CN103192089B - 基于聚合酶链反应的大小金二聚体-金核壳结构组装产物手性研究的方法 - Google Patents
基于聚合酶链反应的大小金二聚体-金核壳结构组装产物手性研究的方法 Download PDFInfo
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Abstract
基于聚合酶链反应的大小金二聚体-金核壳结构组装产物手性研究的方法，属于材料化学领域。本发明主要内容包括基于聚合酶链反应的大小金二聚体的组装，大小金二聚体表面进行不同厚度1nm-10nm的金生长，并对大小金二聚体-金核壳结构组装产物进行TEM表征和CD信号比较。主要实施步骤为：（1）基于聚合酶链反应的大小金二聚体的组装；（2）大小金二聚体表面进行不同厚度的金生长；（3）将所制得的大小金二聚体-金核壳结构组装产物的手性性质表征。本发明首次通过PCR方法进行了大金和小金的二聚体-金核壳结构的可控组装，并首次对大小金二聚体-金核壳结构组装产物链的手性性质进行了研究和探讨。
Description
技术领域
一种基于聚合酶链反应的大小金二聚体-金核壳结构组装产物手性研究的方法，属于材料化学领域。
背景技术
纳米材料的自组装是纳米技术的一个研究热点，原因在于自组装纳米材料能够表现出不同于单分散的纳米粒子的独特的光学、电学、磁学和化学性质，通过研究自组装材料的性质可以更好地理解宏观材料的物理和化学性质。聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)，是分子生物学中应用的基础实验手段，是上世纪80年代中期发展起来的一种体外特定核酸序列扩增技术。它具有特异性强、扩增效率高、快速、简便、重复性好、易实现自动化等优点。纳米技术与生物技术相结合产生的纳米生物技术凭借其独特的性质得到了广泛的研究发展，被越来越多的科研人士所青睐。而金纳米粒子，由于其独特的物理、化学性质及生物相容性，在生物电化学、材料学及生物医学等领域都有很广泛的应用。将纳米材料结合到PCR过程中已成为近年来的研究热点，对于提高PCR的特异性和效率，和组装结构手性性质的研究有很大的作用。本发明首先通过聚合酶链反应组装大小金的二聚体，通过在大小金二聚体的表面进行一层金生长，得到大小金二聚体-金的核壳结构，并首先对该大小金二聚体-金的核壳结构的手性性质进行了研究和探讨。圆二色谱（CD）的原理是由不对称分子组成的物质是光学各向异性的，物质对R和L两种圆偏振光吸收程度不同的现象称为圆二色性。这种吸收程度的不同与波长的关系称圆二色谱，是一种测定分子不对称结构的光谱法。可以用圆二色谱研究某些立体结构，对PCR组装后不同金壳厚度的大小金二聚体的手性进行研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于聚合酶链反应的大小金二聚体-金核壳结构组装产物手性研究的方法，并对具有不同金壳厚度的大小金二聚体的手性性质进行研究。
本发明的技术方案：基于聚合酶链反应的大小金二聚体-金核壳结构组装产物手性研究的方法，包括基于聚合酶链反应的大小金二聚体的组装，大小金二聚体表面进行不同厚度1nm-10nm的金生长，大小金二聚体-金核壳结构组装产物的手性性质表征。
具体步骤：
（1）大小金二聚体的组装
根据ZL201110272661.6的权利要求1进行大小金二聚体组装。具体为：
一种基于聚合酶链反应进行手性金二聚体的可控组装方法，步骤包括金纳米粒子的合成，金纳米粒子和上下游引物的偶联，金纳米粒子和引物偶联物的修饰，金二聚体的组装及表征；
（ⅰ）金纳米粒子的合成
采用柠檬酸三钠还原氯金酸合成不同粒径的金纳米粒子；
（ⅱ）金纳米粒子和上下游引物的偶联
将合成出的金纳米粒子和巯基修饰的上下游引物进行偶联形成金纳米粒子-引物偶联物；
（ⅲ）金纳米粒子-引物偶联物的修饰
将金纳米粒子-引物偶联物和辅助DNA偶联，得金纳米粒子-引物-DNA复合体；
（ⅳ）金二聚体的组装及其表征
