CN103212705B - 基于聚合酶链反应的金-金核壳结构二聚体的手性研究的方法 - Google Patents
基于聚合酶链反应的金-金核壳结构二聚体的手性研究的方法 Download PDFInfo
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Abstract
基于聚合酶链反应的金-金核壳结构二聚体的手性研究的方法，属于材料化学领域。本发明主要内容是具有不同金壳厚度的金-金核壳结构纳米粒子合成，及表面引物偶联量的可控修饰，为了达到金纳米粒子在PCR体系中的稳定性，并对金纳米粒子-引物偶联物用PEG1000进行修饰。在合适的PCR条件下，进行金-金核壳结构二聚体组装，并对其进行TEM表征和CD信号比较。本发明首先合成了具有不同金壳厚度的金-金核壳纳米粒子，首次通过PCR方法进行了金-金核壳结构二聚体的可控组装，并首次对该金-金核壳结构二聚体的手性性质进行了研究和探讨。
Description
技术领域
一种基于聚合酶链反应的金-金核壳结构二聚体的手性研究的方法，属于材料化学领域。
背景技术
纳米材料的自组装是纳米技术的一个研究热点，原因在于自组装纳米材料能够表现出不同于单分散的纳米粒子的独特的光学，电学，磁学和化学性质，通过研究自组装材料的性质可以更好地理解宏观材料的物理和化学性质。聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)，是分子生物学中应用的基础实验手段，是上世纪80年代中期发展起来的一种体外特定核酸序列扩增技术。它具有特异性强、扩增效率高、快速、简便、重复性好、易实现自动化等优点。纳米技术与生物技术相结合产生的纳米生物技术凭借其独特的性质得到了广泛的研究发展，被越来越多的科研人士所青睐。而金纳米粒子，由于其独特的物理、化学性质及生物相容性，在生物电化学、材料学及生物医学等领域都有很广泛的应用。将纳米材料结合到PCR过程中已成为近年来的研究热点，对于提高PCR的特异性和效率和组装结构手性性质的研究有很大的作用。本发明首先合成了具有不同金壳厚度的金-金核壳纳米粒子，首次通过PCR方法进行了金-金核壳结构二聚体的可控组装，并首先对核壳结构的手性性质进行了研究和探讨。圆二色谱（CD）的原理是由不对称分子组成的物质是光学各向异性的，物质对R和L两种圆偏振光吸收程度不同的现象称为圆二色性。这种吸收程度的不同与波长的关系称圆二色谱，是一种测定分子不对称结构的光谱法。可以用圆二色谱研究某些立体结构，对PCR组装后不同金壳厚度的金-金核壳结构二聚体的手性进行研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于聚合酶链反应的金-金核壳结构二聚体的手性研究，并对具有不同金壳厚度的组装结构的手性性质进行研究。
本发明的技术方案：一种基于聚合酶链反应的金-金核壳结构二聚体的手性研究的方法，包括具有不同金壳厚度1nm-10nm的大金纳米粒子和具有不同金壳厚度1nm-10nm的小金纳米粒子的合成，其表面的引物偶联，金-金核壳结构纳米粒子引物偶联物的稳定，金-金核壳结构二聚体的PCR组装，组装产物的手性性质表征。
具体步骤：
（1）不同金壳厚度1nm-10nm的25nm金纳米粒子合成
采用柠檬酸三钠还原氯金酸合成25nm金纳米粒子，通过调节10μL～200μL5mM氯金酸的量达到合成不同金壳厚度1nm-10nm的25nm金纳米粒子。
（2）不同金壳厚度的10nm金纳米粒子合成
采用单宁酸鞣酸还原氯金酸合成10nm金纳米粒子，通过调节10μL～200μL5mM氯金酸的量达到合成不同金壳厚度1nm-10nm的10nm金纳米粒子。
（3）金-金核壳结构纳米粒子和引物的偶联
将新合成的25nm Au-Au核壳结构纳米粒子和巯基修饰的上游引物F-primer偶联，将新合成的10nm Au-Au核壳结构纳米粒子和巯基修饰的下游引物R-primer偶联，分别形成金-金核壳结构纳米粒子-引物偶联物。
（4）金-金核壳结构纳米粒子-引物偶联物的稳定
将金-金核壳结构纳米粒子-引物偶联物和巯基修饰的聚乙二醇（PEG1000）反应，以达到稳定纳米粒子的作用。
（5）金-金核壳结构二聚体的PCR组装及组装产物的手性性质表征
以λDNA为模板，通过优化PCR扩增条件，将金-金核壳结构纳米粒子-引物偶联物在PCR体系中进行不同循环数2～20个循环的组装，离心浓缩，得组装产物，进行TEM和CD的表征。
