CN104308182B - 一种具有fret效应的金纳米粒子二聚体的组装方法 - Google Patents
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Abstract
一种具有FRET效应的金纳米粒子二聚体的组装方法，属于材料化学技术领域。本发明包括金纳米粒子合成，金纳米粒子功能化修饰，金纳米粒子上修饰荧光染料，金纳米粒子二聚体组装，FRET效应的产生及其表征。本发明通过在金纳米粒子上修饰功能化的PEG分子SH-PEG-COOH，并再在PEG上修饰荧光染料。利用PEG分子链状结构性质使得在贵金属纳米粒子表面周围的荧光染料也能表现出一定的荧光强度。同时，利用DNA可控自组装技术，将修饰有不同荧光染料的金纳米粒子组装成二聚体，使得两种荧光染料之间的距离能够进一步拉近，从而产生FRET效应。本发明得到了结构均一，荧光产率高的金纳米粒子二聚体。
Description
技术领域
一种具有FRET效应的金纳米粒子二聚体的组装方法，属于材料化学技术领域。
背景技术
荧光共振能量转移（FRET）是指距离小于10nm的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。供体的能量传递给临近的受体使得其自身荧光强度发生大幅度的降低，而受体的荧光强度大大增强。金纳米粒子作为一种贵金属纳米材料，其本身就会猝灭周围存在的荧光分子。但是，金纳米粒子良好的生物相容性以及可控的尺寸是研究生物体中分子之间相互作用以及生物医学治疗理想基质。通过在金纳米粒子上形成FRET，不仅能够作为组装体纳米材料显著的佐证，而且能为纳米材料在生物体中的变化规律、运动轨迹提供可靠依据。
本发明包括金纳米粒子合成，金纳米粒子功能化修饰，金纳米粒子上修饰荧光染料，金纳米粒子二聚体组装，FRET效应的产生及其表征。本发明通过在金纳米粒子上修饰功能化的PEG分子，并再在PEG上修饰荧光染料。利用PEG分子链状结构性质使得在贵金属纳米粒子表面周围的荧光染料也能表现出一定的荧光强度。同时，利用DNA可控自组装技术，将修饰有不同荧光染料的金纳米粒子组装成二聚体，使得两种荧光染料之间的距离能够进一步拉近，从而产生FRET效应。
发明内容
本发明公开了一种具有FRET效应的金纳米粒子二聚体的组装方法，得到了结构均一，荧光产率高的金纳米粒子二聚体。
本发明的技术方案：一种具有FRET效应的金纳米粒子二聚体的组装方法，
具体工艺步骤为：
（1）金纳米粒子合成
柠檬酸还原法合成金纳米粒子；
（2）金纳米粒子功能化修饰
步骤（1）中合成的金纳米粒子与一端带有巯基另一端带有羧基MW5000的双功能基团修饰的聚乙二醇分子SH-PEG-COOH偶联，形成Au-PEG-COOH复合体；
（3）金纳米粒子上修饰荧光染料
将步骤（2）中的Au-PEG-COOH复合体分别与荧光染料AlexaFluor594及AlexaFluor647偶联，形成Au-AF594和Au-AF647复合体；
（4）金纳米粒子二聚体组装
将步骤（3）中的Au-AF594及Au-AF647复合体分别与DNA1，DNA2偶联，形成Au-AF594-DNA1复合体及Au-AF647-DNA2复合体；将Au-AF594-DNA1复合体和Au-AF647-DNA2复合体杂交，形成金纳米粒子二聚体；
DNA1：5’-CAATAGCCCTTGGATAAAAAAAAAA-SH-3’，
DNA2：5’-ATCCAAGGGCTATTGAAAAAAAAAA-SH-3’；
（5）FRET效应的产生及其表征
将步骤（4）中的金纳米粒子二聚体与仅有一端带有巯基修饰的PEG（MW5000）溶液混匀，得到能够产生FRET效应的金纳米粒子二聚体，并对其进行透射电镜和荧光表征。
所述金纳米粒子的合成：
在洁净的三角烧瓶中加入195mL超纯水，再加入5mL4g/L的三水合四氯金酸溶液，加热，煮沸10min，然后加入3.6mL质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成酒红色，持续沸腾反应30min至颜色不再发生变化。最后，冷却至室温，即制得20nm左右的金纳米粒子。
所述金纳米粒子功能化修饰：
取1mL所述新制的20nm左右金纳米粒子，8500rpm离心15min，去上清，沉淀重悬于900μL含0.05%吐温20的超纯水中；再向其中加入15μL20μM的双功能基团修饰的PEG分子SH-PEG-COOH，SH-PEG-COOH是从LaysanBio,Inc公司买的，60℃水浴2h，冷却至室温，得到Au-PEG-COOH复合体。
