CN108853495A - 一类基于荧光素衍生染料的复合纳米粒子、其制备方法及应用 - Google Patents

一类基于荧光素衍生染料的复合纳米粒子、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一类基于荧光素衍生染料的复合纳米粒子、其制备方法及应用。本发明基于一类具有热激活延迟荧光性质的长寿命三重态的荧光素衍生染料，其通过共价连接方式负载于无机纳米粒子上，制备成的复合纳米粒子可以快速促进单线态氧的产生。所制备的这种功能性复合纳米粒子，具有光动力治疗应用前景，有望用于肿瘤光动力治疗。

Description

一类基于荧光素衍生染料的复合纳米粒子、其制备方法及 应用
技术领域
本发明涉及一类基于荧光素衍生染料的复合纳米粒子，其制备方法及其应用。该类荧光素衍生染料具有长寿命三重态，所制备的荧光素衍生染料复合纳米粒子，可以用于光动力治疗。
技术背景
光动力治疗(Photodynamic Therapy，PDT)是一种有效的治疗癌症的方法，其具有创伤小、毒副作用小等优点，逐步成为一种独具特点又效果明显的肿瘤治疗手段。
目前用于光动力治疗的光敏剂品种比较单一，常见的一类为卟啉类化合物，选择面较窄。开发纯有机染料分子用作光敏剂，用于光动力治疗，具有价格便宜，吸光效率高，副作用低等优势，但这类有机光敏剂普遍存在的问题，一是其三重态寿命短，导致单重态氧敏化效率低，最终影响光动力治疗效果；二是这类有机光敏剂的光稳定性不足，尤其在细胞环境中，有机染料光敏剂分子易发生严重的光降解。在前期工作中，我们开发了一类基于荧光素染料的衍生化合物，在保持较好的光稳定性的同时，具有长的三重态寿命。这类长寿命三重态光敏剂具有独特延迟荧光性质，前期被用于时间分辨生物荧光成像研究中。但其用作光敏剂，用于光动力治疗的研究并未开展。
由于这类荧光素衍生染料分子本身没有靶向性，本发明专利拟利用纳米粒子在肿瘤组织的増强渗透和保留效应(EPR效应)，将课题组前期原创的一类长寿命三重态荧光素衍生化合物，通过与无机纳米粒子进行复合，获得高效率的具有肿瘤靶向能力的复合纳米粒子，用作光动力治疗的光敏剂。相对于单个小分子有机光敏剂，除了EPR效应的靶向性外，一方面，单个纳米粒子上可富集多个小分子光敏剂，有利于敏化产生更多的单线态氧；另一方面，纳米粒子对染料分子具有一定的保护作用，可进一步提高光敏剂的光稳定性。这种富集效应和保护作用使得这类复合纳米粒子可更望获得更高效率的光动力治疗效果。
发明内容
该发明解决的技术难题是提供了一类基于荧光素衍生染料复合纳米粒子、其制备方法及其应用。本发明的复合纳米粒子以无机纳米粒子为载体，利用硅烷偶联剂将该无机纳米粒子和荧光素衍生染料连接生成。该复合纳米粒子仍然具有高的系间窜越效率，很容易和氧气反应，生成单线态氧。此外该复合纳米粒子在660nm红外光激发下同样具有光动力效果，有高单线态氧量子产率，对肿瘤具有好的光动力治疗效果。具体的，本发明的所述的荧光素衍生染料具有通式Ⅰ的结构：
其中：
R0选自H、F、Cl、Br和I；
R和R’分别独立选自H，R1，R2，R3，R4和R5；
R”选自-OH或R6；且n为2，3或4；
在上述技术方案中，所述的无机纳米粒子为二氧化硅纳米粒子、金纳米粒子或四氧化三铁纳米粒子等。
在上述技术方案中，所述的荧光素衍生染料连接在所述无机纳米粒子的外表面或连接在所述无机纳米粒子内部。
在上述技术方案中，所述的硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷、4-氨基丁基三乙氧基硅烷、2-(三乙氧基甲硅烷基)-乙胺中的一种。
对于上文所述的基于荧光素衍生染料的复合纳米粒子，其制备方法包括如下步骤：
(1)将式ⅰ的化合物和乌洛托品按摩尔比1:5～12反应，得式ⅱ的化合物，其中反应温度为90～180℃，反应时间为18-30h，反应溶剂选自三氟乙酸、乙酸、磷酸或其混合物中的一种；
