CN101789295B - 金壳磁性纳米颗粒及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金壳磁性纳米颗粒，该颗粒由里及表依次包括磁核、硅壳和金壳，硅壳包覆磁核，金壳包覆硅壳，颗粒的粒径为20～30nm，硅壳的厚度为5～10nm，金壳的厚度为4～8nm。该金壳磁性纳米颗粒是运用纳米金催化原位扩增方法直接在制得的硅壳磁核纳米颗粒表面生成金壳后得到，其可有效应用于纤维素酶基因的检测。该金壳磁性纳米颗粒具有良好的稳定性和生物亲和性、且能固定多种生物分子，其制备方法简单、易操作，能够精确、快速、简便、低成本地用于检测及分离纤维素酶基因。

Description

金壳磁性纳米颗粒及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种磁性纳米颗粒及其制备和应用，尤其涉及一种金属壳包覆型磁性纳米颗粒及其制备和应用。

背景技术

纤维素是地球上最丰富的生物质类可再生资源，由于结构复杂，能水解天然纤维素的纤维素酶均为复杂的多酶体系。传统的纤维素酶检测是通过滤纸法、分光光度法、荧光法等方法测定总糖化能力或特定纤维素酶活。由于纤维素酶是多组分复合物，其作用的底物也比较复杂，影响酶活性的因素也是多种多样的，除反应时间、温度等因素外，酶液的浸提时间、空白对照样酶液的灭活时间等也将影响到纤维素降解代谢的检测。随着纤维素酶各种组分基因研究的日益完善，基因水平上的纤维素酶分析检测也应运而生。因此，开发一种快速、灵敏的基因传感技术跟踪检测纤维素酶编码基因及其对应的mRNA或cDNA的数量信息，可为分析环境生物群落中纤维素降解酶系多样性表达变化与影响功能基因表达的关键因素提供方便快捷的手段。

DNA传感器是分子生物学检测技术与传感技术相结合的产物，在分析微生物特定功能基因的分布与表达方面具有快速、简便、灵敏度高、选择性好、成本低的优势，可以实现实时、在线检测。而纳米材料作为一种特殊的生物分子固定化载体和标记物引起了学术界广泛关注，将具有光学或电化学性能的组分和磁性颗粒相结合制备新型生物传感纳米颗粒的研究尤其引人注目。目前，已有研究人员成功研制出Au-SiO₂和CdS-FePt等复合型纳米磁性材料，将Au的光学特性与SiO₂相结合或将CdS的光学特性与FePt的磁性相结合，并应用于生物分析之中，但这类复合型磁性纳米材料的稳定性、生物亲和性等都有待改进，将其应用于纤维素酶的检测也比较困难，因此，开发一种能有效用于纤维素酶检测的新型的磁性纳米材料及其制备和检测方法，对于微生物酶动态跟踪检测、微生物酶降解机理及其表达和调控等技术问题的研究都具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有良好的稳定性和生物亲和性、且能固定多种生物分子的金壳磁性纳米颗粒，并相应提供一种该金壳磁性纳米颗粒的制备方法，本发明还提供一种精确、快速、简便、低成本的用该金壳磁性纳米颗粒检测纤维素酶基因的应用。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种金壳磁性纳米颗粒，其特征在于：所述金壳磁性纳米颗粒由里及表依次包括磁核、硅壳和金壳，所述硅壳包覆磁核，所述金壳包覆硅壳，所述金壳磁性纳米颗粒的粒径为20～30nm，所述硅壳的厚度为5～10nm，所述金壳的厚度为4～8nm。该技术方案中的金壳磁性纳米颗粒的颜色一般表现为红棕色。

作为一个完整的技术构思，本发明还提供一种金壳磁性纳米颗粒的制备方法，该制备方法是运用纳米金催化原位扩增方法直接在制得的硅壳磁核纳米颗粒表面生成金壳，得到金壳磁性纳米颗粒(即金/硅/磁三层复合型核壳磁性纳米颗粒，可简称GSMNs)。将该金壳磁性纳米颗粒纯化后悬浮于水中，浓度为20g·L^-1，4℃贮存备用。

