CN110237253B

CN110237253B - 紫外光介导的纳米颗粒自组装聚集体和应用

Info

Publication number: CN110237253B
Application number: CN201910351907.5A
Authority: CN
Inventors: 史海斌; 高明远; 程侠菊; 孙瑞
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2016-03-09
Filing date: 2016-08-25
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2036-08-25
Also published as: CN106267200B; CN106267200A; CN110237253A

Abstract

本发明公开了一种紫外光介导的纳米颗粒自组装聚集体和应用。本发明的制备方法包括以下步骤：1）在纳米颗粒表面上修饰PEG；2）在PEG末端氨基上修饰紫外光敏感性交联剂；和3）紫外光介导的纳米颗粒自组装。该方法首次使用了体积较小的交联剂，避免了纳米颗粒的沉淀；通过控制交联剂的用量与光照时间，实现了可控自组装；利用紫外光照射实现相同或不同种类纳米颗粒的自组装，扩展了方法的适用性。通过本发明的制备方法获得的紫外光介导的纳米颗粒自组装聚集体具有较低的毒性和较好的光热治疗效果，适合于开发成一种基于光热疗法的抗肿瘤药物，具有重要的科研及经济价值。

Description

紫外光介导的纳米颗粒自组装聚集体和应用

本发明属于发明名称为紫外光介导的纳米颗粒自组装聚集体、其制备方法和应用、申请日为2016年8月25日、申请号为2016107231171发明申请的分案申请，属于产品以及应用技术部分。

技术领域

本发明属于纳米颗粒自组装技术领域，具体涉及一种紫外光介导的纳米颗粒自组装聚集体的制备方法，通过该方法制备的聚集体，以及该聚集体在制备基于光热疗法（photothermal therapy，PTT）的抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

众所周知，纳米颗粒的性质与其尺寸、结构、形态有着密切的关系。具有不同尺寸、结构、形态的纳米颗粒会呈现出不同的表面效应和量子效应，进而表现出不同的光学、电学、磁学、力学和化学性质，这一特性在信息存储器、生物传感器、纳米器件、临床诊断材料等领域中具有重要的研究和应用价值。因此，纳米颗粒的可控自组装一直以来都是纳米技术领域中的研究热点。

传统的纳米颗粒（尤其是金属纳米颗粒）自组装主要是通过纳米颗粒自发地组织或聚集成一种热力学稳定、分布均一、性能特殊的结构的过程。该过程主要依靠两个因素来形成自组装体系：其一是通过非共价键（特别是氢键）作用来形成稳定的纳米自组装体系；其二是纳米体系为了达到最低能级所产生的自发自组装。常用的纳米颗粒自组装方法主要包括溶剂挥发法、磁电光诱导法、界面法及模板法等。然而，由于依赖非共价键作用或电荷间作用，通过这些传统方法所获得的纳米自组装体系往往呈现出较差的重复性和稳定性，大大制约了材料在生物体系中的应用。

为了克服传统方法的缺点，小分子交联剂的使用应运而生。由于其具有易于修饰、可控等优点，近年来成为纳米颗粒自组装技术中的一种有力方法。该方法利用小分子交联剂并且通过共价键或非共价键对纳米颗粒进行有序的自组装。然而，已报道的小分子交联剂常常会导致纳米颗粒发生沉淀，因此通常需要额外的化学手段来维持纳米颗粒的稳定性和均一性。此外，现有的小分子交联剂的合成过程大都较为复杂，这也制约了该方法在纳米颗粒自组装中的应用。

因此，寻找并开发一种简单、快速、可控的纳米颗粒自组装新方法具有重大的研究及应用价值。

发明内容

为了克服上述现有技术中存在的问题，本发明利用光敏感交联反应开发出一种简单、快速、绿色、稳定、可控的纳米颗粒自组装方法。该方法不仅适用于同种纳米颗粒之间的自组装，而且适用于不同纳米颗粒之间的杂化组装，为多功能纳米复合材料的制备提供了新的策略与手段。

