CN102839210A - 氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物及相关检测方法 - Google Patents
氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物及相关检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102839210A CN102839210A CN2011101698534A CN201110169853A CN102839210A CN 102839210 A CN102839210 A CN 102839210A CN 2011101698534 A CN2011101698534 A CN 2011101698534A CN 201110169853 A CN201110169853 A CN 201110169853A CN 102839210 A CN102839210 A CN 102839210A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- thiobacillus ferrooxidant
- detection
- analysis
- thiobacillus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，包括用于特异性结合氧化亚铁硫杆菌的rRNA的分析探针、用于结合在载体上并与分析探针特异性结合的捕获探针以及用于与分析探针特异性结合的信号探针，所述信号探针具有蛋白标记，较佳地，分析探针具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，捕获探针具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，捕获探针具有生物素标记，信号探针具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，蛋白标记是荧光素标记。还提供了一种氧化亚铁硫杆菌检测方法。本发明的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物设计巧妙，可以快速定性定量检测氧化亚铁硫杆菌，且检测方法操作简单、重复性好，适于大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及细菌检测技术领域，更具体地，涉及浸矿细菌检测技术领域，特别是指一种氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物及相关检测方法。
背景技术
氧化亚铁硫杆菌是一种嗜酸硫杆菌，属于极端微生物，在大多浸出场所的都是主要菌种对细菌浸出起主要作用。由于在大型的生物浸矿现场，浸矿作用是由多种菌混合共同作用，由于浸矿的不同阶段对条件控制的变化会导致菌群的变化，必然会对浸矿效率产生影响。但是现阶段对生物浸矿菌群变化研究相对较少，研究方法仅局限于显微镜，PCR技术等，各个方法均具有一定的优点和局限性，例如显微镜计数分析难度较大、费时较长，对操作人员的要求较高，而且在浸矿过程中，很难排除亲缘关系较近的菌种，定性效果不好；定时定量PCR技术价格昂贵，对DNA纯化效率有很高的要求，重复性难等。
虽然国内近年来有报道用改进的三明治杂交方法对藻类进行定性定量检测，但是由于生物浸矿现场浸矿样液混浊、操作条件极端并且非常简陋，还尚未有对氧化亚铁硫杆菌的高效检测方法。
因此，需要提供一种氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，以快速定性定量检测氧化亚铁硫杆菌，且检测方法操作简单、重复性好。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物及相关检测方法，该氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物设计巧妙，可以快速定性定量检测氧化亚铁硫杆菌，且检测方法操作简单、重复性好，适于大规模推广应用。
为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，其特点是，包括用于特异性结合氧化亚铁硫杆菌的rRNA的分析探针、用于结合在载体上并与所述分析探针特异性结合的捕获探针以及用于与所述分析探针特异性结合的信号探针，所述信号探针具有蛋白标记。
所述分析探针可以具有任何合适的序列，其与氧化亚铁硫杆菌的rRNA特异性结合，较佳地，所述分析探针具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
所述捕获探针可以具有任何合适的序列，其与所述分析探针特异性结合，可以根据所述分析探针进行设计，较佳地，所述捕获探针具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
所述捕获探针可以通过任何方式固定在载体上，较佳地，所述捕获探针具有生物素标记。
所述信号探针可以具有任何合适的序列，其与所述分析探针特异性结合，可以根据所述分析探针进行设计，较佳地，所述信号探针具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
所述蛋白标记可以是任何合适的蛋白，较佳地，所述蛋白标记是荧光素标记。
在本发明的第二方面，提供了一种氧化亚铁硫杆菌检测方法，其特点是，采用上述的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物检测氧化亚铁硫杆菌，并具体包括以下步骤：