所述不同金壳厚度的金纳米粒子的合成：
采用传统方法柠檬酸三钠还原氯金酸合成25nm金纳米粒子；
将500μL0.1M的磷酸盐缓冲液和50μL1%聚乙烯吡咯烷酮溶液，混合均匀，加入50μL新合成的2nM25nm金纳米粒子，震荡均匀，加入10μL～200μL5mM的氯金酸溶液和10μL10mM的盐酸羟胺溶液，摇晃3h，离心去除上清，将沉淀分散在50μL的超纯水中，得25nm Au-Au；随着氯金酸溶液量的加大，金壳的厚度越大；
采用传统方法单宁酸还原氯金酸合成10nm金纳米粒子；
将500μL0.1M的磷酸盐缓冲液和50μL1%聚乙烯吡咯烷酮溶液，混合均匀，加入50μL新合成的10nM10nm金纳米粒子，震荡均匀，加入10μL～200μL5mM的氯金酸溶液和10μL10mM的盐酸羟胺溶液，摇晃3h，离心去除上清，将沉淀分散在50μL的超纯水中，得10nm Au-Au；随着氯金酸溶液量的加大，金壳的厚度越大；
通过调节10-200μL5mM氯金酸的量达到具合成不同金壳厚度1nm-10nm的25nm金-金核壳结构纳米粒子和不同金壳厚度1nm-10nm的10nm金-金核壳结构纳米粒子。
所述金-金核壳结构纳米粒子和引物的偶联：
（ⅰ）25nm金-金核壳结构纳米粒子和上游引物F-primer偶联：将制备好的50μL25nm金-金核壳结构纳米粒子加入50μL200nM的F-primer，混匀，室温反应12h；
（ⅱ）10nm金-金核壳结构纳米粒子和下游引物R-primer偶联：将制备好的50μL10nm金-金核壳结构纳米粒子加入50μL1μM的R-primer，混匀，室温反应12h；
（ⅲ）将上述（ⅰ）和（ⅱ）步骤中反应溶液分别以7000rpm及13000rpm离心10min，弃上清，后用50μL的超纯水分散沉淀，4℃保藏、待用。
所述金-金核壳结构纳米粒子-引物偶联物的稳定：
将步骤（3）中所得金-金核壳结构纳米粒子-引物偶联物中加入2μL100μM的PEG1000，室温反应12h；反应后的溶液8000rpm离心10min，弃上清，后用50μL的超纯水分散沉淀，4℃保藏、待用。
所述金-金核壳结构二聚体的PCR组装及组装产物的手性性质表征：
①PCR：以λDNA为模板，采用制得的25nm金-金核壳结构纳米粒子-F-Primer及10nm金-金核壳结构纳米粒子-R-Primer进行PCR。PCR反应体系：dNTPs1μL，0.5μL的Taq DNA聚合酶，λDNA模板质粒0.5μL，PCR反应缓冲液5μL，分别取25nm金-金核壳结构纳米粒子-F-Primer及10nm金-金核壳结构纳米粒子-R-Primer各4μL，加灭菌水至总体积为50μL；
②扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，2～20个循环；72℃再延伸10min；10℃保存，得PCR组装产物；
③TEM和CD表征：取500μL PCR组装产物进行8000rpm离心10min，弃上清，后用100μL的超纯水分散沉淀，进行TEM和CD表征。
表1模板、上下游引物和模板序列及长度
| 编号 | 序列(5’-3’) | 长度 |
| 模板 | PlasmidλDNA | |
| F-primer(50bp) | -SH-(CH2)6-TGGCTGACCC TGATGAGTTC G | 21 |
| R-primer(50bp) | -SH-(CH2)6-GGGCCATGAT TACGCCAGTT | 20 |
注：本发明所使用的DNA均购自中国上海生工生物工程有限公司，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。
本发明的有益效果：本发明首先合成了具有不同金壳厚度的金-金核壳纳米粒子，首次通过PCR方法进行了金-金核壳结构二聚体的可控组装，并首次对该金-金核壳结构二聚体组装产物的手性性质进行了研究和探讨。
附图说明
图1合成的Au-Au纳米粒子的TEM图，（a）25nm Au-Au纳米粒子，（b）10nm Au-Au纳米粒子。
图2金-金核壳结构二聚体组装产物的TEM图。
图3金-金核壳结构二聚体组装产物的CD图谱。1、Au-dimers（二聚体），2、AuAu10μL dimers，3、AuAu20μL dimers，4、AuAu30μL dimers，5、AuAu50μL dimers，6、AuAu70μL dimers，7、AuAu100μL dimers，8、AuAu200μL dimers。
