CN103276079B - 一种黄铜矿生物浸出过程中吸附态微生物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种黄铜矿生物浸出过程中吸附态微生物的检测方法,属于生物浸出技术领域。本发明包括用于矿石表面吸附菌种的洗涤方法、吸附态总的菌体浓度的计算以及混菌体系下微生物的定性定量检测方法。以黄铜矿生物浸出的三个不同浸出体系:氧化亚铁硫杆菌CUMT-1纯菌体系、氧化硫硫杆菌ZJJN-1纯菌体系以及两菌的混菌(个数浓度1︰1)体系为例进行了验证,发现本发明方法操作简单易行,对设备要求低且在混菌体系下检测具有特异性好和稳定性高等优点,可以快速实现生物浸出过程中吸附态微生物定性定量检测,对提高浸出率提供了基础技术手段,适于推广应用。
Description
技术领域
本发明一种黄铜矿生物浸出过程中吸附态微生物的检测方法,属于生物浸出技术领域。
背景技术
生物浸出是一门生物和冶矿领域的交叉学科,又叫生物氧化或生物湿法冶金,可以有效利用微生物加速贫尾矿的溶解速率,以回收提炼某些贵重有色金属和稀有金属,实现最大限度地利用矿藏的一种冶金方法;相比与传统冶炼方法,生物浸出通常基建投资少、操作成本低、对环境的污染小且可有效处理品位较低的矿物,因此被认为是绿色冶金技术。随着当前日益严重的环境问题和大力倡导的“环境友好冶金”,也进一步加速了生物冶金的快速发展,使得生物浸出工艺成为21世纪最具竞争力、最有前景的冶金工艺之一。
低品位黄铜矿属于硫化矿,占据了全世界超过70%的铜储量。然而由于其结构致密、化学性质极为稳定导致浸出周期偏长以及浸出效率低下。随着技术的发展,我们对黄铜矿生物浸出的机制也逐渐加深,一些浸出机制如“直接/间接”和“接触/非接触”分别被科研人员提出。无论哪一种浸出机制,吸附作用都在浸出体系中发挥着重要的作用。当在固液微环境的菌种吸附作用较强时,矿石表面还原态的铁与硫元素利用速度更快,生成的三价铁离子及其他低价可溶性硫元素量也更多,从而促进了在微液态环境下生化反应的速率,进而加速铜矿的溶解速率,最终影响到生物浸出的效率。然而由于黄铜矿生物浸矿样液混浊、浸出体系环境极端,还尚未有对生物浸出过程中吸附微生物的高效定性定量检测方法。
因此,为进一步探索吸附作用在黄铜矿生物浸出机制中的角色以及在不同浸出体系下吸附态微生物与黄铜矿浸出之间的具体关联性,建立一种高效检测黄铜矿生物浸出过程中吸附态微生物的方法就变得非常重要。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足,提供一种检测黄铜矿生物浸出过程中吸附态微生物的方法,该方法可以实现浸出过程吸附态的微生物定性定量检测,且检测方法操作简单、重复性好,适于大规模推广应用。
氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferroxidans)CUMT-1为中国矿业大学赠送,相关文章“嗜酸氧化亚铁硫杆菌的高效培养及浸出黄铜矿初探” 于2011年8月发表于《工业微生物》41卷第4期50-56页。氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)ZJJN-1筛选于福建紫金矿业有限公司工业生物堆浸现场,已于中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为:CCTCC NO:M 2012104,并已申请专利,专利申请号:201210132204.1。
为了实现上述目的,本发明提供了一种计量吸附态总菌体浓度的方法,首先,将生物浸矿过程的浸出液静置以便移除上清液,取底部浸矿样离心进一步去除上清液。加入9K或Starkey基础培养基悬浮底部矿样,并加入玻璃珠进行漩涡震荡以洗涤去除吸附于矿石表面的微生物。初步离心取上清液进行显微镜计数,并留样进行后续探针特异性检测。将样品重新漩涡震荡洗涤,再次离心将上清液移入干净的离心管,对上清液进行显微镜计数以及后续探针检测。再次样品重新漩涡震荡洗涤,再次离心将上清液移入干净的离心管,对上清液进行显微镜计数以及后续探针检测。采用本方法进行洗涤脱落吸附态菌种,以三次涡旋震荡洗涤作为100%效率,第一次洗涤液可以洗脱下全部吸附菌种的60%左右,第二次洗涤液进一步洗脱下全部吸附菌种的95%左右。为进一步节俭时间从而提高实验效率,确定两次涡旋震荡洗涤为最佳操作。
