CN105920620A - 磁性荧光多模态纳米生物探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种磁性荧光多模态纳米生物探针及其制备方法和应用，特异性靶向肝癌细胞，包括二氧化硅将磁性纳米粒子与荧光染料的共包埋功能化修饰氨基，核酸适体与磁性荧光探针共价偶联同时特异性靶向肝癌细胞。所述的磁性纳米粒子为尺寸为十纳米顺磁性氧化铁，所述的荧光染料为异硫氰酸荧光素，所述的包埋剂二氧化硅为四乙基原硅酸盐和3‑氨丙基三乙氧基硅烷水解得到，所述的核酸适体为TLS11a。该探针合成方法简便，材料易得，荧光性能稳定，为肝癌的早期诊断奠定了基础。

Description

磁性荧光多模态纳米生物探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米生物探针领域，具体涉及一种磁性荧光探针用于制备生物传感。
背景技术
肝癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，尽管多数以手术切除为主，同时辅助化疗、热疗等综合治疗，部分改善了肝癌的治疗效果，但是肝癌患者的长期存活率仍然比较低，究其愿意，主要是由于大多数肝癌患者的病情隐匿，潜伏期长，肿瘤生长迅速导致早期诊断困难。因此，早期精确靶向诊断、良好的生物兼容性、低毒副作用成为肝癌乃至癌症诊断的挑战。但是，随着近年来纳米技术和生物医学的结合，纳米材料以其独特的纳米结构和性能以及良好的稳定性，低成本等优势引起了研究者的广泛关注。针对目前临床肝癌诊断中出现的早期诊断困难、靶向效果差、有毒副作用等缺点，巧妙的利用光学成像、核磁共振成像(MRI)和细胞成像构建多模态探针，避开单模式成像的局限性，从而达到肝癌早期靶向诊断目的。
二氧化硅纳米颗粒由于具有大的比表面积、良好的生物相容性，结构可调，分散性良好，细胞毒性小，并且可以进行功能化修饰等特点，已经越来越吸引人们的注意。通过二氧化硅前驱体TEOS和APTES的水解将顺磁性氧化铁和共价结合的荧光染料同时包裹形成分散性良好的磁性荧光核壳结构。其中顺磁性氧化铁(SPIO)既作为MRI造影剂又可作为分离手段，荧光染料通过与氨基化硅源试剂共价结合共包裹于二氧化硅内，并能保持持久的良好荧光性能。此外，磁性荧光多模态纳米粒子表面偶联生物活性分子增加其靶向性，靶向识别肝癌细胞。结合特异性的靶向对比剂核磁共振成像，实现肿瘤早期诊断，同时对肿瘤治疗效果进行有效的原位监测，使评价疾病的指标更完善。磁性荧光多模态探针集磁性、荧光、靶向于一身，靶向识别的同时可以用于核磁共振成像(MRI)，光学成像以及细胞成像利于更直观的观察病灶，对于癌症的临床早期诊断尤其是肝癌，具有重要的意义。
发明内容
技术问题：本发明的目的是提供一种磁性荧光多模态纳米生物探针及其制备方法和应用，采用两种不同硅源试剂同时将顺磁性氧化铁(SPIO)和荧光染料异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)包裹并进行表面修饰，其中顺磁性氧化铁既作为MRI造影剂又可作为分离手段，解决了现有技术中荧光易淬灭或荧光不稳定和传统造影剂滞留时间短的问题。本发明还提供了巧妙的利用光学成像、核磁共振成像和细胞成像，避开单模式成像的局限性，从而达到肝癌早期靶向诊断目的。
技术方案：本发明的一种磁性荧光多模态探针，包括顺磁性的四氧化三铁(Ferroferric oxide，Fe3O4)、异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)、二氧化硅(SiO2)分别由四乙基原硅酸盐(Tetraethylorthosilicate，TEOS)和3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl)triethoxysilane，APTES)的水解得到和核酸适体(TLS11a Aptamer)，其特征在于，所述顺磁性四氧化三铁(Ferroferric oxide，Fe3O4)和荧光素异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)同时被二氧化硅(SiO2)包裹形成尺寸均一的磁性荧光探针，并能特异性识别肝癌细胞，进行光学成像、细胞成像与核磁共振成像。