在合适的PCR条件下，将金纳米粒子-引物-DNA复合体在PCR体系中进行不同循环数下的组装，离心浓缩，进行表征，得可控组装的手性金二聚体；
模板：Plasmid λDNA，
F-primer：5’-SH-ATGAAACGGCAGGCAGAACAGG-3’，
R-primer：5’-SH-ACAGGGACATCGCCACCAGAAA-3’，
辅助DNA：5’-AAAAAAAAAAAA-3’；
所述（ⅰ）不同粒径金纳米粒子的合成：
合成方案：洁净的三角烧瓶中加入95mL的水，而后向水中加入5mL的浓度为2g/L的氯金酸，加热，煮沸，紧接着加入2.5mL质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续6-8min以使柠檬酸三钠完全沉降；最后，冷却溶液至室温，稀释到100mL，4℃保藏，即制得粒径18nm的金纳米粒子；调整柠檬酸的用量得到不同粒径的金纳米粒子，质量浓度1%的柠檬酸的用量减少至1.4mL得到粒径25nm的金纳米粒子，1%的柠檬酸的用量增加至5.0mL得到粒径10nm的金纳米粒子；
所述（ⅱ）金纳米粒子和上下游引物的偶联：
（a）将步骤（ⅰ）中制备的1mL的金纳米粒子10000r/min离心10min，用1mL的水分散，10000r/min离心10min，弃上清，用100μL含0.01%的SDS的pH8.0、0.01M的PBS分散，4℃保藏、待用；
（b）金纳米粒子和上游引物偶联：取上述制备好的50μL金纳米粒子加入50μL 1μM的F-primer，混匀，加2.5μL2M的NaCl至反应体系中NaCl浓度达到50mM，振摇反应20min，再室温反应12h；
（c）金纳米粒子和下游引物偶联：取上述制备好的50μL金纳米粒子加入50μL1μM的R-primer，混匀，加2.5μL2M的NaCl至反应体系中NaCl浓度达到50mM，振摇反应20min，再室温反应12h；
（d）将上述（b）及（c）步骤中所得反应溶液，在8000r/min离心10min，弃上清，后用100μL超纯水分散沉淀，4℃保藏、分别得金纳米粒子-上游引物偶联物或金纳米粒子-下游引物偶联物，待用；
所述（ⅲ）金纳米粒子和引物偶联物的修饰：
在步骤（d）中制得的金纳米粒子-引物偶联物中加入50mL 5mM的辅助DNA，加2mL2M NaCl溶液，反应12h；反应后的溶液在8000r/min离心10min，弃上清，后用100mL的超纯水分散沉淀，4℃保藏、得金纳米粒子-引物-DNA复合体，待用；
所述（ⅳ）金二聚体的PCR组装及对产物的TEM和CD的表征：
（e）PCR：以λDNA为模板，采用制得的引物金纳米粒子-F-Primer及金纳米粒子-R-Primer进行PCR，PCR反应体系：dNTPs1μL，0.5个单位的Taq DNA聚合酶，λDNA模板质粒0.5μL，PCR反应缓冲液5μL，分别取金纳米粒子-F-Primer4μL和金纳米粒子-R-Primer4μL，加灭菌水至总体积为50μL；所述金纳米粒子选用10nm金纳米粒子、18nm金纳米粒子、或25nm金纳米粒子之一；
（f）扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，2-20个循环；72℃再延伸10min；10℃保存，得PCR产物；
（g）取50μL PCR产物进行8000r/min离心10min，弃上清，后用50μL的超纯水分散沉淀，进行TEM和CD表征。
（2）大小金二聚体表面进行不同厚度的金生长
通过调节10μL-50μL1mM氯金酸的量达到合成不同金壳厚度（1nm-10nm）的大小金二聚体。
（3）大小金二聚体-金核壳结构组装产物的手性性质表征
将合成好的大小金二聚体-金核壳结构组装产物离心浓缩，进行电镜和CD表征。
所述大小金二聚体表面进行不同厚度1nm-10nm的金生长