上述金壳磁性纳米颗粒的制备方法中，所述纳米金催化原位扩增方法具体包括以下步骤：首先对所述硅壳磁核纳米颗粒进行氨基化处理，然后将金纳米颗粒固定至氨基化的硅壳磁核纳米颗粒表面得到金种-硅壳磁核纳米颗粒胶体，再将1体积的金种-硅壳磁核纳米颗粒胶体注入到10～12体积的金壳生长液中，以所述金种-硅壳磁核纳米颗粒表面的金纳米颗粒为晶种，通过在所述金壳生长液中的催化反应使得硅壳磁核纳米颗粒表面沉积生成一层金壳。

上述金壳磁性纳米颗粒的制备方法中，所述金壳生长液的组分优选包括K₂CO₃、HAuCl₄和盐酸羟胺，相应的，所述催化反应即是指在该金壳生长液中羟胺的还原作用和所述金纳米颗粒晶种的催化作用下进行原位扩增生成金壳的反应。

上述金壳磁性纳米颗粒的制备方法中，所述K₂CO₃、HAuCl₄和盐酸羟胺在金壳生长液中的浓度分别优选为0.25～0.50g·L^-1、0.16～0.32g·L^-1和0.067～0.134g·L^-1。

上述金壳磁性纳米颗粒的制备方法中，所述硅壳磁核纳米颗粒优选是通过以下方法制备得到：在氮气保护下先制备Fe₃O₄胶状沉淀，然后向其中加入聚乙二醇(PEG)、氨水和正硅酸乙酯(TEOS)，室温下充分搅拌，反应完成后进行清洗、冷冻干燥后制得硅壳磁核纳米颗粒。加入PEG是为了更好地防止SiO₂胶束的凝聚，通过PEG-SiO₂作用形成聚合物，提高硅壳磁核纳米颗粒的生物相容性和悬浮性能。

上述金壳磁性纳米颗粒的制备方法中，所述氨基化处理优选是指：在硅壳磁核纳米颗粒的悬浮液中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，充分搅拌后完成氨基化处理。

上述金壳磁性纳米颗粒的制备方法中，所述金纳米颗粒优选是采用柠檬酸三钠还原HAuCl₄法制备得到。

作为一个完整的技术构思，本发明还提供一种上述金壳磁性纳米颗粒在纤维素酶基因检测中的应用。

上述的应用中，所述纤维素酶基因优选是指编码纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，CBH)二亚型组分的功能基因(可简称cbh2)。众所周知，瑞氏木霉(Trichoderma reesei)作为降解纤维素的模式菌株，其产生的纤维素酶能够利用和降解复杂的纤维素底物，是目前研究最多的纤维素高效降解菌。瑞氏木霉产生的纤维素酶已有8个纤维素酶基因得到克隆并测序，而编码纤维二糖水解酶二型亚组分的功能基因是其中重要的功能基因，因此将本发明的金壳磁性纳米颗粒应用于cbh2基因的检测，为深入分析纤维二糖水解酶的降解机理以及进一步开展其他纤维素酶功能基因检测奠定了基础。

上述应用的具体操作方法为：将氨基标记5’的纤维二糖水解酶二型亚组分基因捕获探针通过Au-NH₂偶联作用固定到所述金壳磁性纳米颗粒表面，得到金壳磁性纳米颗粒-捕获探针偶联体，再将目标链和与目标链具有相同序列的信号探针加入到所述金壳磁性纳米颗粒-捕获探针偶联体的悬浮液中进行竞争式DNA杂交，然后加入链亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP-SA)与杂交后的信号探针进行偶联，偶联结束后采用电化学方法检测酶催化电流(即响应电流)，根据检测到的酶催化电流大小确定出所述纤维素酶基因目标链浓度。该方法可以检测到的纤维素酶基因目标链浓度下限为10^-14M。在本发明应用的具体操作中，偶联体一般都利用磁性分离，磷酸缓冲液清洗。HRP标记后的颗粒可于4℃贮存不超过24h，需要检测时再将其重新悬浮于电解液中，采用电化学方法检测HRP催化电流，从而计算目标链浓度。