本发明的技术方案:一种黄铜矿生物浸出过程中吸附态微生物的检测方法,步骤为:
(1)配制三种浸出液:
氧化亚铁硫杆菌CUMT-1纯菌体系:100mL 9K培养基,菌体浓度5.0×107个/mL;9K培养基为:(NH4)2SO4 3.0 g/L,K2HPO4 0.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,KCl 0.1 g/L,Ca(NO3)2 0.01 g/L;
氧化硫硫杆菌ZJJN-1纯菌体系:100mL Starkey培养基,菌体浓度5.0×107个/mL;Starkey培养基为:(NH4)2SO4 3.0 g/L,KH2PO4 3.5 g/L,MgSO4 ·7H2O 0.5 g/L,CaCl2·2H2O 0.25 g/L;
或上述两种菌混合菌种体系:两种菌体个数浓度1︰1,菌体总浓度5.0×107个/mL,50mL 9K培养基+50mL Starkey培养基,
(2)矿石浸出:低品位黄铜矿,来源于安徽铜陵山矿区,铜品位1.0%,其他主要成分如下,铁31.8%,硫12.9%,钙3.65%,镁3.77%,铝1.45%,锌0.054%;矿石经过初步破碎,用100目筛子过筛得矿粉,控制矿粉粒径为<150 μm;将矿粉分别分散至步骤(1)配制的三种浸出液中成矿浆,矿浆浓度为3.0%,浸出温度30℃,摇床转速170 rpm,浸出周期为35天;
(3)吸附态菌体浓度的检测:混匀后取步骤(2)所得浸矿样1mL,加入1.5mL离心管中,2000r/min离心2min,移除上清液备用,留下的矿样加入1.0mL与浸出液对应的9K或Starkey培养基,并加入0.2g 0.2mm玻璃珠,漩涡震荡5min,继续2000r/min离心2min。重新将样液漩涡震荡5min,2000r/min离心2min,最后取上清液进行显微镜计数(或其他计数法如特异性探针检测),得到吸附态菌体浓度 (cells/mL);
(4)游离态菌体浓度的检测:混匀后取步骤(2)所得浸矿样1mL,加入1.5mL离心管中,2000r/min离心2min,取上清液进行显微镜计数,(或其他计数法如特异性探针检测)获得游离态菌体浓度(cells/mL);
(5)浸矿吸附态微生物吸附率的计算:吸附率%=吸附态菌体浓度/(游离态菌体浓度+吸附态菌体浓度)×100%。可以有效检测低至3.0%吸附率的微生物菌体浓度,且三次平行试验稳定性良好,本发明适用于各种生物浸出过程中的吸附态微生物菌体浓度的检测。
本发明的第二方面,提供了一种氧化亚铁硫杆菌检测方法,其特点是,结合第一方面的吸附态总菌体浓度的测定方法,采用氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物(该探针组合物已申请专利,专利申请号:201110169853.4)检测氧化亚铁硫杆菌,专利201110169853.4检测氧化亚铁硫杆菌包括以下步骤:
(1)首先通过两次涡旋震荡洗涤将吸附与黄铜矿表面的菌种移入洗涤液中,通过显微镜计数获得总菌体浓度。
(2)将洗涤液中细胞超声破裂解破壁后,将所述主探针与所述rRNA杂交得到杂交产物;分析探针与rRNA分子杂交后形成DNA/RNA杂合体。
(3)在所述杂交产物中加入核酸S1酶消化处理得到消化产物;在S1酶的作用下,单链的DNA或RNA分予以及DNA/RNA杂合体的不匹配部分被消化,留下与目标RNA分子数量上相等的DNA/RNA杂合体;