具体而言，本发明提供了一种紫外光介导的纳米颗粒自组装聚集体的制备方法，其包括如下步骤：

（1）在纳米颗粒表面上修饰PEG：

按照纳米颗粒:甲氧基聚乙二醇硫醇（M-PEG-SH）:氨基聚乙二醇硫醇（NH₂-PEG-SH）=1~2:20:20的质量比，向纳米颗粒原液中加入甲氧基聚乙二醇硫醇和氨基聚乙二醇硫醇，于室温搅拌24~48小时，经超滤离心、加水重悬，得到经PEG修饰的氨基功能化纳米颗粒的母液；

（2）在PEG末端氨基上修饰紫外光敏感性交联剂：

按照经PEG修饰的氨基功能化纳米颗粒:紫外光敏感性交联剂:三乙胺=1:2~15:2~15的质量比，向步骤（1）中获得的所述经PEG修饰的氨基功能化纳米颗粒的母液中加入如式（I）所示的紫外光敏感性交联剂（化学名称为N-[3-(3-甲基-3H-双吖丙啶-3-基)丙酰氧基]琥珀酰亚胺，与之对应的英文名称为N-[3-(3-methyl-3H-diazirin-3-yl)propionyloxy]succinimide）和三乙胺，于室温搅拌2~5小时，经超滤离心，得到经紫外光敏感性交联剂修饰的纳米颗粒；

（3）紫外光介导的纳米颗粒自组装：

将步骤（2）中获得的所述经紫外光敏感性交联剂修饰的纳米颗粒加水重悬，并置于波长为365~405 nm的紫外光下照射，照射强度为1~12 W/cm²，照射时间为3~30分钟，得到紫外光介导的纳米颗粒自组装聚集体。

现有技术中的纳米颗粒大都适用于本发明的制备方法，能够最终实现紫外光介导的纳米颗粒自组装。优选的，在上述制备方法中，步骤（1）中所述纳米颗粒选自金属纳米颗粒、无机非金属纳米颗粒、有机纳米颗粒、无机-有机杂化纳米颗粒中的任意一种或其任意比例的混合物，更优选的，所述金属纳米颗粒为金纳米颗粒，所述无机非金属纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒，所述有机纳米颗粒为聚多巴胺纳米颗粒。

优选的，在上述制备方法中，步骤（1）中所述甲氧基聚乙二醇硫醇为两个末端分别由甲氧基和巯基修饰的聚乙二醇，其选自M-PEG₂₀₀₀-SH、M-PEG₅₀₀₀-SH、M-PEG₁₀₀₀₀-SH、M-PEG₂₀₀₀₀-SH中的任意一种或其任意比例的混合物；更优选的，所述甲氧基聚乙二醇硫醇为M-PEG₅₀₀₀-SH。所述甲氧基聚乙二醇硫醇发挥稳定化作用，防止纳米颗粒从原液中沉淀析出。

优选的，在上述制备方法中，步骤（1）中所述氨基聚乙二醇硫醇为两个末端分别由氨基和巯基修饰的聚乙二醇，其选自NH₂-PEG₂₀₀₀-SH、NH₂-PEG₅₀₀₀-SH、NH₂-PEG₁₀₀₀₀-SH、NH₂-PEG₂₀₀₀₀-SH中的任意一种或其任意比例的混合物；更优选的，所述氨基聚乙二醇硫醇为NH₂-PEG₅₀₀₀-SH。所述氨基聚乙二醇硫醇发挥功能化修饰作用。

优选的，在上述制备方法中，步骤（3）中所述紫外光由紫外光发射装置提供，所述紫外光发射装置为发射低能量紫外光的手持式紫外灯或发射高能量紫外光的紫外激光器；更优选的，所述紫外光发射装置为紫外激光器。

优选的，在上述制备方法中，所述水为超纯水。

另一方面，本发明提供了根据上述制备方法制备的紫外光介导的纳米颗粒自组装聚集体。

再一方面，本发明提供了上述紫外光介导的纳米颗粒自组装聚集体在制备基于光热疗法的抗肿瘤药物中的应用。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有如下优点：