上述应用的具体操作方法中：

具体到将所述捕获探针通过Au-NH₂偶联作用固定到所述金壳磁性纳米颗粒表面的过程中，所述捕获探针的浓度优选为1.0×10^-6～2.0×10^-6M，固定时间优选控制在12～18h，固定温度优选控制在0℃～4℃；因为我们的实验发现，捕获探针的浓度、固定时间、固定温度对本发明检测方法的灵敏度会产生很大影响，当捕获探针浓度为1.0×10^-6～2.0×10^-6M，在0～4℃固定12～18h时，在GSMNs上的固定量能达到最大；

具体到所述竞争式DNA杂交的过程中，所述信号探针的浓度优选为0.1×10^-9～1.0×10^-9M，杂交时间控制在40～60min，杂交温度控制在35℃～40℃；因为我们的实验发现，信号探针的浓度、杂交时间、杂交温度对本发明检测方法的灵敏度也会产生影响，由于目标链和具有相同序列的信号探针通过竞争方式与GSMNs-捕获探针偶联体杂交，检测到的响应电流会随着信号探针杂交量的增大而升高，信号探针浓度为0.1×10^-9～1.0×10^-9M时能检测到很强的响应电流；杂交温度和杂交时间也是影响DNA杂交的重要参数，我们的实验表明，35℃～40℃的杂交温度和40～60min的杂交时间为DNA杂交检测的最优温度和时间；

具体到所述链亲和素标记的辣根过氧化物酶与杂交后的信号探针进行偶联的过程中，所述辣根过氧化物酶的稀释度优选为1∶(300～400)，偶联时间优选控制在25～35min，偶联温度优选控制在35℃～40℃；HRP-SA的固定量也会直接影响到响应电流大小，当HRP-SA稀释度为1∶(300～400)、35～40℃下偶联25～35min时，响应电流最大。

上述应用的具体操作方法中，所述根据检测到的酶催化电流大小确定出所述纤维素酶基因目标链浓度具体是指依据以下线性方程在10^-13～10^-8M的范围内确定目标链浓度：

I＝-0.00662×lg(C)+0.247

上述线性方程中的I表示酶催化电流(单位：μA)，C表示目标链浓度(单位：M)。所述酶催化电流I和目标链浓度C在10^-13～10^-8M范围内的线性相关系数为0.9629。

本发明的上述应用还可用于分离所述纤维二糖水解酶的目标基因片段。上述的应用中，捕获探针偶联、DNA杂交和HRP标记步骤都是在悬浮于反应液中具有磁性的金壳磁性纳米颗粒表面进行，每一步反应固定上去的生物分子可以随着金壳磁性纳米颗粒通过磁分离器的外加磁场很方便地从液相中分离出来，经过洗涤，再进入下一步反应。如果不进行最后一步的HRP标记以及电化学检测，则上述的应用方法也可以成为分离富集复杂体系DNA提取样品中的目标基因片段的有效手段，且对样品不产生损伤，操作快速简便。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的金壳磁性纳米颗粒能够使磁性颗粒(尤其是金属氧化物磁性颗粒)在具有腐蚀性的生物环境中更加稳定，而且能够利用Au和巯基/氨基之间的交联作用固定多种具有巯基/氨基的生物分子而不改变其空间构形。因此，本发明的金壳磁性纳米颗粒具有良好的生物亲和性，这使其在磁性分析、光学分析和电化学分析中都具有巨大应用潜力。

其次，本发明将纳米金原位扩增技术应用到磁性纳米颗粒表面包被的金壳制备过程中，制备成金/硅/磁三层复合型核壳磁性颗粒，这种原位增长型的金壳不仅更加稳定致密，而且能够使磁性颗粒耐受有腐蚀性的生物环境，有利于提高金壳磁性纳米颗粒的生物亲和性，有利于提高后续纤维素酶基因检测的灵敏度。

再次，本发明根据微生物功能酶编码基因的DNA序列设计出针对纤维素酶的特异性探针，并以金壳磁性纳米颗粒作为载体，制备成DNA纳米传感器，实现了对痕量纤维素酶基因靶序列的超灵敏电化学检测。本发明应用中的基因传感器不仅能对环境生物群落中功能酶系的动态变化进行跟踪监测，而且对于深入研究微生物酶降解机理及其表达与调控情况具有重要意义。