(1)将所述分析探针与所述rRNA杂交得到杂交产物；分析探针与rRNA分子杂交后形成DNA/RNA杂合体。
(2)在所述杂交产物中加入核酸S1酶消化处理得到消化产物；在S1酶的作用下，单链的DNA或RNA分予以及DNA/RNA杂合体的不匹配部分被消化，留下与目标RNA分子数量上相等的DNA/RNA杂合体；
(3)对所述消化产物进行变性处理得到变性产物；将DNA/RNA杂合体变性为DNA单链和RNA单链，变性方法可以采用该领域常用变性技术，例如热变性方法，由于单链RNA非常不稳定，很容易被RNA酶降解掉。
(4)将所述变性产物与固定在载体上的所述捕获探针杂交，然后洗涤；杂交后形成DNA/DNA杂合体，洗涤是为了除去非特异性吸附。
(5)加入所述信号探针与所述分析探针杂交，然后洗涤；杂交后形成“三明治”杂交复合体，洗涤同样是为了除去非特异性吸附。
(6)加入带酶标记的抗所述蛋白标记的抗体与所述蛋白标记进行杂交，然后洗涤；
(7)加入所述酶标记的底物以显色。
所述捕获探针可以通过任何方式固定在载体上，较佳地，所述捕获探针通过生物素-链霉亲和素相互作用固定在所述载体上。
所述蛋白标记可以是任何合适的蛋白，较佳地，所述蛋白标记是荧光素标记，所述抗体是抗荧光素标记的抗体。
所述酶标记可以是任何合适的酶，较佳地，所述酶标记是辣根过氧化物酶标记，所述底物是四甲基联苯胺。酶和底物组成显色系统，显然，显色系统还可以采用其它显色系统，例如邻苯二胺等。
本发明的有益效果具体在于：
(1)特异性好：由于工业浸矿现场环境恶劣，浸矿主要菌种一般为极端微生物，生长条件特殊，基于以上条件，国内对浸矿菌种检测非常困难，本发明采用分析探针可以特异性识别靶序列，最后通过一系列反应显色，建立吸光度与菌浓之间的标准曲线，准确度可达90％以上，大大提高了检测精准度。
(2)灵敏度好：最低检测线可达1000个/mL，自养型微生物体型较小，体内16SrRNA也相对较少，该分析探针灵敏度已经很高。
(3)稳定性高：由于检测过程中设计的分析探针会将细菌体内不稳定的RNA信号转化为等量的DNA信号，将保证RNA分子在整个过程不被降解，其他步骤均是针对DNA进行的，从而大大提高了检测的稳定性。
(4)价格便宜：对设备要求低，仅需水浴锅，摇床，离心机，酶标仪等常规仪器，而且优化检测条件后，平均每个样品检测时间段，耗去材料药品费用非常低，非常适用于工业化检测。
附图说明
图1是采用本发明的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物的一具体实施例对不同浸矿细菌检测显色结果。
图2是采用本发明的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物的一具体实施例对氧化亚硫杆菌检测的标准曲线。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，目的在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。在本实施例中，采用特异性探针对生物浸矿主要菌种氧化亚铁硫杆菌进行检测，制作其标准曲线，并对其特异性进行验证。
1.1氧化亚铁硫杆菌16SrRNA特定区域探针的设计与合成
将氧化亚铁硫杆菌16SrRNA序列与其他浸矿细菌序列进行比对，找到在896-965区域的核酸互补，而与其他主要浸矿细菌核苷酸无同源性，确定为特征区域，设计分析探针为：
5’-ATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTCCGGAATTCTGCAGAGAT-3’(见SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列)；
根据上述探针设计合成检测所需其他探针：
捕获探针为5’-ATCTCTGCAGAATTCCGGACATGTCAA-3’(见SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列)，与分析探针的3′端互补，在5′端有生物素(Biotin)标记；
信号探针为5’-TTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACAT-3’(见SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列)，与分析探针的5′端互补，在5′端有异硫氰酸(FITC)标记。
1.2准备阶段
1.2.1链霉亲和素包被板制备：
链霉亲和素用包被液配成5μg/ml，向微孔板各孔内加入100μl，用封口膜封好后于4℃过夜，次日取出，用PBST洗涤液洗涤3次，再用0.1％BSA(0.01mol/LPBS7.2)250ul，在37℃下封闭60min，最后用PBST洗涤液洗涤3次，干燥后封好于4℃下保存待用，可保存2月。
1.2.2捕获探针固定化：
100μl(500nM溶于pH 7.2PBS)捕获探针加入链霉素包被微孔板，于37℃下保温2h，并用洗涤液PBST冲洗3次，随后储存于4℃下。
1.2.3细菌胞内物质获取：
取对数期氧化亚铁硫杆菌显微镜计数计算菌浓，取2mL离心(2000r/min，2min)，取上清液离心(12000r/min，10min)，除去上清液，加2mL裂解缓冲液(80％甲酰胺，450mMNaCl，5mM Na2EDTA，1mg/ml yeast tRNA，1％SDS，pH 6.4)并超声破碎(50％占空比，共8min)，收集滤液待用。
进行氧化亚铁硫杆菌的检测曲线分析时，将过滤收集到的氧化亚铁硫杆菌样品用含有S1酶保护分析探针的裂解液10倍逐级稀释6次共获得7个样品。