(2)将式ⅱ的化合物溶于不同比例的无水乙醇甲醇中，冰水浴搅拌，5-20min后，加入一定量的碱溶液，其中，化合物ⅱ和碱溶液的摩尔比为1～10:1；5-20min后，逐滴滴加式ⅳ、ⅴ、ⅵ、或ⅶ的化合物，式ⅱ的化合物和式ⅳ、ⅴ、ⅵ、或ⅶ的化合物按摩尔比1:1-1:10，反应1-3h后撤掉冰浴，继续反应2-5h后抽滤、提纯、得到R”选自-OH的化合物Ⅰ；所述碱溶液选自氢氧化钾、醋酸铵或哌啶中的一种；
其中ⅳ、ⅴ、ⅵ和ⅶ的结构分别为
(3)将式Ⅰ的化合物、缩合剂和酰化反应催化剂按摩尔比1:(5～15):4混合，在真空、氮气保护下室温反应1～2h，反应溶剂为无水DMF，反应结束后加入硅烷偶联剂，反应10～14小时，得式Ⅱ的化合物；缩合剂选自HOBT、HBTU、DCC或EDCI中的一种；酰化反应催化剂选自Lewis酸、NHS或DMAP中的一种；
对于上文所述的基于荧光素衍生染料的复合纳米粒子，其制备方法包括如下步骤：
(1)制备氨基化无机纳米粒子NP-NH2向TX-100中滴加正辛醇，搅拌至形成透明溶液后，加入环己烷，形成复合溶液体系，所述的复合溶液体系中TX-100、正辛醇和环己烷的加入量比例为(1-4)g：(2-5)mL：(10-30)mL；之后向复合溶液体系中滴加去离子水，再滴加TEOS，搅拌，加入氨水，反应10-15h后，加入权利要求4所述的硅烷偶联剂，所述的去离子水、TEOS、氨水以及硅烷偶联剂的加入量比例为(0.5-2)mL：(100-250)μL：(50-200)μL：(10-60)μL，反应10-15h，加入总液体体积1-3倍的丙酮破乳，离心、用无水乙醇洗涤，真空干燥制得NP-NH2；
(2)将步骤(3)所得的NP-NH2、缩合剂和酰化反应催化剂按照质量比1:(1～2):(1～10)混合，NP-NH2混合之前预先分散在DMF中；所述式Ⅰ的化合物与混合液中的氨基化无机纳米粒子的质量比为1:1～5，搅拌10-15h，得荧光素衍生染料复合纳米粒子NP-1；缩合剂选自HOBT、HBTU、DCC或EDCI中的一种；酰化反应催化剂选自Lewis酸、NHS或DMAP中的一种；
(3)TX-100中滴加正辛醇，搅拌至形成透明溶液后，加入环己烷，形成复合溶液体系，复合溶液体系中TX-100、正辛醇和环己烷的加入量比例为(1-4)g：(2-5)mL：(10-30)mL；之后向复合溶液体系中滴加浓度为3-10mg/mL的式Ⅱ的化合物的水溶液，再滴加TEOS，搅拌，最后加入氨水，所述的式Ⅱ的化合物的水溶液、TEOS以及氨水的加入量比例为(0.5-2)mL：(100-250)μL：(50-200)μL；反应20-25h后，加入总液体体积1-3倍的丙酮破乳，离心、用无水乙醇洗涤，真空干燥，得荧光素衍生染料复合纳米粒子NP-2；
本发明还提供上述的荧光素衍生染料复合纳米粒子在制备光动力治疗药物中的应用。与小分子有机荧光染料相比，荧光染料复合纳米粒子可以将更多单独的荧光染料聚集在单个纳米粒子上，这种富集效应有望产生更好的光动力学治疗效果。
本发明的有益效果：本发明选择的纳米粒子是一种比表面积比较大的物质，其表面上能够连接很多个荧光素衍生物，这样就可以实现在同样的浓度下用少量药物的效果；同时，荧光素衍生染料也可以内包进纳米粒子而形成复合粒子，从而增加其进细胞的能力。并且，根据本发明实施例的数据结果显示，所述荧光素衍生染料O2的量子产率特别高，证明其杀死肿瘤细胞的效果特别好。因此本发明所述的复合纳米粒子在肿瘤治疗方面有广阔的应用前景。
附图说明
图1分别为实施例1中基于荧光素衍生染料的复合纳米粒子NP-1和NP-2的透射电镜图。
图2为实施例1中基于荧光素衍生染料的复合纳米粒子NP-1及DPK-DCF、NP-NH2的傅里叶变换红外光谱。
图3为实施例1、2中基于荧光素衍生染料的复合纳米粒子NP-1、NP-2及化合物DPK-DCF的归一化吸收光谱图。
图4为实施例1、2中基于荧光素衍生染料的复合纳米粒子NP-1、NP-2及化合物DPK-DCF的归一化发射光谱图。
图5(a)为实施例1中基于荧光素衍生染料的复合纳米粒子NP-1的乙腈溶液中加入1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)后在红外灯照射下不同时间下吸收度的变化，(b)图为体系中不含光敏剂NP-1时，DPBF吸光度的变化。