（1）本发明中首次使用了体积较小的紫外光敏感性交联剂N-[3-(3-甲基-3H-双吖丙啶-3-基)丙酰氧基]琥珀酰亚胺，成功避免了由于交联剂体积过大而导致的纳米颗粒沉淀；

（2）通过控制交联剂的用量与光照时间，可有效调控纳米颗粒的自组装程度，从而实现纳米材料的可控自组装；

（3）利用紫外光照射实现相同或不同种类纳米颗粒的自组装，大大扩展了自组装技术的适用范围；

（4）本发明的自组装方法具有简便、快捷、稳定、可控和绿色环保等特点，极大地节约了制备时间，是一种快速制备多功能纳米材料的普适性新方法，具有广阔的应用空间。

附图说明

图1为实施例1中紫外光敏感性交联剂的合成流程图。

图2为实施例3中纳米颗粒表面PEG末端的交联剂修饰过程的示意图。

图3为实施例4中紫外光介导的纳米颗粒自组装过程的示意图。

图4为实施例5中金纳米颗粒经紫外光照射诱导自组装前后TEM图像。

图5为实施例5中金纳米颗粒交联前后的紫外吸收和粒径变化情况。

图6为实施例6中聚多巴胺（PDA）纳米颗粒经紫外光照射诱导自组装前后TEM图像。

图7为实施例7中金纳米颗粒与四氧化三铁纳米颗粒经紫外光诱导杂化组装的TEM图像。

图8为实施例8中金纳米颗粒经紫外光诱导交联前后的光热性能研究。

图9为实施例9中金纳米颗粒经紫外光诱导自组装前后对细胞的毒性和光热治疗效果研究。

具体实施方式

下文将结合附图和具体实施例来进一步阐述本发明。应当理解的是，这些实施例仅用于解释和说明本发明中的技术方案，而并非旨在限制本发明的范围。此外，除非另有说明，下列实施例中所使用的材料、试剂、仪器等均可通过商业手段获得。

实施例1：紫外光敏感性交联剂的合成与表征。

（1）在无水无氧、氮气保护的条件下，向盛有乙酰丙酸（2 g，17.2 mmol）的圆底烧瓶中缓慢加入7 M氨甲醇溶液（20 mL），于0℃搅拌下反应3 h；随后向混合液中滴加羟胺磺酸（3.24 g，28.6 mmol），于室温继续搅拌反应，过夜；反应结束后，过滤除去反应液中的白色沉淀，并用甲醇（10 mL）洗涤三次，滤液经旋蒸浓缩后，重新用无水甲醇（20 mL）溶解并加入反应瓶中，于0℃加入三乙胺（4.3 mL，30.9 mmol），并逐滴加入碘（2 g，8.0 mmol）的甲醇溶液，直至反应液变为红棕色，并且在10 min之内保持颜色不变；随后将反应液用乙酸乙酯（20 mL）稀释，依次用1 M HCl（30 mL×1）和饱和硫代硫酸钠溶液（30 mL × 3）洗涤，有机相经无水硫酸镁干燥后，旋干，得到中间体3-(3-甲基-3H-双吖丙啶-3-基)丙酸（其结构如图1中的化合物1所示）的粗产物，经硅胶柱层析（乙酸乙酯:石油醚=1:1）提纯后，得到中间体的纯品，产率为20%。

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃):δ 2.34-2.20 (m, 2H), 1.76 (dd, J=9.0Hz, 6.4Hz,2H), 1.08 (s, 3H)。

（2）于0℃向反应瓶中依次加入步骤（1）中获得的中间体（400 mg，3.13 mmol）、二氯甲烷（10 mL）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（396 mg，3.44 mmol）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC-HCl）（659 mg，3.44 mmol），室温下搅拌2 h；待反应结束后，用二氯甲烷稀释，用超纯水（25 mL × 3）洗涤，有机相经无水硫酸镁干燥后浓缩，得到紫外光敏感性交联剂N-[3-(3-甲基-3H-双吖丙啶-3-基)丙酰氧基]琥珀酰亚胺（其结构如图1中的化合物2所示）的粗产物，经硅胶柱层析（乙酸乙酯:石油醚=1:3）提纯后，得到纯的紫外光敏感性交联剂，产率为71%。