为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：该探针以顺磁性四氧化三铁核心，二氧化硅为外壳，形成二氧化硅同时包裹顺磁性四氧化三铁和异硫氰酸荧光素FITC的壳核结构，其中荧光素FITC和3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES共价偶联形成FITC-APTES同时被包埋于二氧化硅中，进而得到尺寸均一的磁性荧光探针，再偶联上肝癌靶向识别核酸适体TLS11a得到磁性荧光多模态探针。
所述的生物探针核为顺磁性四氧化三铁，粒径为8-12nm，壳为二氧化硅，壳层厚度40-90nm，壳层厚度调控根据TEOS和APTES的用量。
本发明的磁性荧光多模态纳米生物探针的制备方法是：以顺磁性四氧化三铁为核心，SiO2为外壳同时将顺磁性四氧化三铁和异硫氰酸荧光素包裹，偶联上肝癌靶向识别核酸适体TLS11a得到尺寸均一磁性荧光多模态探针，该探针同时具有异硫氰酸荧光素的荧光性质和顺磁性四氧化三铁的顺磁性性质；
具体步骤为：
步骤一，荧光素与氨基化硅源偶联得到荧光素异硫氰酸荧光素-3-氨丙基三乙氧基硅烷FITC-APTES：向FITC乙醇溶液中加入APTES，室温避光反应充分得到FITC-APTES；
步骤二，制备Fe3O4@SiO2：在超声环境下，向碱性Fe3O4乙醇溶液中逐滴加入TEOS乙醇溶液，超声反应充分得到Fe3O4@SiO2；
步骤三，制备Fe3O4@SiO2(FITC)：Fe3O4@SiO2在超声环境下，逐滴加入FITC-APTES，再加入TEOS，振荡均匀，继续超声反应充分得到Fe3O4@SiO2(FITC)；
步骤四，耦联核酸适体TLS11a制备磁性荧光多模态探针：向含有Fe3O4@SiO2(FITC)的PBS(phosphate buffer saline，磷酸缓冲盐溶液)缓冲液中分别加入EDC和NHS(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride，EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS))进行活化，活化后再加入核酸适体TLS11a，室温反应充分后，离心，PBS洗涤后得到磁性荧光多模态探针。
所述的超声反应温度小于等于40℃，整个反应在避光条件下进行。
本发明的磁性荧光多模态纳米生物探针应用在靶向识别肝癌细胞，并应用于肝癌细胞的光学成像、细胞成像和核磁共振成像。
该磁性荧光探针用于细胞成像的最优浓度为60μg/2×105细胞。
本发明的原理：磁性荧光多模态探针中的顺磁性氧化铁既分离手段，又作为核磁共振成像造影剂，可以有效地改变病变组织中质子的自旋-自旋弛豫时间，从而达到增强对比度的效果。吞噬细胞吞噬超顺磁性氧化铁颗粒后使相应区域信号减低，而肿瘤组织因不含正常的吞噬细胞而保持信号不变。集磁性、荧光、靶向于一身，靶向识别的同时进行光学成像，细胞成像和核磁共振成像，避开单模式成像的局限性，从而达到肝癌细胞早期靶向识别目的。
有益效果：
1.本发明使用磁性荧光多模态探针，一方面该探针合成方法简便，材料易得，尺寸均一，分散性好，荧光性能稳定，与传统造影剂相比，毒副作用小，滞留时间延长更利于多模态成像。
2.使用本发明磁性荧光多模态探针实现多模态，同时对早期肝癌进行可视化诊断，避开单一模式成像的局限性，减少了检测次数，同时对样品的需求量较少，毒副作用小，因此其临床化研究具有广泛的应用前景和重要的意义。
3.本发明设计了尺寸均一、荧光稳定性好的以顺磁性四氧化三铁为核心，SiO2为外壳的核壳结构，以核酸适配体为靶向生物活性分子，特异性表达肝癌细胞，与传统抗体相比，其与受体的亲和力更高，且结构简单，易于修饰，免疫原性低。