本发明的金壳磁性纳米颗粒用于检测纤维素酶基因具有精确、快速、简便、低成本等优点，我们通过实验验证了双碱基错配链对本发明的检测方法不产生干扰和影响，本发明应用中的DNA纳米传感器能够有效识别错配碱基，检测下限可达到10^-14M，为痕量实际样品的检测创造了优越条件。因此，将金壳磁性纳米颗粒应用于基因检测，大大提高了检测灵敏度、检测效率和可再生性，为复杂环境生物群落中开展基因分子生物学检测研究提供了有力的技术支持，并可以拓展到环境分析中与DNA快速分析相关的其他技术领域。

附图说明

图1为本发明实施例1中金壳磁性纳米颗粒制备方法的工艺流程图；

图2为本发明实施例1中制得的磁性纳米颗粒的扫描电镜照片；

图3为本发明实施例1中制得的硅壳磁核纳米颗粒的扫描电镜照片；

图4为本发明实施例1中制得的金壳磁性纳米颗粒的扫描电镜照片；

图5为本发明实施例2中的检测条件下响应电流和目标链浓度常用对数之间的关系图；其中，内置图为响应电流和目标链浓度常用对数之间的线性回归曲线，回归曲线中的垂直线段代表三次平行实验的标准偏差。

具体实施方式

实施例1：

一种本发明的金壳磁性纳米颗粒，其是通过以下步骤制备得到(以下步骤的工艺流程可参见图1)：

1、制备硅壳磁核纳米颗粒

将8.5g FeCl₃·6H₂O和3g FeCl₂·4H₂O加入到38mL 0.4M的盐酸中溶解，再倒入到充氮气的375mL 0.7M的氨水中，室温下强烈搅拌生成Fe₃O₄胶状沉淀，水洗三次后得磁性纳米颗粒并悬浮于150mL的水中，取20mL的悬浮液加入到200mL的异丙醇中充分混合，然后依次加入5.36g PEG、20mL水、10mL氨水(28％)和1.2mL TEOS，室温下搅拌24h，用乙醇和水超声清洗产物两次，冷冻干燥后即制得硅壳磁核纳米颗粒。

2、制备金种-硅壳磁核纳米颗粒

先采用柠檬酸三钠还原HAuCl₄法制备胶体金：将50mL 0.01％的HAuCl₄溶液加热到沸腾，迅速加入1mL 1％的柠檬酸三钠，还原后即得红色的胶体金溶液(含金纳米颗粒)，于4℃贮存；

取0.5g硅壳磁核纳米颗粒悬浮于10mL的甲醇中，超声振荡3min，加入0.5mL的APTES，室温搅拌12h，沉淀用甲醇和水超声清洗，完成硅壳磁核纳米颗粒的氨基化；

将氨基化后的硅壳磁核纳米颗粒悬浮于6mL乙醇中，并与15mL的胶体金混合，避光轻摇2h，磁力分离后得到的红色颗粒即为纯化的金种-硅壳磁核纳米颗粒，将其重新悬浮于5mL水中。

3、纳米金原位扩增

将5mL 25mg·mL^-1的K₂CO₃、8mL 1％的HAuCl₄、5mL金种-硅壳磁核纳米颗粒胶体和6mL 80mM盐酸羟胺依次加入到500mL水中，不断剧烈搅拌，1h后，混合物颜色逐渐由深紫变为红棕色，表明金壳生成，得到金壳磁性纳米颗粒(即金/硅/磁三层复合型核壳磁性纳米颗粒GSMNs)，纯化后悬浮于水中，浓度为20g·L^-1，4℃贮存备用。

为进一步证实上述步骤制备得到的金壳磁性纳米颗粒的结构变化，采用JSM-6700型(日本JEOL公司)扫描电子显微镜分别对上述步骤中的磁性纳米颗粒、硅壳磁核纳米颗粒和金壳磁性纳米颗粒进行形态分析，分析结果如图2～图4所示。由图2可见，磁性纳米颗粒为粒径为8～10nm的球形，少部分为不规则多面体；由图3可见，硅壳磁核纳米颗粒的粒径为16～20nm，硅壳厚度为5～6nm，仍然保持球形。图4所示为GSMNs的形貌，同样表现为粒径20～25nm的球形，硅壳厚度为5～6nm，金壳厚度为4～5nm。各壳层的厚度可以根据工艺参数进行调整，但为保证最后制得的金壳磁性纳米颗粒能够被磁场吸引，壳层不宜过厚。合适的壳层厚度有利于保持磁场强度和稳定性，同时能为金壳磁性纳米颗粒表面修饰生物分子提供方便。GSMNs中少量不规则颗粒可能是由不完全扩增造成，其中还有部分细小颗粒可能是由扩增还原剂浓度较高时生成的。