具体实施方式
实施例1金-金核壳结构二聚体组装
（1）25nm金-金核壳结构纳米粒子的合成
采用传统方法柠檬酸三钠还原氯金酸合成25nm金纳米粒子。将500μL0.1M的磷酸盐缓冲液和50μL1%聚乙烯吡咯烷酮溶液，混合均匀，加入50μL新合成的2nM25nm金纳米粒子，震荡均匀，加入10μL5mM的氯金酸溶液和10μL10mM的盐酸羟胺溶液，摇晃3h，离心去除上清，将沉淀分散在50μL的超纯水中，得25nm Au-Au纳米粒子。
（2）10nm金-金核壳结构纳米粒子的合成
采用传统方法单宁酸还原氯金酸合成10nm金纳米粒子。将500μL0.1M的磷酸盐缓冲液和50μL1%聚乙烯吡咯烷酮溶液，混合均匀，加入50μL新合成的10nM10nm金纳米粒子，震荡均匀，加入10μL5mM的氯金酸溶液和10μL10mM的盐酸羟胺溶液，摇晃3h，离心去除上清，将沉淀分散在50μL的超纯水中，得10nm Au-Au纳米粒子。
（3）金-金核壳结构纳米粒子和引物偶联
①25nm金-金核壳结构纳米粒子和上游引物（F-primer）偶联：将制备好的50μL25nm金-金核壳结构纳米粒子加入50μL200nM的F-primer，混匀，室温反应12h。
②10nm金-金核壳结构纳米粒子和下游引物（R-primer）偶联：将制备好的50μL10nm金-金核壳结构纳米粒子加入50μL1μM的R-primer，混匀，室温反应12h。
③将上述①和②步骤中反应溶液分别以7000rpm及13000rpm离心10min，弃上清，后用50μL的超纯水分散沉淀，4℃保藏、待用。
（4）金-金核壳结构纳米粒子-引物偶联物的稳定
将步骤（3）中所得金-金核壳结构纳米粒子-引物偶联物中加入2μL100μM的PEG1000，室温反应12h。反应后的溶液8000rpm离心10min，弃上清，后用50μL的超纯水分散沉淀，4℃保藏、待用。
（5）金-金核壳结构二聚体的PCR组装及组装产物的手性性质表征
①PCR：以λDNA为模板，采用制得的25nm金-金核壳结构纳米粒子-F-Primer及10nm金-金核壳结构纳米粒子-R-Primer进行PCR。PCR反应体系：dNTPs1μL（购自上海生工），0.5μL的Taq DNA聚合酶（购自上海生工），λDNA模板质粒0.5μL（购自宝成生物工程有限公司），PCR反应缓冲液5μL（购自上海生工），分别取25nm金-金核壳结构纳米粒子-F-Primer及10nm金-金核壳结构纳米粒子-R-Primer各4μL，加灭菌水至总体积为50μL；
②扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，2～20个循环；72℃再延伸10min；10℃保存，得PCR组装产物。
③TEM和CD表征：取500μL PCR组装产物进行8000rpm离心10min，弃上清，后用100μL的超纯水分散沉淀，进行TEM和CD表征。
实施例2具有不同金壳厚度的金-金核壳结构二聚体组装
通过调节10μL-200μL5mM氯金酸的量达到具有不同金壳厚度1nm-10nm的25nm金-金核壳结构纳米粒子和不同金壳厚度1nm-10nm的10nm金-金核壳结构纳米粒子，进而组装成具有不同金壳厚度1nm-10nm的金-金核壳结构二聚体。其他步骤同实施例1。
Claims (5)
1.一种基于聚合酶链反应的金-金核壳结构二聚体的手性研究的方法，其特征在于包括具有不同金壳厚度1nm-10nm的大金纳米粒子和具有不同金壳厚度1nm-10nm的小金纳米粒子的合成，其表面的引物偶联，金-金核壳结构纳米粒子-引物偶联物的稳定，金-金核壳结构二聚体的PCR组装，组装产物的手性性质表征；
具体步骤：
（1）不同金壳厚度1nm-10nm的25 nm金纳米粒子合成
采用柠檬酸三钠还原氯金酸合成25 nm金纳米粒子，通过调节10μL～200μL 5mM氯金酸的量达到合成不同金壳厚度1nm-10nm的25 nm金纳米粒子；
（2）不同金壳厚度1nm-10nm的10 nm金纳米粒子合成
采用单宁酸还原氯金酸合成10 nm金纳米粒子，通过调节10μL～200μL 5mM氯金酸的量达到合成不同金壳厚度1nm-10nm的10 nm金纳米粒子；
（3）金-金核壳结构纳米粒子和引物的偶联
将新合成的25 nm Au-Au核壳结构纳米粒子和巯基修饰的上游引物F-primer偶联，将新合成的10 nm Au-Au核壳结构纳米粒子和巯基修饰的下游引物R-primer偶联，分别形成金-金核壳结构纳米粒子-引物偶联物；