附图说明
图1是本发明磁性荧光多模态探针的实施过程示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做更进一步的解释。
一种磁性荧光多模态纳米生物探针及其制备与应用，特异性靶向肝癌细胞，包括二氧化硅将磁性纳米粒子与荧光染料的共包埋功能化修饰氨基，核酸适体与磁性荧光探针共价偶联同时特异性靶向肝癌细胞。所述的磁性纳米粒子为尺寸为十纳米顺磁性氧化铁，所述的荧光染料为异硫氰酸荧光素，所述的包埋剂二氧化硅为四乙基原硅酸盐和3-氨丙基三乙氧基硅烷水解得到。该探针合成方法简便，材料易得，荧光性能稳定，为肝癌的早期诊断奠定了基础。
具体制备步骤为：
步骤一、荧光素与氨基化硅源偶联(FITC-APTES)
A：称取20mg FITC，加入10mL无水乙醇，立即加入500μL APTES于上述溶液中。在室温条件下避光反应24小时，反应结束后4℃避光保存；
步骤二、二氧化硅保护层的制备(Fe3O4@SiO2)
B1：取10mL无水乙醇，加入100μL TEOS，振荡1分钟混合均匀。
B2：取10mL无水乙醇，加入1mL水，再加入1mL氨水，振荡1分钟混合均匀。然后加入600μL 2mg/mL Fe3O4溶液，振荡充分混合均匀。
将B2在超声环境下，逐滴加入B1，(标注为C)，振荡均匀，继续超声反应1小时。
步骤三、磁性荧光探针(Fe3O4@SiO2(FITC))
取500μLA，振荡1分钟混合均匀。C在超声环境下，逐滴加入A，再加入300μLTEOS，振荡均匀，继续超声反应2小时。注意超声温度不高于40℃，整个反应需在避光条件下进行。
所述的磁性荧光探针，所述二氧化硅包埋的磁性采用以下步骤制备得到：
步骤一、取20mg FITC溶于10mL无水乙醇，加入500μL APTES，混匀，置室温避光反应24h；
步骤二、取10mL无水乙醇，加入100μL TEOS，振荡，混匀；
步骤三、取10mL无水乙醇，加入1mL水，再加入1mL氨水，振荡1分钟混合均匀。然后加入600μL 2mg/mL Fe3O4溶液，振荡充分混合均匀；
步骤四、向步骤三得到的溶液中逐滴加入步骤二溶液，混匀，超声反应1h；
步骤五、在超声条件下，向步骤四逐滴加入500μL步骤一溶液，混匀，置室温避光反应1h；
步骤六、在超声条件下，向步骤四逐滴加入300μL TEOS，置室温避光反应1h；
步骤七、分别用乙醇，水，pH 7.4的PBS离心，洗涤分离，去除未反应试剂并于pH 7.4的PBS中4℃条件下保存；
步骤八、向步骤七中分别加入2mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)，活化15min，加入100μL 1μM的核酸适体TLS11a，室温反应3h后，离心，pH 7.4的PBS洗涤三次并于pH 7.4的PBS 4℃保存，备用。
其中，步骤一至八的反应温度均不超过40℃。
实施例1
本发明磁性荧光多模态探针实施过程如图1所示。
本实施例涉及的PBS为pH 7.4，无水乙醇均为优级纯；使用的顺磁性氧化铁购自南京东纳生物科技有限公司；四乙基原硅酸盐(Tetraethylorthosilicate，TEOS)和3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl)triethoxysilane，APTES)购自美国Sigma-Aldrich公司；TLS11a Aptamer序列购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
所述的磁性荧光探针，所述二氧化硅包埋的磁性采用法制备得到：
步骤一、取20mg FITC溶于10mL无水乙醇，加入500μL APTES，混匀，置室温避光反应24h；
步骤二、取10mL无水乙醇，加入100μL TEOS，振荡，混匀；
步骤三、取10mL无水乙醇，加入1mL水，再加入1mL氨水，振荡1分钟混合均匀。然后加入600μL 2mg/mL Fe3O4溶液，振荡充分混合均匀；