(4)对所述消化产物进行变性处理得到变性产物;将DNA/RNA杂合体变性为DNA单链和RNA单链,变性方法可以采用该领域常用变性技术,例如热变性方法,由于单链RNA非常不稳定,很容易被RNA酶降解掉。
(5)将所述变性产物与固定在载体上的所述捕获探针杂交,然后洗涤;杂交后形成DNA/DNA杂合体,洗涤是为了除去非特异性吸附。
(6)加入所述信号探针与所述主分析探针杂交,然后洗涤;杂交后形成“三明治”杂交复合体,洗涤同样是为了除去非特异性吸附。
(7)加入带酶标记的抗所述蛋白标记的抗体与所述蛋白标记进行杂交,然后洗涤。
(8)加入所述酶标记的底物以显色。
所述捕获探针可以通过任何方式固定在载体上,较佳地,所述捕获探针通过生物素-链霉亲和素相互作用固定在所述载体上。
所述蛋白标记可以是任何合适的蛋白,较佳地,所述蛋白标记是荧光素标记,所述抗体是抗荧光素标记的抗体。
所述酶标记可以是任何合适的酶,较佳地,所述酶标记是辣根过氧化物酶标记,所述底物是四甲基联苯胺。酶和底物组成显色系统,显然,显色系统还可以采用其它显色系统,例如邻苯二胺等。
本发明的有益效果:本发明操作简单易行,对设备要求低且在混菌体系下检测具有特异性好和稳定性高等优点,可有效实现生物浸出过程中吸附微生物的定性定量检测,为深化对研究黄铜矿生物浸出机理的理解以及进一步增强黄铜矿吸附作用从而大幅提高浸出率提供了基础技术手段。
附图说明
图1 是黄铜矿浸出过程中吸附菌种与游离态菌种浓度变化规律。a、氧化亚铁硫杆菌CUMT-1纯菌体系; b、氧化硫硫杆菌ZJJN-1纯菌体系;c、两菌的混合菌种体系。
图2 是基于16S rRNA的修饰后的分子探针特异性检测流程。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容,特举以下实施例详细说明,目的在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。
实施例1 不同菌种黄铜矿浸矿过程中吸附态总体菌体浓度的测定
低品位黄铜矿,来源于安徽铜陵山矿区,铜品位1.0%,其他主要成分如下,铁31.8%,硫12.9%,钙3.65%,镁3.77%,铝1.45%,锌0.054%。矿石经过初步破碎,用100目筛子过筛,控制矿粉粒径为<150 μm。将矿粉分别分散至配制的三种浸出液中成矿浆,矿浆浓度为3.0%,温度30℃,摇床转速170 rpm,浸出周期为35天。三个不同浸出体系:氧化亚铁硫杆菌CUMT-1纯菌体系:100mL 9K培养基,菌体浓度5.0×107个/mL,(NH4)2SO4 3.0 g/L,K2HPO4 0.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,KCl 0.1 g/L,Ca(NO3)2 0.01 g/L。氧化硫硫杆菌ZJJN-1纯菌体系:100mL Starkey培养基,菌体浓度5.0×107个/mL,(NH4)2SO4 3.0 g/L,KH2PO4 3.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,CaCl2·2H2O 0.25 g/L。两菌混合菌种(菌体个数浓度1︰1):50mL 9K培养基+50mL Starkey培养基,菌体总浓度5.0×107个/mL。
浸出过程中,每隔两天进行一次矿石表面吸附态菌种浓浓的测定。具体操作:将浸出液静置1.5h,移除上清,取浸矿样1.0mL加入1.5mL离心管中,2000r/min离心2min,将上清液与上步骤上清液合并备用,留下的矿样加入1.0mL 9K或Starkey基础培养基,并加入0.2g 0.2mm玻璃珠,漩涡震荡5min。继续2000r/min离心2min。然后重新漩涡震荡5min。最后2000r/min离心2min,将上清液移入干净的离心管,并对上清液进行显微镜计数。