（4）金-金核壳结构纳米粒子-引物偶联物的稳定
将金-金核壳结构纳米粒子-引物偶联物和巯基修饰的聚乙二醇PEG1000反应，以达到稳定纳米粒子；
（5）金-金核壳结构二聚体的PCR组装及组装产物的手性性质表征
以λDNA为模板，通过优化PCR扩增条件，将金-金核壳结构纳米粒子-引物偶联物在PCR体系中进行不同循环数2～20个循环的组装，离心浓缩，得组装产物，进行TEM和CD的表征。
2.根据权利要求1所述基于聚合酶链反应的金-金核壳结构二聚体的手性研究的方法，其特征在于具有不同金壳厚度的金纳米粒子的合成：
采用传统方法柠檬酸三钠还原氯金酸合成25 nm金纳米粒子；
将500μL 0.1M的磷酸盐缓冲液和50μL1%聚乙烯吡咯烷酮溶液，混合均匀，加入50μL新合成的2nM 25 nm金纳米粒子，震荡均匀，加入10μL～200μL 5mM的氯金酸溶液和10μL 10mM的盐酸羟胺溶液，摇晃3h，离心去除上清，将沉淀分散在50μL的超纯水中，得25 nm Au-Au；随着氯金酸溶液量的加大，金壳的厚度越大；
采用传统方法单宁酸还原氯金酸合成10 nm金纳米粒子；
将500μL 0.1M的磷酸盐缓冲液和50μL1%聚乙烯吡咯烷酮溶液，混合均匀，加入50μL新合成的10nM 10 nm金纳米粒子，震荡均匀，加入10μL～200μL 5mM的氯金酸溶液和10μL 10mM的盐酸羟胺溶液，摇晃3h，离心去除上清，将沉淀分散在50μL的超纯水中，得10 nm Au-Au；随着氯金酸溶液量的加大，金壳的厚度越大；
通过调节10μL-200μL 5mM氯金酸的量达到具合成不同金壳厚度1nm-10nm的25nm金-金核壳结构纳米粒子和不同金壳厚度1nm-10nm的10nm金-金核壳结构纳米粒子。
3.根据权利要求1所述基于聚合酶链反应的金-金核壳结构二聚体的手性研究的方法，其特征在于金-金核壳结构纳米粒子和引物的偶联：
（ⅰ）25nm金-金核壳结构纳米粒子和上游引物F-primer偶联：将制备好的50μL 25nm金-金核壳结构纳米粒子加入50μL 200nM的F-primer，混匀，室温反应12h；
（ⅱ）10nm金-金核壳结构纳米粒子和下游引物R-primer偶联：将制备好的50μL 10nm金-金核壳结构纳米粒子加入50μL 1μM的R-primer，混匀，室温反应12h；
（ⅲ）将上述（ⅰ）和（ⅱ）步骤中反应溶液分别以7000rpm及13000rpm离心10min，弃上清，后用50μL的超纯水分散沉淀，4℃保藏、待用；
F-primer：5’ -SH-(CH2)6-TGGCTGACCC TGATGAGTTC G-3’，扩增长度为50bp；
R-primer：5’ -SH-(CH2)6-GGGCCATGAT TACGCCAGTT-3’，扩增长度为50bp。
4.根据权利要求1所述基于聚合酶链反应的金-金核壳结构二聚体的手性研究的方法，其特征在于金-金核壳结构纳米粒子-引物偶联物的稳定：
将步骤（3）中所得金-金核壳结构纳米粒子-引物偶联物中加入2mL 100mM的PEG1000，室温反应12h；反应后的溶液8000rpm离心10min，弃上清，后用50μL的超纯水分散沉淀，4℃保藏、待用。
5.根据权利要求1所述基于聚合酶链反应的金-金核壳结构二聚体的手性研究的方法，其特征在于金-金核壳结构二聚体的PCR组装及组装产物的手性性质表征：
①PCR：以λDNA为模板，采用制得的25nm金-金核壳结构纳米粒子-F-Primer及10nm金-金核壳结构纳米粒子-R-Primer进行PCR，PCR反应体系：dNTPs 1mL，0.5mL的Taq DNA聚合酶，λDNA模板质粒0.5mL，PCR反应缓冲液5mL，分别取25nm金-金核壳结构纳米粒子-F-Primer及10nm金-金核壳结构纳米粒子-R-Primer各 4 mL，加灭菌水至总体积为50 mL；
②扩增程序为：94℃ 预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1min，2～20个循环；72℃再延伸10 min；10℃保存，得PCR组装产物；
③TEM和CD表征：取500mL PCR组装产物进行8000rpm离心10 min，弃上清，后用100mL的超纯水分散沉淀，进行TEM和CD表征。
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