步骤四、向步骤三得到的溶液中逐滴加入步骤二溶液，混匀，超声反应1h；
步骤五、在超声条件下，向步骤四逐滴加入500μL步骤一溶液，混匀，置室温避光反应1h；
步骤六、在超声条件下，向步骤四逐滴加入300μL TEOS，反应1h；
步骤七、分别用乙醇，水，pH 7.4的PBS离心，洗涤分离，去除未反应试剂并于pH 7.4的PBS中4℃条件下保存；
步骤八、向步骤七中分别加入2mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)，活化15min，加入100μL 1μM的核酸适体(TLS11aAptamer)，室温反应3h后，离心，pH 7.4的PBS洗涤三次并于pH 7.4的PBS 4℃保存，备用。
其中，步骤一至八的反应温度均不超过40℃。
步骤九、将0.5ml 120μg/ml磁性荧光探针与2×105个HepG2肝癌细胞共孵育三小时，靶向识别肝癌细胞同时用于细胞成像和核磁共振成像。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式，本发明的保护范围并不以上述实施方式为限，但凡本领域普通技术人员根据本发明所揭示内容所作的等效修饰或变化，皆应纳入权利要求书中记载的保护范围内。

Claims (6)

1.一种磁性荧光多模态纳米生物探针，其特征在于，该探针以顺磁性四氧化三铁核心，二氧化硅为外壳，形成二氧化硅同时包裹顺磁性四氧化三铁和异硫氰酸荧光素FITC的壳核结构，其中荧光素FITC和3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES共价偶联形成FITC-APTES同时被包埋于二氧化硅中，进而得到尺寸均一的磁性荧光探针，再偶联上肝癌靶向识别核酸适体TLS11a得到磁性荧光多模态探针。
2.根据权利要求1所述的磁性荧光多模态纳米生物探针，其特征在于，所述的生物探针核为顺磁性四氧化三铁，粒径为8-12nm，壳为二氧化硅，壳层厚度40-90nm，壳层厚度调控根据二氧化硅前驱体TEOS和APTES的用量。
3.一种如权利要求1所述的磁性荧光多模态纳米生物探针的制备方法，其特征在于，以顺磁性四氧化三铁为核心，SiO2为外壳同时将顺磁性四氧化三铁和异硫氰酸荧光素包裹，偶联上肝癌靶向识别核酸适体TLS11a得到尺寸均一磁性荧光多模态探针，该探针同时具有异硫氰酸荧光素的荧光性质和顺磁性四氧化三铁的顺磁性性质；
具体步骤为：
步骤一，荧光素与氨基化硅源偶联得到荧光素异硫氰酸荧光素-3-氨丙基三乙氧基硅烷FITC-APTES：向FITC乙醇溶液中加入APTES，室温避光反应充分得到FITC-APTES；
步骤二，制备Fe3O4@SiO2：在超声环境下，向碱性Fe3O4乙醇溶液中逐滴加入TEOS乙醇溶液，超声反应充分得到Fe3O4@SiO2；
步骤三，制备Fe3O4@SiO2(FITC)：Fe3O4@SiO2在超声环境下，逐滴加入FITC-APTES，再加入TEOS，振荡均匀，继续超声反应充分得到Fe3O4@SiO2(FITC)；
步骤四，耦联核酸适体TLS11a制备磁性荧光多模态探针：向含有Fe3O4@SiO2(FITC)的磷酸缓冲盐溶液PBS中分别加入EDC和NHS进行活化，活化后再加入核酸适体TLS11a，室温反应充分后，离心，PBS洗涤后得到磁性荧光多模态探针。
4.根据权利要求3所述的磁性荧光多模态纳米生物探针的制备方法，其特征在于，所述的超声反应温度小于等于40℃，整个反应在避光条件下进行。
5.一种如权利要求1所述的磁性荧光多模态纳米生物探针的应用，其特征在于该探针应用在靶向识别肝癌细胞，并应用于肝癌细胞的光学成像、细胞成像和核磁共振成像。
6.根据权利要求5所述的磁性荧光多模态纳米生物探针的应用，其特征在于该磁性荧光探针用于细胞成像的最优浓度为60μg/2×105细胞。
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