CN105277528B - 一种金纳米花‑银纳米粒子双金属纳米组装体的藻毒素拉曼传感器的构建 - Google Patents
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Abstract
建立一种金纳米花‑银纳米粒子双金属纳米组装体的藻毒素拉曼传感器，属于材料化学应用领域。本发明主要内容包括提供一种表面凸起可控的金纳米花简便合成方法，通过控制盐酸羟胺的浓度可以得到具有不同凸起大小的金纳米花结构，基于“Y”型核酸适配体组装构型制备金纳米花‑银纳米粒子双金属纳米组装体，研究间距大小和双金属之间多热点下纳米组装体的电磁场强度变化，分析组装体的拉曼信号放大强度，构建藻毒素快速、特异性、高灵敏的拉曼传感检测器。
Description
技术领域
本发明建立一种金纳米花-银纳米粒子双金属纳米组装体的藻毒素拉曼传感器，属于材料化学应用领域。
背景技术
微囊藻毒素是蓝藻细菌在过营养化、强光照、高水温条件下增殖产生的毒性最强的一种物质，其中藻毒素-LR是在藻毒素中最常见的一种毒素。世界卫生组织提出了饮用水中藻毒素-LR的最高容许浓度为1nM。目前为实现高灵敏检测藻毒素-LR，主要采用电化学生物传感器、高效液相色谱法和免疫分析法。然而，电化学生物传感器由于电极需重复抛光且步骤相对繁琐而限制了其应用；高效液相色谱法耗时且灵敏度低；免疫分析依赖于抗体的稳定性且易受多步操作的影响。因此，迫切需要一种能够快速、灵敏检测藻毒素的分析方法。
近年来，表面增强拉曼技术急速发展，灵敏度高且能实现生物和化学检测。表面增强拉曼信号对“热点”的分布有高度响应，依赖于相邻纳米粒子之间特定等离子耦合电磁场强度。纳米粒子二聚体、链状、四面体结构和超结构等拉曼组装体，结合适配体传感器的特异性和稳定性，实验肿瘤标记物、核酸和重金属离子的检测。近期藻毒素适配体已被成功帅选，对藻毒素分子表现出高的亲和性和特异性。然而，利用拉曼适配体传感器实现藻毒素检测至今尚未建立。
合理设计稳定性好的拉曼活性基底是实现高灵敏检测的基础，需要严格选择和控制组装基元的类型和形状、粒子间隙和三维组装构型。金能产生稳定的拉曼信号，通过金纳米结构表面刺状化实现拉曼信号的放大。和球状金纳米粒子、纳米棒和纳米线相比，金纳米花的电场增强效果更显著。与此同时，银具有最强的等离子增强效应，将两种不同类型、不同形貌的等离子纳米粒子组装成拉曼基底，不仅可以利用银纳米粒子高的拉曼活性，同时金的引入可以提高组装体的稳定性，因此可以大大增强组装体的等离子耦合和光的相互作用。
因此本专利采用藻毒素适配体将金纳米花和银纳米粒子组装成核-卫星状结构，金纳米花的表面凸起和银纳米粒子接触部位可以增加拉曼“热点”的数目，增强两者之间的耦合作用，提高组装体的电磁场强度，进而放大组装体的拉曼信号。考虑到藻毒素适配体的长度，专利设计了“Y”型适配体的组装构型，可以减小银纳米粒子和金纳米花之间的间距，产生强的等离子耦合作用，提高纳米组装体在藻毒素检测中的灵敏度。
发明内容
本发明的目的是构建一种金纳米花-银纳米粒子双金属纳米组装体的藻毒素拉曼传感器。
本发明的技术方案包括：金纳米花的合成，金纳米花-银纳米粒子双金属纳米组装体的制备，藻毒素拉曼传感器的构建。
具体步骤：
(1)金纳米花的合成
采用种子生长法制备金纳米花，以氯金酸溶液为前驱体，柠檬酸钠为还原剂制备金种。通过在金种表面还原氯金酸制备金纳米花，控制盐酸羟胺的浓度可以得到具有不同凸起大小的金纳米花结构。金纳米花的表面等离子特性通过紫外-可见分光计测定，用透射电子显微镜表征金纳米花的形貌结构。