进行氧化亚铁硫杆菌的特异性验证时，将其他浸矿细菌氧化硫硫杆菌、嗜酸喜温硫杆菌、氧化亚铁钩端螺旋菌、嗜酸硫杆菌A sp.106个细胞分别进行上述处理作为对照。
1.3RNA信号转化阶段
1.3.1分析探针与目标序列结合
加入100μL氧化亚铁硫杆菌样品，50μL矿物油，15μL500nmol/L的分析探针(采用上述裂解缓冲液稀释)，95℃水浴处理15分钟，37℃水浴处理1h。
1.3.2核酸S1酶消化处理
加入100μL的核酸S1酶(100U于1.4M NaCl，22.5mM ZnSO4、250mM CH3COONa、pH4.5)，40℃水浴处理30分钟。
1.3.3DNA/RNA变性反应
加入500μL终止缓冲液(62.5mM NaOH、30mM EDTA、0.5M PBS、pH7.2)，95℃处理15分钟，DNA-RNA杂合体变性形成单链DNA和单链RNA。与此同时，单链RNA被降解，因此溶液中仅含结合于靶序列的分析探针。
1.4夹心杂交阶段
1.4.1捕获探针捕获分析探针
将100μL上述反应混合液分别移入到预固定有捕获探针的酶标板微孔中，50℃杂交1小时，然后用0.01mol/L，PBS7.2的缓冲液洗涤三次。
1.4.2形成三明治杂交
每孔加入含有100μL 500nM连接探针的杂交缓冲液(4×SSC、10％甲酰胺、0.02％SDS、pH7.2)，于50℃杂交30分钟，用0.1mol/L，pH7.2PBS洗涤三次。
1.5信号检测阶段
1.5.1抗荧光素抗体结合信号探针
每孔加入100μL含有标记了辣根过氧化物酶的抗荧光素抗体(1∶5000稀释于PBS，0.1％牛血清白蛋白)，37℃保温30分钟，然后用PBS洗4次。
1.5.2显色
每孔加入TMB显色液(用无水乙醇，将TMB配成1％浓度，4℃保存半年以内使用。使用前，用pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲液9.9ml加入0.1ml 1％TMB液，再按每毫升TMB加入30％的H2O21ul，混匀后立即使用)100μL，37℃处理15分钟后，每孔加入100μL 2mol/L硫酸终止反应。将酶标板置于读板机上于450nm和630nm测定光吸收值。
1.6结果
检侧结果如图1和图2所示。
图1显示了用针对氧化亚铁硫杆菌的检测探针组合物探测各种浸矿细菌的检测结果，证明了本发明方法具有极高的可行性和特异性。
得到标准曲线公式，即检测公式如下：
y＝0.799x-0.204；
R2＝0.995；
x为样品中氧化亚铁硫杆菌的细胞数，103个/mL，y为450nm实际测定的OD.R为相关系数。
下表列出了用本实施例方法测定的氧化亚铁硫杆菌样品数量与显微计数结果的比较
| OD.450nm/630nm | 本方法测定菌浓E3个/mL | 显微镜计数菌浓E3个/ml |
| 1.115 | 1.65 | 1.68 |
| 0.8 | 1.32 | 1.24 |
| 0.484 | 0.825 | 0.85 |
因此，采用本发明的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，可以对氧化亚铁硫杆菌定性定量检测，首先提取16SrRNA靶序列，分析探针预期杂交，核酸S1酶去除错配以及单链DNA，变性后与以固定在孔上的捕获探针杂交，最后与带有荧光物质的信号探针杂交，通过蛋白大分子的特异性与抗体结合，最后在显色系统，如四甲基联苯胺，邻苯二胺等显色，然后读出检测信号，即可确定rRNA的种类和数量。
综上所述，本发明的该氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物设计巧妙，可以快速定性定量检测氧化亚铁硫杆菌，且检测方法操作简单、重复性好，适于大规模推广应用。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
Claims (10)
1.一种氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，其特征在于，包括用于特异性结合氧化亚铁硫杆菌的rRNA的分析探针、用于结合在载体上并与所述分析探针特异性结合的捕获探针以及用于与所述分析探针特异性结合的信号探针，所述信号探针具有蛋白标记。
2.根据权利要求1所述的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，其特征在于，所述分析探针具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，其特征在于，所述捕获探针具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，其特征在于，所述捕获探针具有生物素标记。
5.根据权利要求1所述的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，其特征在于，所述信号探针具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，其特征在于，所述蛋白标记是荧光素标记。
7.一种氧化亚铁硫杆菌检测方法，其特征在于，采用根据权利要求1所述的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物检测氧化亚铁硫杆菌，并具体包括以下步骤：
(1)将所述分析探针与所述rRNA杂交得到杂交产物；
(2)在所述杂交产物中加入核酸S1酶消化处理得到消化产物；
(3)对所述消化产物进行变性处理得到变性产物；
(4)将所述变性产物与固定在载体上的所述捕获探针杂交，然后洗涤；
(5)加入所述信号探针与所述分析探针杂交，然后洗涤；
(6)加入带酶标记的抗所述蛋白标记的抗体与所述蛋白标记进行杂交，然后洗涤；