所述金纳米粒子上修饰荧光染料：
将所述得到的Au-PEG-COOH复合体8500rpm离心15min，去上清，沉淀重悬于1mLpH4.7的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液（MES）中，将10μL1mM碳二亚胺（EDC）与10μL10mM琥珀酰亚胺（NHS）加入到Au-PEG-COOH复合体溶液中，室温静置4h；然后，分别取500μL活化后的Au-PEG-COOH复合体，8500rpm离心15min，去上清，沉淀分别重悬于500μL1μMAlexaFluor594（pH9.6）及500μL1μMAlexaFluor647（pH9.6）荧光染料中，室温避光静置12h后得到Au-AF594复合体及Au-AF647复合体。
所述金纳米粒子二聚体组装：
将所述得到的Au-AF594复合体与DNA1按摩尔浓度比为1：5混匀，Au-AF647复合体与DNA2按摩尔浓度比为1：5混匀，分别室温静置12h后，8500rpm离心15min，去上清，沉淀分别重悬于500μL含0.05%吐温20的超纯水中，得到Au-AF594-DNA1复合体及Au-AF647-DNA2复合体；然后将得到的两种复合体等体积混匀，室温避光反应12h，得到金纳米粒子二聚体。
所述FRET效应的产生及其表征：
将仅有一端带有巯基修饰的PEG溶液（分子量5000）按摩尔浓度比Au：PEG为1：1000加入到上述修饰有荧光染料的金纳米粒子二聚体溶液中，室温避光反应8h后，8500rpm离心15min，去上清，沉淀重悬于含0.05%吐温20的超纯水中，得到能够产生FRET效应的金纳米粒子二聚体；取200μL样品加入到比色皿中，将激发波长设定在594nm对其进行荧光发射光谱表征；另取10μL的上述金纳米粒子二聚体滴加到碳膜支持膜上，进行透射电镜表征。
所述DNA的编号、序列及长度如表1所示。
表1DNA的编号、序列及长度
注：本发明所使用的DNA均购自中国上海生工生物工程有限公司，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。
本发明的有益效果：本发明公开了一种具有FRET效应的金纳米粒子二聚体的组装方法，得到了结构均一，荧光产率高的金纳米粒子二聚体。
附图说明
图1金纳米粒子二聚体透射电镜图
图2金纳米粒子二聚体荧光发射光谱图。
具体实施方式
实施例1
所有的玻璃仪器都用王水浸泡24h，并用双蒸水清洗，晾干备用。实验中使用的水均为18.2MΩ的Milli-Q超纯水。
金纳米粒子的合成：
在洁净的三角烧瓶中加入195mL超纯水，再加入5mL4g/L的氯金酸溶液，加热，煮沸10min，然后加入3.6mL质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成酒红色，持续沸腾反应30min至颜色不再发生变化。最后，冷却至室温，即制得20nm左右的金纳米粒子。
金纳米粒子功能化修饰：
取1mL上述新制的金纳米粒子，8500rpm离心15min，去上清，沉淀重悬于900μL含0.05%吐温20的超纯水中。再向其中加入15μL20μM的SH-PEG-COOH分子，60℃水浴2h，冷却至室温，得到Au-PEG-COOH复合体。
金纳米粒子上修饰荧光染料：
将上述得到的Au-PEG-COOH复合体8500rpm离心15min，去上清，沉淀重悬于1mLMES缓冲液（pH4.7）中。将10μL1mMEDC与10μL10mMNHS加入到Au-PEG-COOH复合体溶液中，室温静置4h。然后，分别取500μL活化后的Au-PEG-COOH复合体，8500rpm离心15min，去上清，沉淀分别重悬于500μL1μMAlexaFluor594（pH9.6）及500μL1μMAlexaFluor647（pH9.6）荧光染料中，室温避光静置12h后得到Au-AF594复合体及Au-AF647复合体。
金纳米粒子二聚体组装：
将上述得到的Au-AF594复合体与DNA1按摩尔浓度比为1：5混匀，Au-AF647复合体与DNA2按摩尔浓度比为1：5混匀，分别室温静置12h后，8500rpm离心15min，去上清，沉淀分别重悬于500μL含0.05%吐温20的超纯水中，得到Au-AF594-DNA1复合体及Au-AF647-DNA2复合体。然后将得到的两种复合体等体积混匀，室温避光反应12h，得到金纳米粒子二聚体。