(2)金纳米花-银纳米粒子双金属纳米组装体的制备
通过金巯共价键在金纳米花表面修饰探针1，控制金纳米花和探针1的摩尔比是1:100，离心去除未修饰上的探针1；采用硼氢化钠还原法合成银纳米粒子，通过银巯共价键在银纳米粒子表面修饰探针2，控制银纳米粒子和探针2的摩尔比是1:10，离心去除未修饰上的探针2，随后在已制备好的银纳米粒子-探针2复合物表面修饰拉曼信标分子4-硝基苯硫酚。
取上述制备的金纳米花-探针1溶液、4-硝基苯硫酚-银纳米粒子-探针2溶液和藻毒素适配体，基于“Y”型核酸组装构型混合杂交，使得金纳米花和银纳米粒子组装成拉曼信号强的核-卫星状纳米结构，离心去除未组装上的银纳米粒子，将组装体重悬在Tris-硼酸溶液中。
(3)拉曼传感器的构建
在已制备好的金纳米花和银纳米粒子构成的核-卫星状组装体系中加入不同浓度的藻毒素，室温下孵育30min，部分银纳米粒子表面的适配体和藻毒素分子特异性识别，使得银纳米粒子从金纳米花表面脱落，离心去除被解离下来的银纳米粒子，通过拉曼光谱仪测定解离后的纳米组装体拉曼信号，建立纳米组装体拉曼信号强度和藻毒素浓度间的标准曲线。
本发明的有益效果：本发明提供一种表面凸起可控的金纳米花简便合成方法，制备一种基于“Y”型核酸组装构型的金纳米花-银纳米粒子双金属纳米组装体，构建藻毒素快速、特异性的拉曼传感检测器。
附图说明
图1金纳米花的透射电子显微镜照片
图2金纳米花-银纳米粒子双金属纳米组装体的透射电子显微镜照片
图3金纳米花-银纳米粒子双金属纳米组装体的拉曼图谱
图4拉曼传感检测器在藻毒素检测的标准曲线
表1核酸片段的编号、序列及长度
具体实施方式
实施例1
(1)金纳米花的合成
将1.25mL 5mM氯金酸溶液加入23.75mL超纯水中，混合均匀，快速加热至沸腾，沸腾条件下剧烈搅拌5min。快速加入500μL新鲜配置的质量分数为1％柠檬酸钠，反应10min。在剧烈搅拌下将500μL上述溶液快速加入到500μL质量分数1％聚乙烯吡咯烷酮和1mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液的混合体系中，加入300μL 10mM的氯金酸溶液和300μL 10mM盐酸羟胺溶液。反应2h后，将混合物以5000转每分钟转速下离心5min，将沉淀物溶解在100μL的超纯水中。
(2)金纳米花和银纳米粒子的表面修饰
取上述制备的100μL金纳米花溶液，加入10μL 10μM巯基修饰的探针1，金纳米花和探针1的摩尔比是1:100。混合均匀后加入到500μL含50mM氯化钠的Tris-硼酸缓冲液中孵育。12h后，将混合物以5000转每分钟转速下离心5min，去除为偶联上的探针1，将沉淀重悬在100μL的Tris-硼酸缓冲液中。
采用硼氢化钠还原法制备粒径大小为10nm的银纳米粒子，取2mL的银纳米粒子以8000转每分钟的速度离心10min，去除上清液，将沉淀重悬在200μL超纯水中。取200μL上述制备的银纳米粒子，加入20μL 10μM巯基修饰的探针2，银纳米粒子与探针2的摩尔比是1:10。12h后，将混合物以10000转每分钟转速下离心10min，去除为偶联上的探针2，将沉淀重悬在100μL的Tris-硼酸缓冲液中。加入2μL 100μM 4-硝基苯硫酚，使其终浓度为2μM，过夜反应，混合物以10000转每分钟转速下离心10min，去除为偶联上的4-硝基苯硫酚，将沉淀重悬在100μL的Tris-硼酸缓冲液中。
