CN102382817B - 基于聚合酶链反应进行手性金二聚体的可控组装方法 - Google Patents

Abstract

一种基于聚合酶链反应进行手性金二聚体的可控组装方法，属于材料化学技术领域。本发明主要实施步骤为：（1）不同粒径金纳米粒子的制备；（2）金纳米粒子与上下游引物的偶联；（3）金纳米粒子引物偶联物的修饰；（4）利用所制得的连金与引物的偶联物进行PCR，用TEM对组装结构进行了表征；（5）对PCR产物进行CD信号的测定。通过对金纳米粒子表面引物偶联量的可控修饰，和为了达到金纳米粒子在PCR体系中的稳定性，并对金纳米粒子引物的偶联物用辅助DNA进行修饰；在合适的PCR条件下，进行金二聚体的组装，并对其进行TEM表征和CD信号比较。本发明中除了进行相同粒径的金纳米粒子的组装，还研究了大小不同粒径金纳米粒子的组装及其性质的研究。

Description

基于聚合酶链反应进行手性金二聚体的可控组装方法

技术领域

一种基于聚合酶链反应进行金二聚体的可控组装及其手性性质的研究，属于材料化学领域。

背景技术

纳米材料是指三维空间尺度至少有一维处于纳米量级(1-100nm)的材料，或由它们作为基本单元构成的材料，这大约相当于10~100个原子紧密排列在一起的尺度。它是由尺寸介于原子、分子和宏观体系之间的纳米粒子所组成的新一代材料。由于纳米材料的尺寸已经接近电子的德布罗意波长、超导相干波长以及激子的波尔半径，电子被局限于一个体积十分微小的空间，电子波函数受到限制，加上其具有大表面的特殊效应，从而具有量子尺寸效应、表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应等，因此纳米材料显示出与常规体相材料不同的新奇的光学、电学、磁学及化学方面的性质。对纳米材料的性质和应用进行研究即为纳米科学与技术(简称为纳米技术)。 纳米技术研究电子、原子和分子运动规律和特性的崭新高技术学科，开辟了人们认识自然的新层次，是21世纪头二十年发展的主导领域。

纳米材料的自组装也是纳米技术的一个研究热点，原因在于自组装纳米材料能够表现出不同于单分散的纳米粒子的独特的光学，电学，磁学和化学性质，通过研究自组装材料的性质可以更好地理解宏观材料的物理和化学性质。在可控纳米材料自组装的过程中，通过化学修饰对金纳米粒子二聚体的组装已有研究，但主要用于研究增强表面拉曼性质。而通过聚合酶链反应达到金纳米粒子二聚体的组装却很少报道，值得注意的是对金纳米粒子二聚体手性性质的研究更是少之又少。本发明主要通过控制金纳米粒子表面引物的偶联量通过聚合酶链反应手段以达到二聚体的组装，并对其手性性质的研究。因而这些独特的性质使得金纳米粒子能够实现可控自组装材料良好的“原料”，进而能够提供对自组装纳米材料进行理论解析的一个良好的模型。

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)，是分子生物学中应用的基础实验手段，是80年代中期发展起来的一种体外特定核酸序列扩增技术。它具有特异性强、扩增效率高、快速、简便、重复性好、易实现自动化等优点。纳米技术与生物技术相结合产生的纳米生物技术凭借其独特的性质得到了广泛的研究发展，被越来越多的科研人士所青睐。而金纳米粒子，由于其独特的物理、化学性质及生物相容性，在生物电化学、材料学及生物医学等领域都有很广泛的应用。将纳米材料结合到PCR过程中已成为近年来的研究热点，对于提高PCR的特异性和效率和组装结构手性性质的研究有很大的作用。

圆二色谱（CD）的原理是由不对称分子组成的物质是光学各向异性的,即L与R两束圆偏振光在这类物质中的传播速度不相等。假如光学各向异性物质在某一波长 λ有吸收，那将在该时对L光和R光有不同的吸收,如该物质的吸光率是A,而对L光和R光的吸光率是AL和AR，AL和AR的差ΔA＝AL-AR,称为圆二色性。物质对R和L两种圆偏振光吸收程度不同的现象称为圆二色性。这种吸收程度的不同与波长的关系称圆二色谱，是一种测定分子不对称结构的光谱法。在分子生物学领域中主要用于测定蛋白质的立体结构，也可用来测定核酸和多糖的立体结构。核酸中所含糖有不对称的结构，它们所含的双螺旋结构也是不对称的。它们在185～300纳米范围内也有特征的圆二色谱。这些谱与核酸的立体结构的关系虽不甚显著，但也可以用它研究某些立体结构，可以用圆二色谱对PCR组装后金二聚体的手性研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于聚合酶链反应进行手性金二聚体的可控组装的方法，并对组装结构的手性性质进行研究。