图6(a)为实施例2中基于荧光素衍生染料的复合纳米粒子NP-2的乙腈溶液中加入DPBF后在红外灯照射下不同时间下吸光度的变化，(b)图为体系中不含光敏剂NP-2时，DPBF吸光度的变化。
图7为实施例2中基于荧光素衍生染料的复合纳米粒子NP-2的细胞成像图，所用的细胞为Hela细胞。
图8为实施例2中基于荧光素衍生染料的复合纳米粒子NP-2的细胞毒性图，所用的细胞为Hela细胞。
具体实施方式
下述实施例中，如无特殊说明，所用试剂均可由常规方法制备或由商业途径购买。下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。
实施例1
一类基于荧光素衍生染料纳米粒子NP-1的合成路线：
(1)合成化合物Ⅰ
取2’7’-二氯荧光素(DCF)2.4g，乌洛托品3.36g，溶解在含20mL三氟乙酸的圆底烧瓶中搅拌均匀，置于搅拌器加热到90℃，反应24h后，停止加热，向圆底烧瓶中加过量体积的稀盐酸，继续搅拌至有沉淀析出。用布什漏斗抽滤，提纯,得到双醛。
取双醛100mg置于圆底烧瓶中，20mL无水甲醇溶解冰水浴搅拌，10min后，加入10mL20％KOH溶液，10min后，逐滴滴加100μL苯乙酮，反应2h后撤掉冰浴，继续反应2h，反应结束后抽滤，提纯，得到化合物Ⅰ。
(2)合成空白纳米粒子NP-NH2
取TX-100 3.5g置于100mL的圆底烧瓶中于室温水浴锅中搅拌，然后加入4.4mL的正辛醇至混合溶液呈清明状态，然后加入环己烷20mL继续搅拌20min，20min后加1mL的去离子水于烧瓶中，接下来逐滴滴加200μL TEOS于体系中，搅拌2min后再加入氨水100μL。反应30min后降低转速。12h后向体系内逐滴滴加20μL APTES。反应12h后向溶液体系中加入过量的丙酮破乳，5min后关闭搅拌，等沉淀析出后，用离心机将纳米颗粒离心出来，在此过程中用无水乙醇清洗三次。离心结束后，将纳米颗粒于70℃烘箱内烘干,12h后取出置于通风干燥环境下保存。
(3)合成纳米粒子NP-1
取50mg NP-NH2于100mL的圆底烧瓶中，先置于70℃烘箱中活化，2h后取10mL的DMF于烧瓶中，将烧瓶置于超声中，半小时后置于反应台上常温搅拌。取DMAP 200mg，EDCI 60mg于烧瓶中搅拌均匀后，逐滴滴加10mL已经用DMF溶解好的DPK-DCF。12h后，停止反应，离心，用无水乙醇洗三遍，真空干燥，得到NP-1。
实施例2
一类基于荧光素衍生染料纳米粒子NP-2的合成路线：
(1)合成包球前体化合物Ⅱ
称取化合物DPK-DCF 6.6mg，EDCI 20mg，DMAP 5mg于圆底烧瓶中，抽真空。向该烧瓶中加入10mL无水DMF，N2保护下反应。常温搅拌1h后，加APTES 40μL，反应12h后，停止反应，向反应中加入大量乙醚，用砂芯漏斗抽滤，得到的固体用甲醇溶解，旋干，得到化合物Ⅱ。
(2)合成纳米粒子NP-2
取TX-100 3.5g置于100mL的圆底烧瓶中于室温水浴锅中搅拌，然后加入4.4mL的正辛醇至混合溶液呈清明状态，然后加入环己烷20mL继续搅拌20min，20min后逐滴滴加1mL的溶解化合物Ⅲ的去离子水于体系中，接下来逐滴滴加200μL TEOS于体系中，搅拌2min后再加入氨水100μL。反应30min后降低转速。反应24h后向溶液体系中加入过量的丙酮破乳，5min后关闭搅拌，等沉淀析出后，用离心机将纳米颗粒离心出来，在此过程中用无水乙醇清洗三次。离心结束后，将纳米颗粒于70℃烘箱内烘干，12h后取出置于通风干燥环境下保存，得到NP-2。
实施例3
图1中左右两幅分别为实施例1和实施例2中所制得的复合所制得的复合纳米粒子NP-1和NP-2的透射电镜图(TEM)。通过透射电镜准确观测到荧光纳米粒子的细微结构并准确算出荧光纳米粒子NP-1、NP-2的粒径均约为50nm左右。