实施例2：

将上述实施例1制得的金壳磁性纳米颗粒应用于纤维素酶基因的检测，该纤维素酶基因具体是指编码纤维二糖水解酶(瑞氏木霉产生)二亚型组分的功能基因(cbh2)，该检测应用的具体操作方法包括以下步骤：

1、寡核苷酸链探针和目标链设计

根据cbh2的基因编码序列，采用Primer Premier 5软件设计cbh2的寡核苷酸探针、目标链和双碱基错配链，运用Oligo 6软件及NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中Blast资源对探针进一步筛选，选取最优探针和目标链进行合成，其序列如下表1所示。

表1：cbh2的寡核苷酸探针、目标链及双碱基错配链序列

寡核苷酸	序列(5’-3’)
		捕获探针(CP)	NH2-ATGATGAGCCTTCAGTAACAGATTG
信号探针(DP)	Biotin-CAATCTGTTACTGAAGGCTCATCAT
		目标链	CAATCTGTTACTGAAGGCTCATCAT
双碱基错配链	CATTCTGTTACTGTAGGCTCATCAT

2、DNA杂交

首先将30μL GSMNs悬浮于1mL 10^-6M的CP(氨基标记5’的捕获探针)溶液中，4℃搅拌18h制备得到GSMNs-CP偶联体，分离后重新悬浮于1mL磷酸缓冲液(PBS，0.07M，pH 7.4)中，然后取30μL与含有一定量的DP(生物素标记3’的信号探针)和目标链的2×SSC缓冲液(30μL，0.3M NaCl和0.03M Na₃C₆H₅O₇·2H₂O，pH 8.0)混合，37℃下杂交反应60min得到GSMNs-CP-DP偶联体，重新悬浮于20μL PBS中。再取一定量的HRP-SA加入到GSMNs-CP-DP偶联体的悬浮液中，37℃下搅拌培养30min得HRP标记颗粒(每一次的偶联体都采用磁性分离，PBS清洗)。最后将所得HRP标记颗粒重新悬浮于10mL PBS中，在优化工作电位下用计时电流法检测HRP催化电流，从而测定目标链浓度。

3、检测及检测结果分析

为验证本发明检测方法对目标链的高度专一性，将1.67×10^-7M的双碱基错配链和8×10^-10M的信号探针同时与GSMNs-CP偶联体杂交，产生的响应电流是相同浓度互补链的6％。在最佳测定条件下，通过将本实施例检测方法应用于检测不同浓度的cbh2基因目标链，发现响应电流会随目标链浓度升高而下降，且响应电流与目标链浓度的常用对数在10^-13～10^-8M范围内呈线性关系；响应电流和目标链浓度常用对数之间的关系图如图5所示，其中的内置图为响应电流和目标链浓度常用对数之间的线性回归曲线，线性方程为：

I＝-0.00662×1g(C)+0.247

上式中，I为响应电流(μA)，C为目标链浓度(M)，相关系数为0.9629。

由检测结果可知，本发明检测方法的检测下限为10^-14M。同一次实验中相同浓度的样品设立重复组，结果完全一致。因此，本发明的检测方法对纤维二糖水解酶基因靶序列的测定是准确有效的。

由本实施例2可见，本发明检测方法的灵敏度明显高于一般DNA传感器的灵敏度，为环境生物群落中痕量功能基因片段检测提供了更方便快捷的技术方案。

<110>湖南大学

<120>金壳磁性纳米颗粒及其制备和应用

<160>3

<210>1

<211>25bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atgatgagcc ttcagtaaca gattg                  25

<210>2

<211>25bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

caatctgtta ctgaaggctc atcat                  25

<210>3

<211>25bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

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Claims (10)