本发明的技术方案：一种基于聚合酶链反应进行手性金二聚体的可控组装方法，包括金纳米粒子的合成，金纳米粒子和上下游引物的偶联，金纳米粒子和引物偶联物的修饰，金二聚体的组装，组装结构的手性表征。

具体步骤：

（1）金纳米粒子合成

采用柠檬酸三钠还原氯金酸合成不同粒径的金纳米粒子。

（2）金纳米粒子和上下游引物的偶联

将合成出的金纳米粒子和巯基修饰的上下游引物进行偶联形成金纳米粒子-引物偶联物。

（3）金纳米粒子-引物偶联物的修饰

将金纳米粒子-引物偶联物和辅助DNA反应，得金纳米粒子-引物-DNA复合体；以达到稳定金纳米粒子的作用。

（4）金二聚体的组装及其表征

在合适的PCR条件下，将金纳米粒子-引物-DNA复合体在PCR体系中进行不同循环数下的组装，离心浓缩，进行表征，得可控组装的手性金二聚体。

模板：Plasmid  λDNA，

F-primer：5’-SH-ATGAAACGGCAGGCAGAACAGG-3’，

R-primer：5’-SH-ACAGGGACATCGCCACCAGAAA-3’，

辅助DNA：5’-AAAAAAAAAAAA-3’。

根据所述基于聚合酶链反应进行手性金二聚体的可控组装方法，不同粒径金纳米粒子的合成；

合成方案：洁净的三角烧瓶中加入95mL的水，而后向水中加入5mL的浓度为2g/L的氯金酸，加热，煮沸，紧接着加入2.5mL质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续6-8min以使柠檬酸三钠完全沉降；最后，冷却溶液至室温，稀释到100mL，4℃保藏，即制得粒径18nm的金纳米粒子；调整柠檬酸的用量得到不同粒径的金纳米粒子，质量浓度1%的柠檬酸的用量减少至1.4mL得到粒径25nm的金纳米粒子，1%的柠檬酸的用量增加至5.0 mL得到粒径10nm的金纳米粒子。

根据所述基于聚合酶链反应进行手性金二聚体的可控组装方法，金纳米粒子和上下游引物的偶联：

（a）将步骤（1）中制备的1mL的金纳米粒子10000r/min离心10min，用1mL的水分散，10000r/min离心10min，弃上清，用100μL含0.01%的SDS的pH8.0、0.01M的PBS分散，4℃保藏、待用；

（b）金纳米粒子和上游引物偶联：取上述制备好的50μL金纳米粒子加入50μL 1μM的F-primer，混匀，加2.5μL 2M的NaCl至反应体系中NaCl浓度达到50mM，振摇反应20min，再室温反应12h；

（c）金纳米粒子和下游引物偶联：取上述制备好的50μL金纳米粒子加入50μL 1μM的R-primer，混匀，加2.5μL 2M的NaCl至反应体系中NaCl浓度达到50mM，振摇反应20min，再室温反应12h；

（d）将上述（b）及（c）步骤中所得反应溶液在8000r/min离心10min，弃上清，后用100mL的超纯水分散沉淀，4℃保藏、分别得金纳米粒子-上游引物偶联物或金纳米粒子-下游引物偶联物，待用。

根据所述基于聚合酶链反应进行手性金二聚体的可控组装方法，金纳米粒子和引物偶联物的修饰；

在步骤（3）中的金纳米粒子-引物偶联物中加入50mL 5mM的辅助DNA，加2mL 2M NaCl溶液，反应12h；反应后的溶液在8000 r/min离心10min，弃上清，后用100μL的超纯水分散沉淀，4℃保藏、得金纳米粒子-引物-DNA复合体，待用。