氧化亚铁硫杆菌CUMT-1纯菌,氧化硫硫杆菌ZJJN-1纯菌以及两菌的混合菌种3个体系在黄铜矿浸出过程中吸附菌种与游离态菌种变化规律如图1所示。在氧化亚铁硫杆菌CUMT-1纯菌的黄铜矿浸出体系中,吸附菌种浓度占全部菌体浓度的4.3%-7.4%,在氧化硫硫杆菌ZJJN-1纯菌的黄铜矿浸出体系中,吸附菌种浓度占全部菌体浓度的6.1%-11.9%,在氧化亚铁硫杆菌ZJJN-1与氧化硫硫杆菌ZJJN-1的混合菌种黄铜矿浸出体系中,吸附菌种浓度占全部菌体浓度的3.8%-8.7%。而且随着浸出时间的延长,矿石表面吸附量已达饱和,趋于稳定。吸附率的计算:
吸附率%=吸附态菌体浓度/(游离态菌体浓度+吸附态菌体浓度)×100%。
实施例2 氧化亚铁硫杆菌CUMT-1和氧化硫硫杆菌ZJJN-1混合菌种体系中吸附态菌种定性定量检测
在本实验中,采用氧化亚铁硫杆菌探针组,包括主探针、捕获探针以及信号探针,已申请专利,专利号:201110169853.4。
通过与该菌种亲缘关系较近菌种的比对,至少有两个或以上的碱基差异,说明其特异性良好。采用以16S rRNA为基础的检测流程,如图2。
(1)链霉亲和素包被板制备:链霉亲和素用包被液配成5μg/mL,向微孔板各孔内加入100μL,用封口膜封好后于4℃过夜,次日取出,用PBST洗涤液洗涤3次,再用0.1% BSA(溶剂为0.1mol/L pH为7.2的PBS缓冲液)250μL,在37℃下封闭60min,最后用PBST洗涤液洗涤3次,干燥后封好于4℃下保存待用,可保存2月。
(2)捕获探针固定化:100μL(5nM溶于pH 7.2 PBS)捕获探针加入链霉素包被微孔板,于37℃下保温2h,并用洗涤液PBST冲洗3次,随后储存于4℃下。
(3)细菌胞内物质获取:取对数期氧化亚铁硫杆菌显微镜计数计算菌浓,取2mL离心(2000r/min,2min),取上清液离心(12000r/min,10min),除去上清液,加2mL裂解缓冲液(80%甲酰胺,450mM NaCl,5mM Na2EDTA,1mg/mL yeast tRNA,1% SDS,pH 6.4)并超声破碎(50%占空比,共8min),收集滤液待用。
(4) RNA信号转化阶段:加入27μL氧化亚铁硫杆菌样品,30μL矿物油,3μL 500nmol/L的分析探针(采用上述裂解缓冲液稀释),95℃水浴处理15 min,40℃水浴处理1h。
(5)核酸S1酶消化处理:加入30μL的核酸S1酶(60U 于1.4M NaCl,22.5mM ZnSO4、250mM CH3COONa、pH4.5),40℃水浴处理30 min。
(6)DNA/RNA变性反应:加入150μL终止缓冲液(62.5mM NaOH、30mM EDTA、0.5M PBS、pH7.2),95℃处理15 min,DNA-RNA杂合体变性形成单链DNA和单链RNA。与此同时,单链RNA被降解,因此溶液中仅含结合于靶序列的分析探针。
(7)夹心杂交阶段:将100μL上述反应混合液分别移入到预固定有捕获探针的酶标板微孔中,50℃杂交1h,然后用0.1mol/L,pH为7.2的PBS缓冲液洗涤三次。
(8)形成三明治杂交:每孔加入含有100μL 5nM连接探针的杂交缓冲液(4×SSC、10%甲酰胺、0.02% SDS、pH7.2),于50℃杂交30 min,用0.1mol/L,pH 7.2 PBS洗涤三次。
(9)信号检测阶段:每孔加入100μL含有标记了辣根过氧化物酶的抗荧光素抗体(1︰5000稀释于PBS,0.1%牛血清白蛋白),37℃保温30 min,然后用PBS洗4次。
(10)显色反应:每孔加入TMB显色液1 (用无水乙醇,将TMB配成1%浓度,4℃保存半年以内使用。使用前,用pH 5.0磷酸-柠檬酸缓冲液9.9mL加入0.1mL 1%TMB液,再按每mL TMB加入30%的H2O2 1μL,混匀后立即使用) 100μL,37℃处理15 min后,每孔加入50μL 2mol/L硫酸终止反应。将酶标板置于读板机上于450nm和630nm测定光吸收值,由标准曲线y=0.799x-0.204(R2=0.995)换算得到吸附态氧化亚铁硫杆菌菌体浓度。
表1 对黄铜矿浸出过程洗涤液中微生物定性定量检测结果