表1核酸片段的编号及序列
(3)金纳米花-银纳米粒子双金属纳米组装体的制备
取50μL金纳米花-探针1溶液、100μL 4-硝基苯硫酚-银纳米粒子-探针2溶液和100μL 1μM藻毒素适配体，混于500μL Tris-硼酸缓冲液中。12h后，溶液以5000转每分钟转速下离心5min，将沉淀物溶解在100μL超纯水中。基于“Y”型核酸组装构型制备金纳米花和银纳米粒子组装成拉曼信号强的核-卫星状纳米结构。
(4)藻毒素拉曼传感器的构建
将制备好的金纳米花和银纳米粒子构成的核-卫星状组装体作为拉曼基底用于藻毒素的检测。取100μL上述制备的组装体加入到500μL 20mM Tris-盐酸中，加入200μL不同浓度的藻毒素溶液混合(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10和50nM)，在室温下孵育30min，部分银纳米粒子表面的适配体和藻毒素分子特异性识别，使得部分银纳米粒子从金纳米花表面脱落，离心去除被解离下来的银纳米粒子，将沉淀物用70％乙醇溶液洗涤三次，以净化解离后的纳米组装体。通过拉曼光谱仪测定解离后的纳米组装体的拉曼信号，扫描时间为10s。建立纳米组装体拉曼信号强度和藻毒素浓度间的标准曲线。
Claims (5)
1.一种金纳米花-银纳米粒子双金属纳米组装体的藻毒素拉曼传感器的构建，其特征在于提供一种表面凸起可控的金纳米花简便合成方法，制备一种基于“Y”型核酸组装构型的金纳米花-银纳米粒子双金属纳米组装体，构建藻毒素快速、特异性的拉曼传感检测器；
具体步骤：
(1)金纳米花的合成
采用种子生长法制备金纳米花，以氯金酸溶液为前驱体，柠檬酸钠为还原剂制备金种，通过在金种表面还原氯金酸制备金纳米花，控制盐酸羟胺的浓度可以得到具有不同凸起大小的金纳米花结构，金纳米花的表面等离子特性由紫外-可见分光计测定，通过透射电子显微镜进行表征金纳米花的结构；
(2)金纳米花-银纳米粒子双金属纳米组装体的制备
通过金巯共价键在金纳米花表面修饰探针1，控制金纳米花和探针1的摩尔比是1:100，离心去除未修饰上的探针1；采用硼氢化钠还原法合成银纳米粒子，通过银巯共价键在银纳米粒子表面修饰探针2，控制银纳米粒子和探针2的摩尔比是1:10，离心去除未修饰上的探针2，随后在已制备好的银纳米粒子-探针2复合物表面修饰拉曼信标分子4-硝基苯硫酚；
取上述制备的金纳米花-探针1溶液、4-硝基苯硫酚-银纳米粒子-探针2溶液和藻毒素适配体，基于“Y”型核酸组装构型混合杂交，制备金纳米花和银纳米粒子组装的拉曼信号强的核-卫星状纳米结构，离心去除未组装上的银纳米粒子；
表1 核酸片段的编号及序列
(3)拉曼传感器的构建
在已制备好的金纳米花和银纳米粒子构成的核-卫星状组装体中加入不同浓度的藻毒素溶液，在室温下孵育30min，部分银纳米粒子表面的适配体和藻毒素分子特异性识别，使得部分银纳米粒子从金纳米花表面脱落，离心去除被解离下来的银纳米粒子，通过拉曼光谱仪测定解离后的纳米组装体的拉曼信号，建立纳米组装体拉曼信号强度和藻毒素浓度间的标准曲线。
2.根据权利要求1所述一种金纳米花-银纳米粒子双金属纳米组装体的藻毒素拉曼传感器的构建，其特征在于金纳米花的制备：