根据所述基于聚合酶链反应进行手性金二聚体的可控组装方法，金二聚体的PCR组装及对产物的TEM和CD的表征；

（e）PCR：以λDNA为模板，采用制得的引物金纳米粒子-F-Primer及金纳米粒子-R-Primer进行PCR，PCR反应体系：dNTPs 1μL，0.5个单位的Taq DNA聚合酶，λDNA模板质粒0.5μL，PCR反应缓冲液5μL，分别取金纳米粒子-F-Primer 4μL和金纳米粒子-R-Primer 4μL，加灭菌水至总体积为50μL；

所述金纳米粒子选用10 nm金纳米粒子、18nm金纳米粒子、或25 nm金纳米粒子之一。

（f）扩增程序为：94℃ 预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1min，2-20个循环；72℃再延伸10 min；10℃保存，得PCR产物；

（g）取50μL PCR产物进行8000r/min离心10min，弃上清，后用50μL的超纯水分散沉淀，进行TEM和CD表征。

本发明所使用的DNA均购自中国上海生工生物工程有限公司，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。

本发明的有益效果：提供一种基于聚合酶链反应进行手性金二聚体的可控组装的方法，并对组装结构的手性性质进行研究。

附图说明

图1  18nm同粒径金二聚体组装的TEM图。

图2  10nm和25nm不同粒径金二聚体组装的TEM图。

图3  18nm同粒径金二聚体的CD图。

图4  10nm和25nm不同粒径金二聚体组装的CD图。

具体实施方式

实施例1：18nm同粒径金二聚体的组装

（1）金纳米粒子的合成

金纳米粒子的合成方案为：洁净的三角烧瓶中加入95mL的水，而后向水中加入5mL的浓度为2g/L的氯金酸，加热，煮沸，紧接着加入2.5mL 1%的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续6-8min以使柠檬酸三钠完全沉降。最后，溶液冷却至室温，稀释到100mL，4℃保藏。即制得18nm的金纳米粒子。

（2）金纳米粒子和引物偶联

 将制备的1mL的金纳米粒子10000r/min离心10min，用1mL的水分散，10000r/min离心10min，弃上清，用100μL的pH8.0的0.01M的PBS，0.01%的SDS分散，4℃保藏、待用。

 金纳米粒子和上游引物偶联：取上述制备好的50μL金纳米粒子加入50μL 1μM的F-primer，混匀，加2.5μL 2M的NaCl至反应体系中NaCl浓度达到50mM，振摇反应20min室温反应12h。

 金纳米粒子和下游引物偶联：取上述制备好的50μL金纳米粒子加入50μL 1μM的R-primer，混匀，加2.5μL 2M的NaCl溶液至反应体系中NaCl浓度达到50mM，振摇反应20min室温反应12h。

④ 将上述②及③步骤中反应溶液在8000r/min离心10min，弃上清，后用100μL的超纯水分散沉淀，4℃保藏、待用。

（3）金纳米粒子和引物偶联物的修饰

将步骤（2）中的混合物中加入50mL 5mM的辅助DNA，加2mL 2M NaCl溶液，反应12h。反应后的溶液在8000r/min离心10min，弃上清，后用100mL的超纯水分散沉淀，4℃保藏、待用。

（4）PCR组装

以λDNA为模板，采用制得的18nm金纳米粒子-F-Primer及18nm金纳米粒子-R-Primer进行PCR。PCR反应体系：dNTPs 1μL（购自上海生工），0.5个单位的Taq DNA聚合酶（购自上海生工），λDNA模板质粒0.5μL（购自宝成生物工程有限公司），PCR反应缓冲液5μL（购自上海生工），分别取18nm金纳米粒子-F-Primer 4μL和18nm金纳米粒子-R-Primer 4μL，加灭菌水至总体积为50μL；

扩增程序为：94℃ 预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1min，2(5,10)个循环；72℃再延伸10 min；10℃保存，得PCR产物；

取50μL PCR产物进行8000r/min离心10 min，弃上清，后用50μL的超纯水分散沉淀，进行TEM和CD表征。

实施例2 10nm和25nm不同粒径金二聚体的组装

调整柠檬酸的用量可以得到不同粒径的金纳米粒子，减少柠檬酸的用量至1.4mL可以得到更大25nm的金纳米粒子，增加柠檬酸的用量至5.0mL可以得到更小10nm左右的金纳米粒子。25nm的金纳米粒子和上游引物偶联，而10nm的金纳米粒子和下游引物偶联。其他步骤同实施例1。