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃):δ 2.89 (s, 4H), 2.61-2.51 (m, 2H), 1.93-1.81(m, 2H), 1.13 (s, 3H)。

实施例2：金纳米颗粒的制备及其表面的PEG修饰。

向超纯水（100 mL）中加入1%的氯金酸溶液（0.6 mL），加热至100℃，剧烈搅拌至沸腾后加入1%的柠檬酸钠溶液（3 mL），待体系变成酒红色后，继续煮沸30 min，得到金纳米颗粒原液。

待冷却后，向金纳米颗粒原液（100 mL，内含金纳米颗粒1 mg）中依次加入M-PEG₅₀₀₀-SH（20 mg）和NH₂-PEG₅₀₀₀-SH（20 mg），于室温搅拌24 h。经超滤离心（5000 rpm ×10 min）2~3次，除掉多余的PEG。离心后用超纯水重悬，得到PEG修饰的氨基功能化金纳米颗粒母液。

实施例3：金纳米颗粒表面PEG末端修饰紫外光敏感性交联剂。

如图2所示，向实施例2中制得的经PEG修饰的氨基功能化金纳米颗粒母液（100mL，内含经PEG修饰的氨基功能化金纳米颗粒1 mg）中加入实施例1中制得的紫外光敏感性交联剂（2.7 mg）和三乙胺（2.4 mg），于室温搅拌反应2 h。经超滤离心（5000 rpm × 10min）2~3次后，得到经紫外光敏感性交联剂修饰的金纳米颗粒。通过测定反应前后溶液中紫外光敏感性交联剂的浓度，经计算可知，大约0.84 µmol的紫外光敏感性交联剂偶联于纳米颗粒表面。

实施例4：紫外光介导的金纳米颗粒自组装。

如图3所示，将实施例3中制得的经紫外光敏感性交联剂修饰的金纳米颗粒用超纯水重悬，置于紫外灯（365 nm，12 W/cm²）下照射25 min，便可诱导金纳米颗粒发生自组装，得到金纳米颗粒自组装聚集体。

实施例5：金纳米颗粒自组装前后的粒径分布和紫外吸收的变化。

将实施例4中未经过和经过紫外光照射的经紫外光敏感性交联剂修饰的金纳米颗粒母液100 μL分别用水稀释至2 mL，测试其粒径分布（DLS）和紫外吸收情况。

如图4a~4c所示，经PEG修饰的金纳米颗粒的尺寸分布较为均匀（约为20 nm），经手持式紫外灯（低能量UV，365 nm，25 min）和紫外激光器（高能量UV，405 nm，25 min）照射的金纳米颗粒均能发生交联自组装。然而，二者的聚集程度有所差异，后者的聚集程度明显强于前者。未经过紫外光照射的金纳米颗粒水合粒径约为50 nm，经低能量手持紫外灯照射的水合粒径约200 nm左右，而经紫外激光器照射的水合粒径约为350 nm。此外，纳米颗粒的聚集程度随照射时间的延长而增强（见图5a）。

图5b是金纳米颗粒光介导聚集后的紫外吸收变化。未经过紫外光照射的金纳米颗粒的最大吸收在524 nm左右，而经高能量紫外激光（405 nm）照射后的金纳米颗粒除了在536 nm左右有一个吸收峰以外，在700~900 nm区间吸收也有明显增强。而且，紫外激光照射后金纳米颗粒的吸收在不同时间点（5、10、15、20、25 min）的变化情况。随着照射时间的延长，吸收值在700~900 nm区间内逐渐升高，而在500~600 nm区间内则有所下降。