将500μL0.1M的磷酸盐缓冲液和50μL1%聚乙烯吡咯烷酮溶液混合均匀，加入50μL20nM大小金二聚体溶液，震荡均匀，加入10μL-50μL1mM的氯金酸溶液和10μL10mM盐酸羟胺溶液，摇晃3h，离心去除上清，将沉淀分散在50μL的超纯水中。
所述大小金二聚体-金核壳结构组装产物的手性性质表征：取500μL大小金二聚体-金核壳结构组装产物进行8000rpm离心10min，弃上清，后用100μL的超纯水分散沉淀，进行TEM和CD表征。
本发明的有益效果：将纳米材料结合到PCR过程中已成为近年来的研究热点，对于提高PCR的特异性和效率和组装结构手性性质的研究有很大的作用。本发明首先通过聚合酶链反应组装大小金的二聚体，通过在大小金二聚体的表面进行一层金生长，得到大小金二聚体-金的核壳结构，并首次对该大小金二聚体-金核壳结构组装产物的手性性质进行了研究和探讨。
附图说明
图1大小金二聚体-金核壳结构组装产物的TEM图。
图2不同金壳厚度的大小金二聚体-金核壳结构组装产物CD图谱。1、Au-dimers（二聚体），2、Au dimersAu10μL，3、Au dimersAu20μL，4、Au dimersAu30μL，5、Au dimersAu40μL，6、Au dimersAu50μL。
具体实施方式
实施例1大小金二聚体-金核壳结构的组装
（1）大小金二聚体的组装
根据ZL201110272661.6权利要求书的步骤进行大小金二聚体的组装。包括金纳米粒子的合成，金纳米粒子和上下游引物的偶联，金纳米粒子和引物偶联物的修饰，金二聚体的组装及表征；
（2）大小金二聚体-金核壳结构的合成
将500μL0.1M的磷酸盐缓冲液和50μL1%聚乙烯吡咯烷酮溶液混合均匀，加入50μL20nM大小金二聚体溶液，震荡均匀，加入10μL1mM的氯金酸溶液和10μL10mM盐酸羟胺溶液，摇晃3h，离心去除上清，将沉淀分散在50μL的超纯水中。
（3）将步骤（2）中的反应溶液进行8000rpm离心10min，弃上清，后用50μL的超纯水分散沉淀，进行TEM和CD表征。
实施例2具有不同金壳厚度大小金二聚体-金核壳结构组装
通过调节氯金酸的量达到具有不同金壳厚度大小金二聚体-金核壳结构纳米粒子。随着1mM的氯金酸量由10μL增大到50μL，金壳的厚度逐渐由1nm增大到10nm。产物的分离纯化和表征等其他步骤同实施例1。
F-primer：5’-SH-ATGAAACGGCAGGCAGAACAGG-3’，
R-primer：5’-SH-ACAGGGACATCGCCACCAGAAA-3’，
辅助DNA：5’-AAAAAAAAAAAA-3’。
Claims (3)
1.基于聚合酶链反应的大小金二聚体-金核壳结构组装产物手性研究的方法，其特征在于包括基于聚合酶链反应的大小金二聚体的组装，大小金二聚体表面进行不同厚度1nm-10nm的金生长，大小金二聚体-金核壳结构组装产物的手性性质表征；
具体步骤：
（1）大小金二聚体的组装
包括金纳米粒子的合成，金纳米粒子和上下游引物的偶联，金纳米粒子和引物偶联物的修饰，金二聚体的组装及表征；
（ⅰ）金纳米粒子的合成
采用柠檬酸三钠还原氯金酸合成不同粒径的金纳米粒子：洁净的三角烧瓶中加入95mL的水，而后向水中加入5mL的浓度为2g/L的氯金酸，加热，煮沸，紧接着加入2.5mL质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续6-8min以使柠檬酸三钠完全沉降；最后，冷却溶液至室温，稀释到100mL，4℃保藏，即制得粒径18nm的金纳米粒子；调整柠檬酸的用量得到不同粒径的金纳米粒子，质量浓度1%的柠檬酸的用量减少至1.4mL得到粒径25nm的金纳米粒子，1%的柠檬酸的用量增加至5.0 mL得到粒径10nm的金纳米粒子；
（ⅱ）金纳米粒子和上下游引物的偶联
将合成出的金纳米粒子和巯基修饰的上下游引物进行偶联形成金纳米粒子-引物偶联物；
（a）将步骤（ⅰ）中制备的1mL的金纳米粒子10000r/min离心10min，用1mL的水分散，10000r/min离心10min，弃上清，用100μL含0.01%的SDS的pH8.0、0.01M的PBS分散，4℃保藏、待用；