(7)加入所述酶标记的底物以显色。
8.根据权利要求7所述的氧化亚铁硫杆菌检测方法，其特征在于，所述捕获探针通过生物素-链霉亲和素相互作用固定在所述载体上。
9.根据权利要求7所述的氧化亚铁硫杆菌检测方法，其特征在于，所述蛋白标记是荧光素标记，所述抗体是抗荧光素标记的抗体。
10.根据权利要求7所述的氧化亚铁硫杆菌检测方法，其特征在于，所述酶标记是辣根过氧化物酶标记，所述底物是四甲基联苯胺。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110169853.4A CN102839210B (zh) | 2011-06-22 | 2011-06-22 | 氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物及相关检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110169853.4A CN102839210B (zh) | 2011-06-22 | 2011-06-22 | 氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物及相关检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102839210A true CN102839210A (zh) | 2012-12-26 |
| CN102839210B CN102839210B (zh) | 2014-05-21 |
Family
ID=47366928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110169853.4A Active CN102839210B (zh) | 2011-06-22 | 2011-06-22 | 氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物及相关检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102839210B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667473A (zh) * | 2013-12-06 | 2014-03-26 | 江南大学 | 一组裂殖壶菌菌种检测探针 |
| CN103757107A (zh) * | 2014-01-08 | 2014-04-30 | 江南大学 | 一组芽孢杆菌属（Bacillus）菌种检测探针 |
| CN104313139A (zh) * | 2014-10-14 | 2015-01-28 | 深圳先进技术研究院 | 一种单分子细胞检测方法及其应用和单分子细胞检测试剂盒 |
| CN105734115A (zh) * | 2014-01-08 | 2016-07-06 | 江南大学 | 一组用于检测假单胞属（Pseudomonas）细菌的探针组合物 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101033490A (zh) * | 2007-04-17 | 2007-09-12 | 中南大学 | 一种用于分析酸性环境中微生物群落结构的基因组芯片 |
-
2011
- 2011-06-22 CN CN201110169853.4A patent/CN102839210B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101033490A (zh) * | 2007-04-17 | 2007-09-12 | 中南大学 | 一种用于分析酸性环境中微生物群落结构的基因组芯片 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BLANCA ESCOBAR: "Rapid and specific detection of Acidithiobacillus ferrooxidans and Leptospirillum ferrooxidans by PCR", 《HYDROMETALLURGY》 * |
| CHEN JIE: "Detection of Prorocentrum donghaiense using sandwich hybridization integrated with nuclease protection assay", 《ACTA OCEANOLOGICA SINICA》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667473A (zh) * | 2013-12-06 | 2014-03-26 | 江南大学 | 一组裂殖壶菌菌种检测探针 |
| CN103757107A (zh) * | 2014-01-08 | 2014-04-30 | 江南大学 | 一组芽孢杆菌属（Bacillus）菌种检测探针 |
| CN105734115A (zh) * | 2014-01-08 | 2016-07-06 | 江南大学 | 一组用于检测假单胞属（Pseudomonas）细菌的探针组合物 |
| CN103757107B (zh) * | 2014-01-08 | 2017-01-11 | 江南大学 | 一组芽孢杆菌属（Bacillus）菌种检测探针 |
| CN105734115B (zh) * | 2014-01-08 | 2020-04-17 | 江南大学 | 一组用于检测假单胞属（Pseudomonas）细菌的探针组合物 |
