μL假单胞菌样品，50μL矿物油，15μL 500nmol/L的分析探针（采用上述裂解缓冲液稀释），95℃水浴处理15 min，30℃水浴处理1h。

核酸S1酶消化处理：

加入100μL的核酸S1酶（100U溶于1.4M NaCl，22.5mM ZnSO₄、250mM CH₃COONa、pH4.5的溶液中)，37℃水浴处理1h。

DNA/RNA变性反应：

加入500μL终止缓冲液(62.5mM NaOH、30mM EDTA、0.5M PBS、pH7.2), 95℃处理15min，DNA-RNA杂合体变性形成单链DNA和单链RNA。与此同时，单链RNA被降解，因此溶液中仅含结合于靶序列的分析探针。

4、夹心杂交阶段：

捕获探针捕获分析探针：

将100μL上述反应混合液分别移入到预固定有捕获探针的酶标板微孔中，43℃杂交1h，然后用pH7.2、0.01mol/L的PBS缓冲液洗涤三次。

形成三明治杂交：

每孔加入含有100μL 500nM连接探针的杂交缓冲液(4×SSC、10%甲酰胺、0.02%SDS、pH7.2),于43℃杂交30 min，用0.1mol/L，pH7.2 的PBS洗涤三次。

5、信号检测阶段

抗荧光素抗体结合信号探针：

每孔加入100μL含有标记了辣根过氧化物酶的抗荧光素抗体（1︰6000稀释于PBS，0.1%牛血清白蛋白），37℃保温30 min，然后用PBS洗4次。

显色：

每孔加入TMB显色液 (用无水乙醇，将TMB配成1% 浓度，4℃保存半年以内使用。使用前，用pH 5.0磷酸-柠檬酸缓冲液9.9mL加入0.1mL 1%TMB液，再按每毫升TMB加入30%的H₂O₂1μL，混匀后立即使用) 100μL, 37℃处理15 min后，每孔加入100μL 2mol/L硫酸终止反应。将酶标板置于读板机上于450nm和630nm测定光吸收值。

6、结果

检侧结果如图1和图2所示。

图1显示了用针对假单胞菌的检测探针组合物探测各种污水细菌的检测结果，证明了本发明方法具有极高的可行性和特异性。

图2为探针组合物对假单胞菌的检测得到的标准曲线公式，即检测公式如下：

y= 0.373x-0.962；

R²=0.996（n=5）；

x为样品中假单胞菌的细胞数的自然对数，y为450nm和630nm实际测定的OD之差，R为相关系数。

本实施例方法测定的假单胞菌样品数量与显微计数结果的比较如表1所示。

表1

因此，采用本发明的假单胞菌检测探针组合物，可以对假单胞菌定性定量检测，首先提取16SrRNA靶序列，分析探针预期杂交，核酸S1酶去除错配以及单链DNA，变性后与以固定在孔上的捕获探针杂交，最后与带有荧光物质的信号探针杂交，通过蛋白大分子的特异性与抗体结合，最后在显色系统，如四甲基联苯胺，邻苯二胺等显色，然后读出检测信号，即可确定rRNA的种类和数量。

综上所述，本发明的该假单胞菌检测探针组合物设计巧妙，可以快速定性定量检测假单胞菌，且检测方法操作简单、重复性好，适于大规模推广应用。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

<160> 3

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)...(57)

<223> 特异性结合假单胞菌的rRNA的分析探针的核苷酸序列

<400> 1

cggctagttg acatcgttta cggcgtggac taccagggta tctaatcctg tttgctc 57

<210> SEQ ID NO:2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)...(21)

<223> 特异性结合分析探针的捕获探针的核苷酸序列

<400> 2

gagcaaacag gattagatac c 21

<210> SEQ ID NO:3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)...(20)

<223> 特异性结合分析探针的信号探针的核苷酸序列

<400> 3

taaacgatgt caactagccg 20

Claims

1.一种用于检测假单胞属（Pseudomonas）细菌的探针组合物，其特征在于该探针组合物由三种寡核苷酸探针组成，用于特异性结合假单胞属细菌的rRNA分析探针SEQ ID NO:1；用于结合在载体上并与所述分析探针特异性结合的捕获探针SEQ ID NO:2，在5´端有生物素标记；以及用于与所述分析探针特异性结合的信号探针SEQ ID NO:3，在3´端有异硫氰酸FITC标记；检测信号与污水中假单胞属细菌数目呈现线性关系R²=0.996，用于污水中假单胞属细菌的定性及定量检测。

2.根据权利要求1所述的用于检测假单胞属（Pseudomonas）细菌的探针组合物，其特征在于：分析探针核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，长度为57bp，生物信息学比对结果显示该分析探针序列只与假单胞属细菌的16S rRNA序列互补，与其他菌属没有同源性。

3.根据权利要求1所述的用于检测假单胞属（Pseudomonas）细菌的探针组合物，其特征在于：所述捕获探针核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，长度为21bp，其5´端标记有生物素。

4.根据权利要求1所述的用于检测假单胞属（Pseudomonas）细菌的探针组合物，其特征在于：所述信号探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，长度为20bp，其3´端标记有异硫氰酸FITC。