混合体系吸附态菌体浓度 | 第10天 | 第20天 | 第30天 |
氧化亚铁硫杆菌 E7cells/mL | 0.41 | 1.12 | 1.53 |
氧化硫硫杆菌 E7cells/mL | 0.24 | 0.42 | 0.92 |
总菌体浓度 E7cells/mL | 0.65 | 1.56 | 2.45 |
在此说明书中,本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是,很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此,说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
(1)主探针:5’-ATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTCCGGAATTCTGCAGAGAT-3’;
(2)捕获探针:
5’-biotin-ATCTCTGCAGAATTCCGGACATGTCAA-3’,5’端缀有生物素大分子标记;
(3)信号探针:
5’-TTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACAT-FITC-3’,3’端缀有异硫氰酸标记。
Claims (1)
1.一种黄铜矿生物浸出过程中吸附态微生物的检测方法,其特征在于步骤为:
(1)配制三种浸出液:
氧化亚铁硫杆菌CUMT-1纯菌体系:100mL 9K培养基,菌体浓度5.0×107个/mL;9K培养基为:(NH4)2SO4 3.0 g/L,K2HPO4 0.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,KCl 0.1 g/L,Ca(NO3)2 0.01 g/L;
氧化硫硫杆菌ZJJN-1纯菌体系:100mL Starkey培养基,菌体浓度5.0×107个/mL;Starkey培养基为:(NH4)2SO4 3.0 g/L,KH2PO4 3.5 g/L,MgSO4 ·7H2O 0.5 g/L,CaCl2·2H2O 0.25 g/L;
或上述两种菌混合菌种体系:两种菌体个数浓度1:1,菌体总浓度5.0×107个/mL,50mL 9K培养基+50mL Starkey培养基;
氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)ZJJN-1,已保藏于中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为:CCTCC NO:M 2012104;
(2)矿石浸出:低品位黄铜矿,矿石经过初步破碎,用100目筛子过筛得矿粉,控制矿粉粒径为<150 μm;将矿粉分别分散至步骤(1)配制的三种浸出液中成矿浆,矿浆浓度为3.0%,浸出温度30℃,摇床转速170 rpm,浸出周期为35天;
(3)吸附态菌体浓度的检测:混匀后取步骤(2)所得浸矿样1mL,加入1.5mL离心管中,2000r/min离心2min,移除上清液备用,留下的矿样加入1.0mL 与浸出液对应的9K或Starkey培养基,并加入0.2g 0.2mm玻璃珠,漩涡震荡5min,继续2000r/min离心2min;重新将样液漩涡震荡5min,2000r/min离心2min,最后取上清液进行显微镜计数或特异性探针检测,得到吸附态菌体浓度 cells/mL;
(4)游离态菌体浓度的检测:混匀后取步骤(2)所得浸矿样1mL,加入1.5mL离心管中,2000r/min离心2min,取上清液进行显微镜计数或特异性探针检测获得游离态菌体浓度cells/mL;
(5)浸矿吸附态微生物吸附率的计算:吸附率%=吸附态菌体浓度/(游离态菌体浓度+吸附态菌体浓度)×100%。
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