实施例6：紫外光介导的聚多巴胺（PDA）纳米颗粒自组装。

基于实施例3中记载的方法，制备表面经紫外光敏感性交联剂修饰的PDA纳米颗。向经PEG修饰的氨基功能化PDA纳米颗粒母液（0.5 mL，内含经PEG修饰的氨基功能化PDA纳米颗粒50 µg）中加入实施例1中制得的紫外光敏感性交联剂（0.675 mg）和三乙胺（0.607mg），于室温搅拌反应2 h。经超滤离心（8000 rpm × 10 min）2~3次后，得到经紫外光敏感性交联剂修饰的PDA纳米颗粒。

将100 μL上述纳米颗粒母液用水稀释至2 mL，利用TEM观察PDA纳米颗粒经紫外光照射前后间的自组装情况。

如图6所示，未经紫外光照射之前的PDA纳米颗粒的粒径分布均匀，约为100 nm（见图6a），经紫外激光器（405 nm）照射25 min之后，纳米颗粒明显发生交联自组装（见图6b）。

实施例7：紫外光介导的金纳米与四氧化三铁纳米颗粒之间的杂化组装。

按照1:5的质量比，将实施例3中制得的金纳米颗粒与四氧化三铁纳米颗粒混合，并用超纯水重悬，置于紫外激光器（405 nm，1 W/cm²）下照射25 min，利用TEM观察金纳米颗粒与四氧化三铁纳米颗粒间之的杂化组装。

如图7所示，经过紫外光照射后，四氧化三铁纳米颗粒会在金纳米颗粒表面发生聚集和交联。因此，本发明中方法也适用于不同纳米颗粒之间的杂化交联组装。

实施例8：金纳米颗粒光介导自组装后光热特性研究。

将实施例4中未经过和经过紫外光照射的光敏感金纳米颗粒母液100 μL分别用水稀释至2 mL，测其光热特性。

如图8a所示，金纳米颗粒自组装聚集体经近红外激光照射（808 nm，1 W/cm²），时间越长，温度升高越大。如图8b所示，将紫外光照射过的光敏感金纳米颗粒母液用水稀释至不同浓度（25，50，100，150，200 μg/mL）并置于1.5 mL EP管中，经808 nm近红外激光照射（5min）后，随着金纳米颗粒浓度的增大，温度升高越大。

此外，如图8c所示，紫外激光照射时间越长的金纳米颗粒自组装聚集体，经808 nm近红外激光照时间越长（0~300 s），温度升高越大。如图8d所示，当金纳米颗粒自组装聚集体经808 nm近红外激光照射（5 min），随着紫外激光照射时间的增长，温度升高越大，最高升温可达45℃，表明金纳米颗粒光介导聚集后具有较好的光热效应。

实施例9：金纳米颗粒光介导自组装后的细胞毒性及光热治疗效果。

细胞毒性实验方法：小鼠乳腺癌细胞（4T1）在96孔板中（密度3000个/孔）培养，孵育24 h后，经紫外激光（405 nm）照射不同的时间（1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 min），然后分别在24 h和48 h测MTT。

从图9a中可以看出，不同浓度经PEG修饰的氨基功能化金纳米颗粒对小鼠乳腺癌细胞（4T1）在24 h和48 h时均具有很低的毒性。

细胞内光热治疗实验方法：小鼠乳腺癌细胞（4T1）在96孔板中（密度3000个/孔）培养，孵育24 h后，分为六组（Control组，Au组，UV组，Au+UV组，Au+NIR组，Au+UV+NIR组，Au指加入实施例3中制得的紫外光敏感性交联剂修饰的金纳米颗；UV指405 nm紫外激光照射（1W/cm²，3 min）；NIR指808 nm的近红外光照射（1 W/cm²，5 min）；细胞生长24 h后测MTT。

如图9b所示，随着405 nm紫外光照射时间的延长（0~10 min），4T1细胞的存活率逐渐下降，后续细胞实验最优紫外光照射时间应为3 min。

从图9c中可以看出，光敏感交联剂修饰的金纳米颗粒在细胞孵育下经过405 nm紫外光照射（1 W/cm²，3 min）后，金纳米颗粒在细胞内发生自组装聚集，经过808 nm近红外光照射（1 W/cm²，5 min）后，细胞存活率较其他组别明显下降，说明本发明的方法能够在细胞内原位实现金纳米颗粒的自组装，并具有较好的光热治疗效果，能够有效杀死肿瘤细胞。