图2为实施例1中所制得的复合纳米粒子NP-1及DPK-DCF、NP-NH2的傅里叶变换红外光谱。通过分析比较化合物DPK-DCF和荧光纳米粒子NP-1的傅里叶变换红外光谱，可知它们都具有相同的特征吸收带：3080cm-1处为不饱和碳氢伸缩振动，1690cm-1处为羰基和双键共轭，1260cm-1处为芳香酮的伸缩振动等等。有效证明了化合物DPK-DCF连接在了纳米粒子NP-NH2的外围，形成了纳米粒子NP-1。图2中并没有提到NP-2的傅里叶变换红外光谱图，是因为纳米粒子NP-2是通过将化合物DPK-DCF-Si连接在纳米粒子的内部制备的，因此化合物DPK-DCF的特征吸收带被纳米粒子遮蔽而无法显示，所以纳米粒子NP-2的红外光谱图就没有列举出来。
图3为实施例1和实施例2中所制得的复合纳米粒子NP-1、NP-2及化合物DPK-DCF的归一化吸收光谱图。纳米粒子NP-1、NP-2及化合物DPK-DCF的浓度分别为0.5mg/mL、0.5mg/mL、10μL，溶剂为乙腈，可以看到吸收光谱中，NP-1和NP-2的吸收峰分别为525nm和515nm。
图4为实施例1、2中所制得的复合纳米粒子NP-1、NP-2及化合物DPK-DCF的归一化发射光谱图。纳米粒子NP-1、NP-2及化合物DPK-DCF的浓度分别为0.5mg/mL、0.5mg/mL、10μL，溶剂为乙腈，可以看到发射光谱中，NP-1和NP-2的发射峰分别为587nm和547nm。
图5(a)为实施例1中所制得的复合纳米粒子NP-1的乙腈溶液中加入1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)后，在红外灯照射下，不同时间下吸收度的变化，(b)图为体系中不含光敏剂NP-1时，DPBF吸光度的变化。实验采用功率为12W，激发波长为660nm的近红外LED光源，距离为5cm。结果表明：NP-1的单线态氧量子产率高，能够在短时间(60min)内使DPBF的吸收从1.8下降到0.9。
图6(a)为实施例2中所制得的复合纳米粒子NP-2的乙腈溶液中加入DPBF后，在红外灯照射下不同时间下吸光度的变化，(b)图为体系中不含光敏剂NP-2时，DPBF吸光度的变化。实验采用功率为12W，激发波长为660nm的近红外LED光源，距离为5cm。结果表明：NP-2的单线态氧量子产率也高，但是和NP-1相比，还是低很多。两者比较之后，光动力治疗过程会优先选择NP-1。
图7为实施例1中所制得的复合纳米粒子NP-1的细胞成像图，所用细胞为Hela细胞。细胞培养条件：37℃、5％的CO2浓度和60％的湿度氛围，培养24h后，在双光子共聚焦显微镜下得到成像图。结果表明：纳米粒子NP-1可以进入细胞，并且成像效果佳。
图8为实施例1中所制得的复合纳米粒子NP-1的细胞毒性图，所用细胞为Hela细胞。细胞培养条件：37℃、5％的CO2浓度和60％的湿度氛围，培养24h后，培养皿取出，使用660nm的LED照射培养皿，进行光动力治疗。LED灯与培养皿间的距离为5cm，照射时间为20min。光照结束后，使用MTT进行细胞毒性测试。(a)图为纳米粒子NP-1在光照射条件下和黑暗条件下细胞的成活率；(b)图为在光照条件下，纳米粒子NP-1和空白纳米粒子NP-NH2的细胞成活率。结果表明：当浓度小于50μM时，细胞存活率有减小的趋势，证明纳米粒子NP-1有光动力治疗效果。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (7)

1.一种基于荧光素衍生染料的复合纳米粒子，其特征在于，该复合纳米粒子是利用硅烷偶联剂将荧光素衍生染料和无机纳米粒子连接而形成的，所述的荧光素衍生染料具有通式Ⅰ的结构：
其中：
R0选自H、F、Cl、Br和I；
R和R’分别独立选自H，R1，R2，R3，R4和R5；
R”选自-OH或R6；且n为2，3或4；
R6：
2.根据权利要求1所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述的无机纳米粒子选自二氧化硅纳米粒子、金纳米粒子或四氧化三铁纳米粒子中的一种。