1.一种金壳磁性纳米颗粒，其特征在于，所述金壳磁性纳米颗粒由里及表依次包括磁核、硅壳和金壳，所述硅壳包覆磁核，所述金壳包覆硅壳，所述金壳磁性纳米颗粒的粒径为20～30nm，所述硅壳的厚度为5～10nm，所述金壳的厚度为4～8nm。

2.一种金壳磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，该制备方法是运用纳米金催化原位扩增方法直接在制得的硅壳磁核纳米颗粒表面生成金壳，得到金壳磁性纳米颗粒。

3.根据权利要求2所述的金壳磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述纳米金催化原位扩增方法具体包括以下步骤：首先对所述硅壳磁核纳米颗粒进行氨基化处理，然后将金纳米颗粒固定至氨基化的硅壳磁核纳米颗粒表面得到金种-硅壳磁核纳米颗粒胶体，再将1体积的金种-硅壳磁核纳米颗粒胶体注入到10～12体积的金壳生长液中，以所述金种-硅壳磁核纳米颗粒表面的金纳米颗粒为晶种，通过在所述金壳生长液中的催化反应使得硅壳磁核纳米颗粒表面沉积生成一层金壳。

4.根据权利要求3所述的金壳磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述金壳生长液的组分包括K₂CO₃、HAuCl₄和盐酸羟胺，所述催化反应是指在该金壳生长液中羟胺的还原作用和所述金纳米颗粒晶种的催化作用下进行原位扩增生成金壳的反应。

5.根据权利要求4所述的金壳磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述K₂CO₃、HAuCl₄和盐酸羟胺在金壳生长液中的浓度分别为0.25～0.50g·L^-1、0.16～0.32g·L^-1和0.067～0.134g·L^-1。

6.根据权利要求3、4或5所述的金壳磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，

所述硅壳磁核纳米颗粒是通过以下方法制备得到：在氮气保护下先制备Fe₃O₄胶状沉淀，然后向其中加入聚乙二醇、氨水和正硅酸乙酯，室温下充分搅拌，反应完成后进行清洗、冷冻干燥后制得硅壳磁核纳米颗粒；

所述氨基化处理是指：在硅壳磁核纳米颗粒的悬浮液中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，充分搅拌后完成氨基化处理；

所述金纳米颗粒是采用柠檬酸三钠还原HAuCl₄法制备得到。

7.一种如权利要求1所述的或者如权利要求2～5中任一项方法制备得到的金壳磁性纳米颗粒在纤维素酶基因检测中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述纤维素酶基因为编码瑞氏木霉所产生的纤维二糖水解酶二亚型组分的功能基因。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方法为：将氨基标记5’的纤维二糖水解酶二型亚组分基因捕获探针通过Au-NH₂偶联作用固定到所述金壳磁性纳米颗粒表面，得到金壳磁性纳米颗粒-捕获探针偶联体，再将目标链和与目标链具有相同序列的信号探针加入到所述金壳磁性纳米颗粒-捕获探针偶联体的悬浮液中进行竞争式DNA杂交，然后加入链亲和素标记的辣根过氧化物酶与杂交后的信号探针进行偶联，偶联结束后采用电化学方法检测酶催化电流，根据检测到的酶催化电流大小确定出所述纤维素酶基因目标链浓度。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：

将所述捕获探针通过Au-NH₂偶联作用固定到所述金壳磁性纳米颗粒表面的过程中，所述捕获探针的浓度为1.0×10^-6～2.0×10^-6M，固定时间控制在12～18h，固定温度控制在0℃～4℃；

在所述竞争式DNA杂交的过程中，所述信号探针的浓度为0.1×10^-9～1.0×10^-9M，杂交时间控制在40～60min，杂交温度控制在35℃～40℃；

在所述链亲和素标记的辣根过氧化物酶与杂交后的信号探针进行偶联的过程中，所述辣根过氧化物酶的稀释度为1∶(300～400)，偶联时间控制在25～35min，偶联温度控制在35℃～40℃；

所述根据检测到的酶催化电流大小确定出所述纤维素酶基因目标链浓度具体是指依据以下线性方程在10^-13～10^-8M的范围内确定目标链浓度：

I＝-0.00662×lg(C)+0.247

上述线性方程中的I表示酶催化电流，单位为μA；C表示目标链浓度，单位为M。

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