细胞成像实验方法：小鼠乳腺癌细胞（4T1）在6孔板中培养, 分为四组（Control组，Au+UV组，Au+NIR组，Au+UV+NIR组，Au指的是加入实施例3中制得的紫外光敏感性交联剂修饰的金纳米颗粒，UV指的是405nm紫外激光照射（1 W/cm²，3 min）；NIR指808 nm近红外光照射（1 W/cm²，5 min）；细胞生长24 h后用livedead染色试剂盒染色30 min，荧光显微镜下20倍拍照。

如图9d所示，金纳米颗粒在细胞内经紫外光照射会诱导自组装，经近红外光照射后，具有较好的光热治疗效果。

Claims

1.一种紫外光介导的纳米颗粒自组装聚集体，其特征在于：所述紫外光介导的纳米颗粒自组装聚集体的制备方法包括如下步骤：1）在纳米颗粒表面上修饰PEG：按照纳米颗粒∶甲氧基聚乙二醇硫醇∶氨基聚乙二醇硫醇=1～2∶20∶20的质量比，向纳米颗粒原液中加入甲氧基聚乙二醇硫醇和氨基聚乙二醇硫醇，于室温搅拌24～48小时，经超滤离心、加水重悬，得到经PEG修饰的氨基功能化纳米颗粒的母液；2）在PEG末端氨基上修饰紫外光敏感性交联剂：按照经PEG修饰的氨基功能化纳米颗粒∶紫外光敏感性交联剂∶三乙胺=1∶2～15∶2～15的质量比，向步骤1）中获得的所述经PEG修饰的氨基功能化纳米颗粒的母液中加入如式I所示的紫外光敏感性交联剂和三乙胺，于室温搅拌2～5小时，经超滤离心，得到经紫外光敏感性交联剂修饰的纳米颗粒；

3）紫外光介导的纳米颗粒自组装：将步骤2）中获得的所述经紫外光敏感性交联剂修饰的纳米颗粒加水重悬，并置于波长为365～405 nm的紫外光下照射，照射强度为1～12 W/cm²，照射时间为3～30分钟，得到紫外光介导的纳米颗粒自组装聚集体。

2.根据权利要求1所述紫外光介导的纳米颗粒自组装聚集体，其特征在于：步骤1）中所述纳米颗粒选自金属纳米颗粒、无机非金属纳米颗粒、有机纳米颗粒、无机-有机杂化纳米颗粒中的任意一种或其任意比例的混合物。

3.根据权利要求2所述紫外光介导的纳米颗粒自组装聚集体，其特征在于：所述金属纳米颗粒为金纳米颗粒；所述无机非金属纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒；所述有机纳米颗粒为聚多巴胺纳米颗粒。

4.根据权利要求1所述紫外光介导的纳米颗粒自组装聚集体，其特征在于：步骤1）中所述甲氧基聚乙二醇硫醇选自M-PEG₂₀₀₀-SH、M-PEG₅₀₀₀-SH、M-PEG₁₀₀₀₀-SH、M-PEG₂₀₀₀₀-SH中的任意一种或其任意比例的混合物；步骤1）中所述氨基聚乙二醇硫醇选自NH₂-PEG₂₀₀₀-SH、NH₂-PEG₅₀₀₀-SH、NH₂-PEG₁₀₀₀₀-SH、NH₂-PEG₂₀₀₀₀-SH中的任意一种或其任意比例的混合物。

5.根据权利要求1所述紫外光介导的纳米颗粒自组装聚集体，其特征在于：步骤3）中所述紫外光由紫外光发射装置提供，所述紫外光发射装置为手持式紫外灯或紫外激光器。

6.根据权利要求1所述紫外光介导的纳米颗粒自组装聚集体，其特征在于：所述水为超纯水。

7.权利要求1所述紫外光介导的纳米颗粒自组装聚集体在制备基于光热疗法的抗肿瘤药物中的应用。