| CN104313139A (zh) * | 2014-10-14 | 2015-01-28 | 深圳先进技术研究院 | 一种单分子细胞检测方法及其应用和单分子细胞检测试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102839210B (zh) | 2014-05-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nikolcheva et al. | Determining diversity of freshwater fungi on decaying leaves: comparison of traditional and molecular approaches | |
| Johnson et al. | Techniques for detecting and identifying acidophilic mineral-oxidizing microorganisms | |
| Li et al. | Development of a magnetic nanoparticles microarray for simultaneous and simple detection of foodborne pathogens | |
| CN101789295B (zh) | 金壳磁性纳米颗粒及其制备和应用 | |
| JP5935803B2 (ja) | カビの検出方法、ｐｃｒ用反応液、及びカビ検出用担体 | |
| CN102839210B (zh) | 氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物及相关检测方法 | |
| CN101492739B (zh) | 奶牛乳房炎主要致病菌的检测基因芯片及检测方法 | |
| CN104988144A (zh) | 检测土壤中10种常见病原微生物的基因液相芯片及其检测方法 | |
| CN103014144B (zh) | 检测猪链球菌2型的基因芯片的制备及其应用方法 | |
| CN103276079B (zh) | 一种黄铜矿生物浸出过程中吸附态微生物的检测方法 | |
| CN100463972C (zh) | 活体单核细胞增生李斯特氏菌rt-pcr检测试剂盒及检测方法 | |
| CN114113582B (zh) | 金属有机框架纳米酶生物探针和elisa试剂盒 | |
| CN104131092A (zh) | 一种基于高分辨率熔解曲线的多snp鉴定方法 | |
| CN100386445C (zh) | 一种用于分析酸性环境中微生物群落结构的基因组芯片 | |
| Suyal et al. | Phosphate-solubilizing fungi: current perspective and future need for agricultural sustainability | |
| CN111321242A (zh) | 橡胶树炭疽病病原菌暹罗炭疽菌的快速分子检测方法与应用 | |
| CN111088395A (zh) | 小麦全蚀病菌禾顶囊壳lamp检测引物组及方法 | |
| CN106811542B (zh) | 用于检测参虾贝养殖区致病弧菌群的基因芯片和使用方法 | |
| Möller et al. | Electrical DNA-chip-based identification of different species of the genus Kitasatospora | |
| CN109536578A (zh) | 一种大肠杆菌o157:h7胶体金免疫检测试剂盒及其应用 | |
| Feng et al. | A novel and efficient assay for identification and quantification of Acidithiobacillus ferrooxidans in bioleaching samples | |
| CN107937490A (zh) | 一种非对称pcr的试纸条检测植物病原菌的方法及试剂盒 | |
| Calmin et al. | Multi-Loci Sequence Typing (MLST) for Two Lacto-Acid Bacteria (LAB) Species: Pediococcusáparvulus and P. ádamnosus | |
| CN103436601A (zh) | 一种利用DNA熔解温度分析水稻Wx基因的功能标记Wx-a/b及其使用方法和应用 | |
| WO2020202161A1 (en) | A method for identifying a fungal symbiont |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP02 | Change in the address of a patent holder | ||
| CP02 | Change in the address of a patent holder |
Address after: No. 258 Wuxing Jiayuan, Liangxi District, Wuxi City, Jiangsu Province Patentee after: Jiangnan University Address before: No. 1800 road 214122 Jiangsu Lihu Binhu District City of Wuxi Province Patentee before: Jiangnan University |