3.根据权利要求1所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述的荧光素衍生染料连接在所述无机纳米粒子的外表面或连接在所述无机纳米粒子内部。
4.根据权利要求1所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述的硅烷偶联剂选自3-氨丙基三乙氧基硅烷、4-氨基丁基三乙氧基硅烷或2-(三乙氧基甲硅烷基)-乙胺中的一种。
5.根据权利要求1所述的荧光素衍生染料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将式ⅰ的化合物和乌洛托品按摩尔比1:5～12反应，得式ⅱ的化合物，其中反应温度为90～180℃，反应时间为18-30h，反应溶剂选自三氟乙酸、乙酸、磷酸或其混合物中的一种；
(2)将式ⅱ的化合物溶于不同比例的无水乙醇甲醇中，冰水浴搅拌，5-20min后，加入一定量的碱溶液，其中，化合物ⅱ和碱溶液的摩尔比为1～10:1；5-20min后，逐滴滴加式ⅳ、ⅴ、ⅵ、或ⅶ的化合物，式ⅱ的化合物和式ⅳ、ⅴ、ⅵ、或ⅶ的化合物按摩尔比1:1-1:10，反应1-3h后撤掉冰浴，继续反应2-5h后抽滤、提纯、得到R”选自-OH的化合物Ⅰ；所述碱溶液选自氢氧化钾、醋酸铵或哌啶中的一种；
其中ⅳ、ⅴ、ⅵ和ⅶ的结构分别为
(3)将式Ⅰ的化合物、缩合剂和酰化反应催化剂按摩尔比1:(5～15):4混合，在真空、氮气保护下室温反应1～2h，反应溶剂为无水DMF，反应结束后加入硅烷偶联剂，反应10～14小时，得式Ⅱ的化合物；缩合剂选自HOBT、HBTU、DCC或EDCI中的一种；酰化反应催化剂选自Lewis酸、NHS或DMAP中的一种；
6.根据权利要求1所述的基于荧光素衍生染料的复合纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备氨基化无机纳米粒子NP-NH2向TX-100中滴加正辛醇，搅拌至形成透明溶液后，加入环己烷，形成复合溶液体系，所述的复合溶液体系中TX-100、正辛醇和环己烷的加入量比例为(1-4)g：(2-5)mL：(10-30)mL；之后向复合溶液体系中滴加去离子水，再滴加TEOS，搅拌，加入氨水，反应10-15h后，加入权利要求4所述的硅烷偶联剂，所述的去离子水、TEOS、氨水以及硅烷偶联剂的加入量比例为(0.5-2)mL：(100-250)μL：(50-200)μL：(10-60)μL，反应10-15h，加入总液体体积1-3倍的丙酮破乳，离心、用无水乙醇洗涤，真空干燥制得NP-NH2；
(2)将步骤(3)所得的NP-NH2、缩合剂和酰化反应催化剂按照质量比1:(1～2):(1～10)混合，NP-NH2混合之前预先分散在DMF中；所述式Ⅰ的化合物与混合液中的氨基化无机纳米粒子的质量比为1:1～5，搅拌10-15h，得荧光素衍生染料复合纳米粒子NP-1；缩合剂选自HOBT、HBTU、DCC或EDCI中的一种；酰化反应催化剂选自Lewis酸、NHS或DMAP中的一种；
(3)TX-100中滴加正辛醇，搅拌至形成透明溶液后，加入环己烷，形成复合溶液体系，复合溶液体系中TX-100、正辛醇和环己烷的加入量比例为(1-4)g：(2-5)mL：(10-30)mL；之后向复合溶液体系中滴加浓度为3-10mg/mL的式Ⅱ的化合物的水溶液，再滴加TEOS，搅拌，最后加入氨水，所述的式Ⅱ的化合物的水溶液、TEOS以及氨水的加入量比例为(0.5-2)mL：(100-250)μL：(50-200)μL；反应20-25h后，加入总液体体积1-3倍的丙酮破乳，离心、用无水乙醇洗涤，真空干燥，得荧光素衍生染料复合纳米粒子NP-2；
7.权利要求1～4中任一项所述的基于荧光素衍生染料的复合纳米粒子用作光动力治疗药物的应用。
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