（b）金纳米粒子和上游引物偶联：取上述制备好的50μL金纳米粒子加入50μL 1μM的F-primer，混匀，加2.5μL 2M的NaCl至反应体系中NaCl浓度达到50mM，振摇反应20min，再室温反应12h；
（c）金纳米粒子和下游引物偶联：取上述制备好的50μL金纳米粒子加入50μL 1μM的R-primer，混匀，加2.5μL 2M的NaCl至反应体系中NaCl浓度达到50mM，振摇反应20min，再室温反应12h；
（d）将上述（b）及（c）步骤中所得反应溶液，在8000r/min离心10min，弃上清，后用100μL超纯水分散沉淀，4℃保藏、分别得金纳米粒子-上游引物偶联物或金纳米粒子-下游引物偶联物，待用；
（ⅲ）金纳米粒子-引物偶联物的修饰
将金纳米粒子-引物偶联物和辅助DNA偶联，得金纳米粒子-引物-DNA复合体：在步骤（d）中制得的金纳米粒子-引物偶联物中加入50mL 5mM的辅助DNA，加2mL 2M NaCl溶液，反应12h；反应后的溶液在8000 r/min离心10min，弃上清，后用100mL的超纯水分散沉淀，4℃保藏、得金纳米粒子-引物-DNA复合体，待用；
（ⅳ）金二聚体的组装及其表征
在合适的PCR条件下，将金纳米粒子-引物-DNA复合体在PCR体系中进行不同循环数下的组装，离心浓缩，进行表征，得可控组装的手性金二聚体：
（e）PCR：以λDNA为模板，采用制得的引物金纳米粒子-F-Primer及金纳米粒子-R-Primer进行PCR，PCR反应体系：dNTPs 1μL，0.5个单位的Taq DNA聚合酶，λDNA模板质粒0.5μL，PCR反应缓冲液5μL，分别取金纳米粒子-F-Primer 4 μL和金纳米粒子-R-Primer 4 μL，加灭菌水至总体积为50 μL；
所述金纳米粒子选用10 nm金纳米粒子、18nm金纳米粒子、或25 nm金纳米粒子之一；
（f）扩增程序为：94℃ 预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1min，2-20个循环；72℃再延伸10 min；10℃保存，得PCR产物；
（g）取50μL PCR产物进行8000r/min离心10min，弃上清，后用50μL的超纯水分散沉淀，进行TEM和CD表征；
模板：Plasmid λDNA，
F-primer：5’-SH-ATGAAACGGCAGGCAGAACAGG-3’，
R-primer：5’-SH-ACAGGGACATCGCCACCAGAAA-3’，
辅助DNA：5’-AAAAAAAAAAAA-3’；
（2）大小金二聚体表面进行不同厚度1nm-10nm的金生长
通过调节10μL -50μL 1mM氯金酸的量达到合成不同金壳厚度1nm-10nm的大小金二聚体-金核壳结构组装产物；
（3）大小金二聚体-金核壳结构组装产物的手性性质表征
将合成好的大小金二聚体-金核壳结构组装产物离心浓缩，进行电镜TEM和圆二色谱CD表征。
2.根据权利要求1所述基于聚合酶链反应的大小金二聚体-金核壳结构组装产物手性研究的方法，其特征在于大小金二聚体表面进行不同厚度1nm-10nm的金生长：将500μL 0.1M的磷酸盐缓冲液和50μL 1%聚乙烯吡咯烷酮溶液混合均匀，加入50μL 20nM大小金二聚体溶液，震荡均匀，加入10μL -50μL 1mM的氯金酸溶液和10μL 10mM盐酸羟胺溶液，摇晃3h，离心去除上清，将沉淀分散在50μL的超纯水中。
3.根据权利要求1所述基于聚合酶链反应的大小金二聚体-金核壳结构组装产物手性研究的方法，其特征在于大小金二聚体-金核壳结构组装产物的手性性质表征：取500mL 大小金二聚体-金核壳结构组装产物进行8000rpm离心10min，弃上清，后用100mL的超纯水分散沉淀，进行TEM和CD表征。
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