FRET效应的产生及其表征：
将仅有一端带有巯基修饰的PEG溶液（分子量5000）按摩尔浓度比Au:PEG为1:1000加入到上述修饰有荧光染料的金纳米粒子二聚体溶液中，室温避光反应8h，8500rpm离心15min，去上清，沉淀重悬于含0.05%吐温20的超纯水中，得到能够产生FRET效应的金纳米粒子二聚体。取200μL样品加入到比色皿中，将激发波长设定在594纳米并对其进行荧光发射光谱表征。另取10μL的上述金纳米粒子二聚体滴加到碳膜支持膜上，进行透射电镜表征。
Claims (1)
1.一种具有FRET效应的金纳米粒子二聚体的组装方法，其特征在于工艺步骤为：
（1）金纳米粒子合成
柠檬酸还原法合成金纳米粒子：在洁净的三角烧瓶中加入195mL超纯水，再加入5mL4g/L的三水合四氯金酸溶液，加热，煮沸10min，然后加入3.6mL质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成酒红色，持续沸腾反应30min至颜色不再发生变化；最后，冷却至室温，即制得20nm级的金纳米粒子；
（2）金纳米粒子功能化修饰
步骤（1）中合成的金纳米粒子与一端带有巯基另一端带有羧基MW5000的双功能基团修饰的聚乙二醇分子SH-PEG-COOH偶联，形成Au-PEG-COOH复合体：取1mL新制的20nm级金纳米粒子，8500rpm离心15min，去上清，沉淀重悬于900μL含0.05%吐温20的超纯水中；再向其中加入15μL20μM的双功能基团修饰的PEG分子SH-PEG-COOH，60℃水浴2h，冷却至室温，得到Au-PEG-COOH复合体；
（3）金纳米粒子上修饰荧光染料
将步骤（2）中的Au-PEG-COOH复合体分别与荧光染料AlexaFluor594及AlexaFluor647偶联，形成Au-AF594及Au-AF647复合体：
将得到的Au-PEG-COOH复合体8500rpm离心15min，去上清，沉淀重悬于1mLpH4.7的2-(N-吗啡啉)乙磺酸MES缓冲液中，将10μL1mM碳二亚胺EDC与10μL10mM琥珀酰亚胺NHS加入到Au-PEG-COOH复合体溶液中，室温静置4h；然后，分别取500μL活化后的Au-PEG-COOH复合体，8500rpm离心15min，去上清，沉淀分别重悬于500μL1μMpH9.6AlexaFluor594及500μL1μMpH9.6AlexaFluor647荧光染料中，室温避光静置12h后得到Au-AF594复合体及Au-AF647复合体；
（4）金纳米粒子二聚体组装
将步骤（3）中的Au-AF594及Au-AF647复合体分别与DNA1，DNA2偶联，形成Au-AF594-DNA1复合体及Au-AF647-DNA2复合体；将Au-AF594-DNA1复合体和Au-AF647-DNA2复合体杂交，形成金纳米粒子二聚体；
DNA1：5’-CAATAGCCCTTGGATAAAAAAAAAA-SH-3’，
DNA2：5’-ATCCAAGGGCTATTGAAAAAAAAAA-SH-3’；
将得到的Au-AF594复合体与DNA1按摩尔浓度比为1：5混匀，Au-AF647复合体与DNA2按摩尔浓度比为1：5混匀，分别室温静置12h后，8500rpm离心15min，去上清，沉淀分别重悬于500μL含0.05%吐温20的超纯水中，得到Au-AF594-DNA1复合体及Au-AF647-DNA2复合体；然后将得到的两种复合体等体积混匀，室温避光反应12h，得到金纳米粒子二聚体；
（5）FRET效应的产生及其表征
将步骤（4）中的金纳米粒子二聚体与仅有一端带有巯基修饰的PEG-5000溶液混匀，得到能够产生FRET效应的金纳米粒子二聚体，并对其进行透射电镜和荧光表征：
将仅有一端带有巯基修饰的PEG-5000溶液按摩尔浓度比Au：PEG为1：1000加入到上述修饰有荧光染料的金纳米粒子二聚体溶液中，室温避光反应8h后，8500rpm离心15min，去上清，沉淀重悬于含0.05%吐温20的超纯水中，得到能够产生FRET效应的金纳米粒子二聚体；取200μL样品加入到比色皿中，将激发波长设定在594nm对其进行荧光发射光谱表征；另取10μL的上述金纳米粒子二聚体滴加到碳膜支持膜上，进行透射电镜表征。
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