Claims (1)

1.一种基于聚合酶链反应进行手性金二聚体的可控组装方法，其特征在于步骤包括金纳米粒子的合成，金纳米粒子和上下游引物的偶联，金纳米粒子和引物偶联物的修饰，金二聚体的组装及表征；

（1）金纳米粒子的合成

采用柠檬酸三钠还原氯金酸合成不同粒径的金纳米粒子；

（2）金纳米粒子和上下游引物的偶联

将合成出的金纳米粒子和巯基修饰的上下游引物进行偶联形成金纳米粒子-引物偶联物；

（3）金纳米粒子-引物偶联物的修饰

将金纳米粒子-引物偶联物和辅助DNA偶联，得金纳米粒子-引物-DNA复合体；

（4）金二聚体的组装及其表征

在合适的PCR条件下，将金纳米粒子-引物-DNA复合体在PCR体系中进行不同循环数下的组装，离心浓缩，进行表征，得可控组装的手性金二聚体；

模板：Plasmid  λDNA，

F-primer：5’-SH-ATGAAACGGCAGGCAGAACAGG-3’，

R-primer：5’-SH-ACAGGGACATCGCCACCAGAAA-3’，

辅助DNA：5’-AAAAAAAAAAAA-3’；

不同粒径金纳米粒子的合成：

合成方案：洁净的三角烧瓶中加入95mL的水，而后向水中加入5mL的浓度为2g/L的氯金酸，加热，煮沸，紧接着加入2.5mL质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续6-8min以使柠檬酸三钠完全沉降；最后，冷却溶液至室温，稀释到100mL，4℃保藏，即制得粒径18nm的金纳米粒子；调整柠檬酸的用量得到不同粒径的金纳米粒子，质量浓度1%的柠檬酸的用量减少至1.4mL得到粒径25nm的金纳米粒子，1%的柠檬酸的用量增加至5.0 mL得到粒径10nm的金纳米粒子；

金纳米粒子和上下游引物的偶联：

（a）将步骤（1）中制备的1mL的金纳米粒子10000r/min离心10min，用1mL的水分散，10000r/min离心10min，弃上清，用100μL含0.01%的SDS的pH8.0、0.01M的PBS分散，4℃保藏、待用；

（b）金纳米粒子和上游引物偶联：取上述制备好的50μL金纳米粒子加入50μL 1μM的F-primer，混匀，加2.5μL 2M的NaCl至反应体系中NaCl浓度达到50mM，振摇反应20min，再室温反应12h；

（c）金纳米粒子和下游引物偶联：取上述制备好的50μL金纳米粒子加入50μL 1μM的R-primer，混匀，加2.5μL 2M的NaCl至反应体系中NaCl浓度达到50mM，振摇反应20min，再室温反应12h；

（d）将上述（b）及（c）步骤中所得反应溶液，在8000r/min离心10min，弃上清，后用100μL超纯水分散沉淀，4℃保藏、分别得金纳米粒子-上游引物偶联物或金纳米粒子-下游引物偶联物，待用；

金纳米粒子和引物偶联物的修饰：

在步骤（3）中的金纳米粒子-引物偶联物中加入50mL 5mM的辅助DNA，加2mL 2M NaCl溶液，反应12h；反应后的溶液在8000 r/min离心10min，弃上清，后用100mL的超纯水分散沉淀，4℃保藏、得金纳米粒子-引物-DNA复合体，待用；

金二聚体的PCR组装及对产物的TEM和CD的表征：

（e）PCR：以λDNA为模板，采用制得的引物金纳米粒子-F-Primer及金纳米粒子-R-Primer进行PCR，PCR反应体系：dNTPs 1μL，0.5个单位的Taq DNA聚合酶，λDNA模板质粒0.5μL，PCR反应缓冲液5μL，分别取金纳米粒子-F-Primer 4 μL和金纳米粒子-R-Primer 4 μL，加灭菌水至总体积为50 μL；

所述金纳米粒子选用10 nm金纳米粒子、18nm金纳米粒子、或25 nm金纳米粒子之一；

（f）扩增程序为：94℃ 预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1min，2-20个循环；72℃再延伸10 min；10℃保存，得PCR产物；

（g）取50μL PCR产物进行8000r/min离心10min，弃上清，后用50μL的超纯水分散沉淀，进行TEM和CD表征。

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