将1.25mL 5mM氯金酸溶液加入23.75mL超纯水中，混合均匀，快速加热至沸腾，沸腾条件下剧烈搅拌5min，快速加入500μL新鲜配置的质量分数为1％柠檬酸钠，反应10min，在剧烈搅拌下将500μL上述溶液快速加入到500μL质量分数1％的聚乙烯吡咯烷酮和1mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液的混合体系中，加入300μL 10mM的氯金酸溶液和300μL 10mM盐酸羟胺溶液，反应2h后，将混合物以5000转每分钟转速下离心5min，将沉淀物溶解在100μL的超纯水中，控制盐酸羟胺的浓度可以得到具有不同凸起大小的金纳米花结构。
3.根据权利要求1所述一种金纳米花-银纳米粒子双金属纳米组装体的藻毒素拉曼传感器的构建，其特征在于金纳米花和银纳米粒子的表面修饰：
取上述制备的100μL金纳米花溶液，加入10μL 10μM巯基修饰的探针1，金纳米花和探针1的摩尔比是1:100，混合均匀后加入到500μL含50mM氯化钠的Tris-硼酸缓冲液中孵育，12h后，将混合物以5000转每分钟转速下离心5min，去除未耦联上的探针1，将沉淀重悬在100μL的Tris-硼酸缓冲液中；
采用硼氢化钠还原法制备粒径大小为10nm的银纳米粒子，取2mL的银纳米粒子以8000转每分钟的速度离心10min，去除上清液，将沉淀重悬在200μL超纯水中，取200μL上述制备的银纳米粒子，加入20μL 10μM巯基修饰的探针2，银纳米粒子与探针2的摩尔比是1:10，12h后，将混合物以10000转每分钟转速下离心10min，去除未耦联上的探针2，将沉淀重悬在100μL的Tris-硼酸缓冲液中，加入2μL 100μM 4-硝基苯硫酚，使其终浓度为2μM，过夜反应，混合物以10000转每分钟转速下离心10min，去除未耦联上的4-硝基苯硫酚，将沉淀重悬在100μL的Tris-硼酸缓冲液中。
4.根据权利要求1所述一种金纳米花-银纳米粒子双金属纳米组装体的藻毒素拉曼传感器的构建，其特征在于金纳米花-银纳米粒子双金属纳米组装体的制备：
取50μL金纳米花-探针1溶液、100μL 4-硝基苯硫酚-银纳米粒子-探针2溶液和100μL 1μM藻毒素适配体，混于500μL Tris-硼酸缓冲液中，12h后，溶液以5000转每分钟转速下离心5min，将沉淀物溶解在100μL超纯水中，基于“Y”型核酸组装构型制备金纳米花和银纳米粒子组装成拉曼信号强的核-卫星状纳米结构。
5.根据权利要求1所述一种金纳米花-银纳米粒子双金属纳米组装体的藻毒素拉曼传感器的构建，其特征在于藻毒素拉曼传感器的构建：
将制备好的金纳米花和银纳米粒子构成的核-卫星状组装体作为拉曼基底用于藻毒素的检测，取100μL上述制备的组装体加入到500μL 20mM Tris-盐酸中，加入200μL不同浓度的藻毒素溶液混合，藻毒素溶液浓度为：0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10和50nM，在室温下孵育30min，部分银纳米粒子表面的适配体和藻毒素分子特异性识别，使得部分银纳米粒子从金纳米花表面脱落，离心去除被解离下来的银纳米粒子，将沉淀物用70％乙醇溶液洗涤三次，以净化解离后的纳米组装体，通过拉曼光谱仪测定解离后的纳米组装体的拉曼信号，扫描时间为10s，建立纳米组装体拉曼信号强度和藻毒素浓度间的标准曲线。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |