CN111899955B - 磁性探针材料、磁性探针及其制备方法和应用以及分子标记物 - Google Patents

磁性探针材料、磁性探针及其制备方法和应用以及分子标记物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种磁性探针材料、磁性探针及其制备方法和应用以及分子标记物，涉及生物材料技术领域，磁性探针材料包括顺次连接的磁性材料、氨基、羰基、PEG以及N‑羟基硫代琥珀酰。利用含有该磁性探针材料的产品诊断心脏疾病的效率高、速度快或者准确度高。

Description

磁性探针材料、磁性探针及其制备方法和应用以及分子标 记物
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，尤其是涉及一种磁性探针材料、磁性探针及其制备方法和应用以及分子标记物，更具体地，涉及一种磁性探针材料、磁性探针及其制备方法和应用、试剂或者试剂盒以及分子标记物。
背景技术
目前，心血管疾病，例如心肌梗死，是导致人类死亡的第一杀手，如何有效诊断和预防心肌损伤、心肌梗死是目前医学和生物学研究亟待解决的问题。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一类广泛存在于真核生物、长度为21-25nt的非蛋白质编码小RNA，它们能以序列特异性方式调节基因表达，在发育、凋亡、代谢以及人类疾病方面都起着不容忽视的作用。近年来的研究表明，心血管疾病会导致体内特殊的微小RNA的表达量发生明显的变化，因此，通过检测体液中的特定微小RNA的变化即可起到诊断、预防心血管疾病的作用。目前比较常用的用来统计微小RNA变化的手段是借助于实时定量PCR的技术。虽然实时定量PCR技术拥有许多的优点，例如可分析少量的样本、自动化程度高、避免污染等，但是也存在了诸如易受样本中干扰剂的影响、RNA提取过程中会有一定量的人为损失、检测时间长等缺点。因此，开发一种快速、高效、准确的检测技术尤为重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磁性探针材料，利用含有该磁性探针材料的产品诊断心脏疾病的效率高、速度快或者准确度高。
本发明提供的磁性探针材料，包括：顺次连接的磁性材料、氨基、羰基、PEG以及N-羟基硫代琥珀酰；
所述磁性材料的形状包括球形颗粒状和棒状颗粒状，所述球形颗粒状磁性材料的粒径在60nm左右，棒状颗粒状磁性材料的粒径为长50nm±1nm，宽度7nm±1nm。
进一步地，还包括硅基材料，所述硅基材料包覆所述磁性材料，且所述硅基材料与氨基、羰基、PEG以及N-羟基硫代琥珀酰顺次连接；
优选地，所述硅基材料包括二氧化硅；
优选地，所述磁性材料包括含有铁；
优选地，所述磁性材料包括四氧化三铁；
优选地，基于所述磁性探针材料的总质量，所述磁性材料的含量为67.7wt％。
一种前面所述的磁性探针材料的制备方法，包括以下步骤：
对磁性材料依次进行氨基化处理和羰基化处理，得到羰基化磁性材料；
在所述羰基化磁性材料中依次引入PEG和N-羟基硫代琥珀酰，得到所述磁性探针材料；
优选地，所述磁性材料经过预处理，所述预处理包括在所述磁性材料的表面包覆硅基材料。
进一步地，所述氨基化包括：将磁性材料与3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液进行第一反应；
优选地，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液的体积浓度为4-6％；
优选地，所述第一反应的时间为反应1-3小时；
优选地，将所述第一反应得到的产物进行干燥处理，所述干燥的温度为100-120℃；
优选地，所述干燥的时间为10-14小时；
优选地，用乙醇清洗所述第一反应得到的产物之后再进行所述干燥处理；
优选地，所述羰基化包括：将氨基化的磁性材料与戊二醛溶液进行第二反应；
优选地，所述戊二醛溶液的体积浓度为3-5％；
优选地，所述第二反应的时间为1-3小时；
优选地，所述戊二醛溶液中含有浓度为450-550mM的氰基硼氢化钠；
优选地，离心所述第二反应的产物；
优选地，用PBS洗涤离心后的第二反应的产物。
进一步地，引入PEG包括：将羰基化的磁性材料与羧基-PEG-胺溶液进行第三反应；
优选地，所述羧基-PEG-胺溶液中含有450-550mM的氰基硼氢化钠；
优选地，所述第三反应的时间为10-14小时；
优选地，离心所述第三反应的产物；
优选地，依次用PBS和纯水洗涤离心后的第三反应的产物；
优选地，引入N-羟基硫代琥珀酰包括：将引入PEG的磁性材料与N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液进行第四反应；
优选地，N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液的浓度为8-12mM；
优选地，N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液中含有浓度为4-6mM的N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；
优选地，所述第四反应的时间为10-14小时；
优选地，离心所述第四反应的产物；
优选地，用含有无核酸酶的溶液洗涤所述离心后的第四反应的产物；
优选地，依次用水、乙醇、1×PBS缓冲液以及无核酸酶的水对所述第四反应的产物进行洗涤，得到所述磁性探针材料。
一种磁性探针，包括前面所述的磁性探针材料；
优选地，所述磁性探针还包括修饰于所述磁性探针材料表面的适配子；
优选地，适配子的序列包括如下(a)-(d)中的至少一种：
(a)HPN CP-124-3-dabcyl：5’-CTAATCGTGATAGGGGTATTGGCATTCACCGCGTGCCTTATACCCCTATCACGATTAGCATTAA-3’(SEQ ID NO.1)；
(b)HPN CP-124-5-dabcyl：5’-CTAATCGTGATAGGGGTAATCAAGGTCCGCTGTGAACACGTACCCCTATCACGATTAGCATTAA-3’(SEQ ID NO.2)；
(c)HPN CP-23a-3-dabcyl：5’-CTAATCGTGATAGGGGTAAAATCCCATCCCCAGGAACCCCTACCCCTATCACGATTAGCATTAA-3’(SEQ ID NO.3)；
(d)HPN CP-23a-5-dabcyl：5’-CTAATCGTGATAGGGGTACAACTCAGCTTGTCAAATACACGTACCCCTATCACGATTAGCATTAA-3’(SEQ ID NO.4)；
其中，所述适配子的序列5'端依次带有淬灭基团和Amino C6核酸标记，3'端带有荧光基团；
优选地，所述淬灭基团为Dabcyl；
优选地，所述荧光基团包括FAM或Cy5；
优选地，所述Amino C6核酸标记的序列为：5’-CCC ACC AAC CAT-3’(SEQ IDNO.5)。
一种前面所述的磁性探针的制备方法，包括：将氨基化的磁性探针材料与适配子混合反应，得到磁性探针；
优选地，所述混合反应的时间为12-14小时；
优选地，磁性探针材料的氨基化包括：将磁性探针材料与含有EDC和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的交联溶液中进行交联反应，得到氨基化的磁性探针材料；
优选地，交联反应的时间为5-7小时；
优选地，EDC的浓度为4-6mM；
优选地，N-羟基硫代琥珀酰亚胺的浓度为8-12mM；
优选地，所述交联溶液的溶剂包括MES；
优选地，所述交联溶液的pH为4-6，优选为4.5。
一种前面所述的磁性探针材料或者前面所述的磁性探针在制备用于诊断和/或愈后评估心脏疾病的产品中的应用；
优选地，所述心脏疾病包括心肌梗死；
优选地，所述产品为试剂或试剂盒；
优选地，所述产品的检测样本包括血清、血浆或尿液。
一种试剂或者试剂盒，包括前面所述的磁性探针材料或者前面所述的磁性探针。
一种分子标记物，所述分子标记物被前面所述的磁性探针检测；
优选地，所述分子标记物包括Hsa-miR-19a-3、Hsa-miR-145-5、Has-miR-197-5、Hsa-miR-124-5p、Hsa-miR-124-3p、Hsa-miR-223-5p、Hsa-miR-23a-5p以及Hsa-miR-23a-3p中的至少一种。
与现有技术相比，本发明至少可以取得以下有益效果：
本发明提供的磁性探针材料是一种生物分子，利用该磁性探针材料制备得到的磁性探针发光稳定、毒性小，将该磁性探针材料与根据待检测的微小RNA序列特异性设计的荧光标记过的核酸适配子结合之后，可以检测(甚至可以原位检测)与心脏疾病(例如心肌梗死)相关的微小RNA，能够对心肌梗死的快速诊断以及愈后评估的作用，磁性探针和与心脏疾病相关的微小RNA接触后会发生显著的光学性质的变化，诊断心脏疾病的效率和准确度比较高。
本发明的磁性探针采用生物分子作为原料，避免了反应会造成的污染或产物的毒性，并且具有生物相容性好、毒性小、检测简便快捷，即直接将磁性探针与待检测的体液样品混合，数分钟之内即可得到所需要的数据结果的优点。同时，利用本发明的磁性探针检测微小RNA还具有成本低、操作方便、对RNA的损伤小和受外界条件约束少等优点。磁性探针由于其具有磁性的特点，利用96孔磁性板可以在30秒的时间内进行快速的分离、提出以及检测，可以省去离心等费时费力的操作，整个操作过程可以在检测仪器中直接完成，省时、省力、节约空间以及可以更快的得到检测结果，为病人疾病的诊治争取更多的宝贵时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2提供的磁性探针材料包覆硅基材料后的对照图，其中，图1中a为未包覆硅基材料的球形磁性材料，尺寸为长50nm±5nm；图1中b为经二氧化硅包裹后的球形磁性材料，尺寸为长55nm±5nm，宽度7nm±1nm；图1中c为未包覆硅基材料的棒状磁性材料，尺寸为长80nm±1nm，宽度4nm±1nm；图1中d为经二氧化硅包裹后的棒状磁性材料，尺寸为长84nm±1nm，宽度7nm±1nm；
图2为本发明实施例3提供的磁性探针的红外光谱图，其中，图2中a为球形磁性材料表面带有羟基和带有聚乙二醇红外光谱图；图2中b为棒状磁性材料表面带有羟基和带有聚乙二醇红外光谱图；
图3为本发明实施例3提供的磁性探针的磁滞(M-H)研究图，其中，图3中a为球形磁性材料的磁滞曲线；图3中b为棒状磁性材料的磁滞曲线；
图4为本发明试验例1提供的对特定非编码核酸检测提供的标准检测曲线图，其中：图4中a为定量PCR的检测miR-124-3P的标准曲线；图4中b为定量PCR的检测miR-124-5P的标准曲线；图4中c为探针材料检测miR-124-3P的标准曲线；图4中d为探针材料检测miR-124-3P的标准曲线；
图5为本发明试验例1提供的探针材料对不同的小RNA检测对比结果图，其中：图5中a为miR-124-3P探针的对比结果，图5中b为miR-124-5P探针的对比结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的一个方面，本发明提供了两种磁性探针材料，该磁性探针材料包括：顺次连接的磁性材料、氨基、羰基、PEG以及N-羟基硫代琥珀酰；所述磁性材料的形状包括球形颗粒状和棒状颗粒状，所述球形颗粒状磁性材料的粒径在60nm左右，棒状颗粒状磁性材料的粒径为长50nm±1nm，宽度7nm±1nm。
本发明提供的磁性探针材料是一种生物分子，利用该磁性探针材料制备得到的磁性探针发光稳定、毒性小，将该磁性探针材料与根据待检测的微小RNA序列特异性设计的荧光标记过的核酸适配子结合之后，可以检测甚至可以原位检测与心脏疾病(例如心肌梗死)相关的微小RNA，能够对心肌梗死的快速诊断以及愈后评估的作用，磁性探针和与心脏疾病相关的微小RNA接触后会发生显著的光学性质的变化，诊断心脏疾病的效率和准确度比较高。
需要说明的是，顺次连接的磁性材料、氨基、羰基、PEG(聚乙二醇)以及N-羟基硫代琥珀酰可以理解为，磁性材料与氨基相连，氨基与羰基相连，羰基与PEG相连，PEG与N-羟基硫代琥珀酰相连；其中，磁性材料与氨基相连的方式可以做广义的理解，例如磁性材料可以与氨基直接相连，也可以通过其他可能的分子或者原子与氨基相连；氨基与羰基相连的方式可以做广义的理解，例如氨基可以与羰基直接相连，也可以通过其他可能的分子或者原子与羰基相连；羰基与PEG相连的方式可以做广义的理解，例如羰基可以与PEG直接相连，也可以通过其他可能的分子或者原子与PEG相连；PEG与N-羟基硫代琥珀酰相连的方式可以做广义的理解，例如PEG可以与N-羟基硫代琥珀酰直接相连，也可以通过其他可能的分子或者原子与N-羟基硫代琥珀酰相连。
所述磁性材料的形状包括球形颗粒状和棒状颗粒状，所述球形颗粒状磁性材料的粒径在60nm左右，棒状颗粒状磁性材料的粒径为长50nm±1nm，宽度7nm±1nm。相对于上述粒径范围，当磁性材料的粒径过大或者过小会造成单位面积内修饰的探针核酸适配体的量减少，从而影响检测效率。
在本发明的一些实施方式中，磁性探针材料还包括硅基材料，所述硅基材料包覆所述磁性材料，且所述硅基材料与氨基、羰基、PEG以及N-羟基硫代琥珀酰顺次连接。由此，氨基与硅基材料更容易结合在一起，获得的磁性探针材料的稳定性更高。
需要说明的是，当在用硅基材料包覆磁性材料后，磁性材料通过硅基材料与氨基相连接。
在本发明的一些实施方式中，所述硅基材料包括二氧化硅。
在本发明的一些实施方式中，所述磁性材料包括含有铁；优选地，所述磁性材料包括四氧化三铁。由此，磁性材料的磁性较佳。
在本发明的一些实施方式中，基于所述磁性探针材料的总质量，所述磁性材料的含量为67.7wt％。相对于上述含量，当磁性材料的含量过低时，则包覆硅基材料之后磁性筛选的速率会降低；当磁性材料的含量过高时，则包覆硅基材料之后得到的材料容易团聚。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种前面所述的磁性探针材料的制备方法，包括以下步骤：对磁性材料依次进行氨基化处理和羰基化处理，得到羰基化磁性材料；在所述羰基化磁性材料中依次引入PEG和N-羟基硫代琥珀酰，得到所述磁性探针材料。
在本发明的一些实施方式中，磁性材料是通过以下方法制备得到的：
步骤(a)：将氯化铁、乙酸钠、十二烷基苯磺酸钠按照摩尔比40：226：1的比例加入到80毫升的乙二醇溶液中超声处理30分钟，得到原料混合物；
步骤(b)：超声处理30分钟后加入1.5克的聚乙二醇，搅拌混匀1小时；
步骤(c)：混合液在200度的温度下反应10小时得到磁性材料。
在本发明的一些实施方式中，所述磁性材料经过预处理，所述预处理包括在所述磁性材料的表面包覆硅基材料。
在本发明的一些具体实施方式中，在所述磁性材料的表面包覆硅基材料包括：
将100毫克磁性材料加入到195毫升的80％的乙醇溶液中，超声处理50分钟后加入2毫升的氨水溶液搅拌30分钟；往上述混合液中逐滴加入2毫升的正硅酸四乙酯，继续搅拌6小时得到硅基材料包裹的磁性材料。在本发明的一些实施方式中，将包覆硅基材料的磁性材料进行透析，再将得到的产物用双蒸水、乙醇以及PBS等清洗并利用真空干燥。
在本发明的一些实施方式中，所述氨基化包括：将磁性材料(需要说明的是，此处磁性材料的形式包括磁性材料或者硅基材料包覆的磁性材料)与3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液进行第一反应，所述第一反应的时间为反应1-3小时(例如可以为1小时、2小时或者3小时等)。由此，氨基化效果较佳。
在本发明的一些实施方式中，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液的体积浓度为4-6％(例如可以为4％、5％或者6％等)，APTES溶液的溶剂为乙醇。
在本发明的一些实施方式中，将所述第一反应得到的产物进行干燥处理，所述干燥的温度为100-120℃(例如可以为100℃、110℃或者120℃等)。100-120℃烘干的过程中，APTES中的羟基进一步反应生成醚键，温度过低时不利于这一反应的进行，温度过高则容易引起碳化。
在本发明的一些实施方式中，所述干燥的时间为10-14小时(例如可以为10小时、11小时、12小时、13小时或者14小时等)。由此，干燥效果较佳。
在本发明的一些实施方式中，用乙醇清洗所述第一反应得到的产物之后再进行所述干燥处理(例如真空干燥等)。由此，可以达到纯化氨基化的磁性材料的目的。
在本发明的一些实施方式中，所述羰基化包括：将氨基化的磁性材料(需要说明的是，此处磁性材料的形式包括磁性材料或者硅基材料包覆的磁性材料)与戊二醛溶液进行第二反应，所述第二反应的时间为1-3小时(例如可以为1小时、2小时或者3小时等)。
在本发明的一些实施方式中，所述戊二醛溶液的体积浓度为3-5％(例如可以为3％、4％或者5％等)，戊二醛溶液的溶剂为1×PBS(浓度为0.1M的磷酸缓冲盐溶液)；所述戊二醛溶液中含有浓度为450-550mM(例如可以为450mM、500mM或者550mM等)的氰基硼氢化钠。由此，氰基硼氢化钠是一种温和的还原剂，主要是将醛基与氨基化的磁性材料还原生成C-N。
在本发明的一些实施方式中，离心所述第二反应的产物；优选地，用PBS洗涤所述离心后的第二反应的产物。由此，可以达到纯化羰基化的磁性材料的目的。
在本发明的一些实施方式中，引入PEG包括：将羰基化的磁性材料(需要说明的是，此处磁性材料的形式包括磁性材料或者硅基材料包覆的磁性材料)与羧基-PEG-胺溶液(可以与氨基聚乙二醇羧基溶液互换使用)进行第三反应，所述第三反应的时间为10-14小时(例如可以为10小时、11小时、12小时、13小时或者14小时等)。
在本发明的一些实施方式中，所述羧基-PEG-胺溶液的溶剂为1×PBS，羧基-PEG-胺溶液中含有450-550mM(例如可以为450mM、500mM或者550mM等)的氰基硼氢化钠。由此，氰基硼氢化钠是一种温和的还原剂，主要是将醛基与羰基化的磁性材料还原生成C-N。
在本发明的一些实施方式中，离心所述第三反应的产物；依次用PBS和纯水洗涤所述离心后的第三反应的产物。由此，可以纯化引入PEG后的磁性材料。
在本发明的一些实施方式中，引入N-羟基硫代琥珀酰包括：将引入PEG的磁性材料(需要说明的是，此处磁性材料的形式包括磁性材料或者硅基材料包覆的磁性材料)与N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液进行第四反应，所述第四反应的时间为10-14小时(例如可以为10小时、11小时、12小时、13小时或者14小时等)。
在本发明的一些实施方式中，N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液的浓度为8-12mM(例如可以为8mM、9mM、10mM、11mM或者12mM等)，N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液的溶剂为MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)溶液；N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液中含有浓度为4-6mM(例如可以为4mM、5mM或者6mM等)的N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。由此，羧基氨基的酰胺化反应，EDC和NHS主要是用于活化羧基，便于下一步与氨基修饰的适配子反应。
在本发明的一些实施方式中，离心所述第四反应的产物；用含有无核酸酶的溶液洗涤所述离心后的第四反应的产物。由此，可以纯化N-羟基硫代琥珀酰亚胺后的磁性材料。
在本发明的一些实施方式中，依次用水、乙醇、1×PBS缓冲液以及无核酸酶的水对所述第四反应的产物进行洗涤，得到所述磁性探针材料。
可以理解的是，在水、乙醇、1×PBS缓冲液以及无核酸酶的水对所述第四反应的产物进行洗涤时，上一种洗涤方式洗涤完之后可以先采用真空干燥，再将干燥后的产物进行下一中方式洗涤。
在本发明的一些具体实施方式中，磁性探针材料时通过以下方法制备得到的：
(1)将磁性材料或者硅基材料包覆的磁性材料浸入5％(v/v)APTES(溶剂为乙醇)溶液在室温下缓慢摇动2小时，随后用乙醇洗涤，并在110℃烘干12小时，得到氨基化的磁性材料；
(2)氨基化的磁性材料浸入4％的戊二醛溶液(溶剂为1x的PBS溶液，溶液中含有50mM的氰基硼氢化钠)中室温摇动反应2小时，离心并用PBS洗涤，得到羰基化的磁性材料；
(3)将羰基化的磁性材料浸入500mM羧基-PEG-胺溶液(溶剂为1xPBS溶液中，溶液中含有50mM氰基硼氢化钠)室温过夜，温和晃动，离心并用PBS洗涤，超纯水洗涤并干燥，得到引入PEG的磁性材料；
(4)将引入PEG的磁性材料浸入10mM N-羟基硫代琥珀酰亚胺(溶剂为MES溶液中，溶液中含有5mM N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)室温过夜，温和晃动，离心并用无核酸酶的水洗涤，得到磁性探针材料。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种磁性探针，该磁性探针包括前面所述的磁性探针材料，优选地，该磁性探针还包括修饰于所述磁性探针材料表面的适配子。
在本发明的一些实施方式中，所述适配子的序列包括如下(a)-(d)中的至少一种：
(a)HPN CP-124-3-dabcyl：
5’-CTAATCGTGATAGGGGTATTGGCATTCACCGCGTGCCTTATACCCCTATCACGATTAGCATTAA-3’(SEQ ID NO.1)；
(b)HPN CP-124-5-dabcyl：
5’-CTAATCGTGATAGGGGTAATCAAGGTCCGCTGTGAACACGTACCCCTATCACGATTAGCATTAA-3’(SEQ ID NO.2)；
(c)HPN CP-23a-3-dabcyl：
5’-CTAATCGTGATAGGGGTAAAATCCCATCCCCAGGAACCCCTACCCCTATCACGATTAGCATTAA-3’(SEQ ID NO.3)；
(d)HPN CP-23a-5-dabcyl：5’-
CTAATCGTGATAGGGGTACAACTCAGCTTGTCAAATACACGTACCCCTATCACGATTAGCATTAA-3’(SEQ ID NO.4)；
其中，适配子的序列5'端依次带有淬灭基团和Amino C6核酸标记，3'端带有荧光基团。
需要说明的是，如果适配子是混合物的话，不同序列的荧光基团两两互不相同。
在本发明的一些实施方式中，淬灭基团为Dabcyl，荧光基团包括FAM或Cy5，AminoC6核酸标记的序列为：5’-CCC ACC AAC CAT-3’(SEQ ID NO.5)。
在本发明的一些具体实施方式中，适配子的序列包括如下(a)-(d)中的至少一种：
(a)HPN CP-124-3-dabcyl：Amino
C6-CCCACCAACCAT-Dabcyl--CTAATCGTGATAGGGGTATTGGCATTCACCGCGTGCCTTATACCCCTATCACGATTAGCATTAA-FAM；
(b)HPN CP-124-5-dabcyl：Amino
C6-CCCACCAACCAT-Dabcyl-CTAATCGTGATAGGGGTAATCAAGGTCCGCTGTGAACACGTACCCCTATCACGATTAGCATTAA-FAM；
(c)HPN CP-23a-3-dabcyl：Amino
C6-CCCACCAACCAT-Dabcyl-CTAATCGTGATAGGGGTAAAATCCCATCCCCAGGAACCCCTACCCCTATCACGATTAGCATTAA-Cy5；
(d)HPN CP-23a-5-dabcyl：Amino C6-CCCACCAACCAT-Dabcyl-CTAATCGTGATAGGGGTACAACTCAGCTTGTCAAATACACGTACCCCTATCACGATTAGCATTAA-Cy5。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种前面所述的磁性探针的制备方法，包括：将氨基化的磁性探针材料与适配子混合反应，得到磁性探针。由此，在磁性探针材料上连接上能够与待检测的微小RNA相结合的互补碱基修饰到磁性探针材料上，从而保证了检测的专一性。
在本发明的一些实施方式中，所述混合反应的时间为12-14小时(例如可以为12小时、13小时或者14小时等。
在本发明的一些实施方式中，磁性探针材料的氨基化包括：将磁性探针材料与含有EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的交联溶液中进行交联反应，得到氨基化的磁性探针材料。由此，磁性探针材料更易于与适配子结合。
在本发明的一些实施方式中，交联反应的时间为5-7小时(例如可以为5小时、6小时或者7小时等)。由此，交联效果较佳。
在本发明的一些实施方式中，EDC的浓度为4-6mM(例如可以为4mM、5mM或者6mM等)，N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)的浓度为8-12mM(例如可以为8mM、10mM或者12mM等)，所述交联溶液的溶剂包括MES。
在本发明的一些实施方式中，所述交联溶液的pH为4-6，(例如可以为4、4.5、5、5.5或者6等)，优选为4.5。
本发明提供的磁性探针通过检测与心脏疾病相关的微小RNA能够对心肌梗死的快速诊断以及愈后评估的作用，发光稳定、毒性小、可以原位检测、与特定的微小RNA接触后会发生显著的光学性质的变化。采用生物分子作为原料，避免了反应会造成的污染或产物的毒性，并且具有生物相容性好、毒性小、检测简便快捷，即直接将磁性探针与待检测的体液样品混合，数分钟之内即可得到所需要的数据结果的优点。同时，磁性探针检测微小RNA还具有成本低、操作方便、对RNA的损伤小和受外界条件约束少等优点。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种前面所述的磁性探针材料或者前面所述的磁性探针在制备用于诊断和/或愈后评估心脏疾病的产品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述心脏疾病包括心肌梗死。
在本发明的一些实施方式中，所述产品为试剂或试剂盒；所述产品的检测样本包括血清、血浆或尿液。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种试剂或者试剂盒，包括前面所述的磁性探针材料或者前面所述的磁性探针。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种分子标记物，所述分子标记物被前面所述的磁性探针检测。利用该分子标记物作为新的生物靶标能够对心脏疾病起到早期诊断和/或愈后评估的作用，甚至可以在体外诊断心肌梗死，判断心肌梗死的病发过程。
在本发明的一些实施方式中，所述分子标记物包括Hsa-miR-19a-3、Hsa-miR-145-5、Has-miR-197-5、Hsa-miR-124-5p、Hsa-miR-124-3p、Hsa-miR-223-5p、Hsa-miR-23a-5p以及Hsa-miR-23a-3p中的至少一种。
在本发明的一些具体实施方式中，所述分子标记物包括以下至少一种：
Hsa-miR-19a-3：5’-UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA-3’(SEQ ID No.6)；
Hsa-miR-145-5：5’-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3’(SEQ ID No.7)；
Has-miR-197-5：5’-CGGGUAGAGAGGGCAGUGGGAGG-3’(SEQ ID No.8)；
Hsa-miR-124-5p：5’-CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU-3’(SEQ ID No.9)；
Hsa-miR-124-3p：5’-UAAGGCACGCGGUGAAUGCCAA-3’(SEQ ID No.10)；
Hsa-miR-223-5p：5’-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUUG-3’(SEQ ID No.11)；
Hsa-miR-23a-5p：5’-GGGGUUCCUGGGGAUGGGAUUU-3’(SEQ ID No.12)；
以及，Hsa-miR-23a-3p：5’-AUCACAUUGCCAGGGAUUUUCC-3’(SEQ ID No.13)。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
需要说明的是，以下实施例和对比例中的磁性材料为四氧化三铁时，磁性材料的制备方法如下：
(1)将氯化铁、乙酸钠、十二烷基苯磺酸钠按照摩尔比40:226:1的比例加入到80毫升的乙二醇溶液中超声处理30分钟；
(2)往上述超声处理好的混合溶液中加入1.5克的聚乙二醇，搅拌混匀1小时；
(3)将步骤(2)得到的混合液在200度的温度下反应10小时得到磁性材料。
以下实施例和对比例中的磁性材料为四氧化三铁时，在其表面包覆由二氧化硅形成的硅基材料的制备方法如下：
将100毫克磁性材料加入到195毫升的80％的乙醇溶液中，超声处理50分钟后加入2毫升的氨水溶液搅拌30分钟；往上述混合液中逐滴加入2毫升的正硅酸四乙酯，继续搅拌6小时得到硅基材料包裹的磁性材料。
实施例1
磁性探针材料的制备方法包括以下步骤：
(1)将磁性材料(四氧化三铁)浸入5％(v/v)APTES(溶剂为乙醇)溶液在室温下缓慢摇动(摇动速度为200rpm)2小时，随后用乙醇洗涤，并在110℃烘干12小时，得到氨基化的磁性材料；
(2)氨基化的磁性材料浸入4％的戊二醛溶液(溶剂为1x的PBS溶液，溶液中含有50mM的氰基硼氢化钠)中室温摇动反应2小时，离心并用PBS洗涤，得到羰基化的磁性材料；
(3)将羰基化的磁性材料浸入500mM羧基-PEG-胺溶液(溶剂为1xPBS溶液中，溶液中含有50mM氰基硼氢化钠)室温过夜，温和晃动(晃动速度为200rpm)，离心并用PBS洗涤，超纯水洗涤并干燥，得到引入PEG的磁性材料；
(4)将引入PEG的磁性材料浸入10mM N-羟基硫代琥珀酰亚胺(溶解于MES溶液中，含有5mM N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)室温14小时，温和晃动(晃动速度为200rpm)，离心并用无核酸酶的水洗涤，得到磁性探针材料，其中，磁性探针材料中磁性材料的质量分数为1mg/mL。
实施例2
磁性探针材料的制备方法包括以下步骤：
(1)将硅基材料(二氧化硅)包覆的磁性材料(四氧化三铁)浸入5％(v/v)APTES(溶剂为乙醇)溶液在室温下缓慢摇动(摇动速度为200rpm)2小时，随后用乙醇洗涤，并在110℃烘干12小时，得到氨基化的磁性材料；
(2)氨基化的磁性材料浸入4％的戊二醛溶液(溶剂为1x的PBS溶液，溶液中含有50mM的氰基硼氢化钠)中室温摇动反应2小时，离心并用PBS洗涤，得到羰基化的磁性材料；
(3)将羰基化的磁性材料浸入500mM羧基-PEG-胺溶液(溶剂为1xPBS溶液中，溶液中含有50mM氰基硼氢化钠)室温过夜，温和晃动(晃动速度为200rpm)，离心并用PBS洗涤，超纯水洗涤并干燥，得到引入PEG的磁性材料；
(4)将引入PEG的磁性材料浸入10mM N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液(溶剂为MES溶液中，溶液小红含有5mM N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)室温14小时，温和晃动(晃动速度为200rpm)，离心并用无核酸酶的水洗涤，得到磁性探针材料其中，磁性探针材料中磁性材料的质量分数为1mg/mL。
图1为磁性探针材料包覆硅基材料后的对照图；
其中，图1中a为未包覆硅基材料的球形磁性材料，尺寸为长50nm±5nm；图1中b为经二氧化硅包裹后的球形磁性材料，尺寸为长55nm±5nm，宽度7nm±1nm；图1中c为未包覆硅基材料的棒状磁性材料，尺寸为长80nm±1nm，宽度4nm±1nm；图1中d为经二氧化硅包裹后的棒状磁性材料，尺寸为长84nm±1nm，宽度7nm±1nm。
实施例3
磁性探针材料的制备方法同实施例2，不同之处在于步骤(4)中N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液的浓度为8mM。
图2为本实施例制得的磁性探针的红外光谱图，其中图2中a为球形磁性材料表面带有羟基和带有聚乙二醇红外光谱图，图2中b为棒状磁性材料表面带有羟基和带有聚乙二醇红外光谱图。
图3为本实施例制得的磁性探针的磁滞(M-H)研究图，其中图3中a为球形磁性材料的磁滞曲线，图3中b为棒状磁性材料的磁滞曲线。
实施例4
磁性探针材料的制备方法同实施例2，不同之处在于步骤(4)中N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液的浓度为12mM。
实施例5
磁性探针材料的制备方法同实施例2，不同之处在于步骤(4)中N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液的浓度为5mM。
实施例6
磁性探针材料的制备方法同实施例2，不同之处在于步骤(4)中N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液的浓度为15mM。
对比例1
磁性探针材料的制备方法同实施例2，不同之处在于只含有步骤(1)。
对比例2
磁性探针材料的制备方法同实施例2，不同之处在于只含有步骤(1)和(2)。
对比例3
磁性探针材料的制备方法同实施例2，不同之处在于不含有步骤(4)。
将实施例1-6以及对比例1-3中的磁性探针材料制备成对应的磁性探针，制备方法如下：
(1)PEG的氨基化：分别将实施例1-6以及对比例1-3中的磁性探针材料浸入到含有5mM EDC，10mM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)的MES溶液中(pH＝5)室温摇动反应6小时；
(2)修饰发卡适配子CPs：分别将CPs与步骤(1)得到的产物混合，室温反应14h；
其中，适配子的序列为：
HPN CP-124-5-dabcyl：
CCCACCAACCAT-Dabcyl-CTAATCGTGATAGGGGTAATCAAGGTCCGCTGTGAACACGTACCCCTATCACGATTAGCATTAA-FAM；
或：
HPN CP-124-3-dabcyl：
CCCACCAACCAT-Dabcyl-CTAATCGTGATAGGGGTATTGGCATTCACCGCGTGCCTTATACCCCTATCACGATTAGCATTAA-FAM
试验例1
磁性探针材料对微小RNA的检测
1.对不同的微小RNA的检测
由生物公司合成一系列的微小RNA以及与待测的微小RNA有一个错配、两个错配以及三个错配的微小RNA片段(其中，对微小RNA Hsa-miR-124-5p：CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU和微小RNA Hsa-miR-124-3p：UAAGGCACGCGGUGAAUGCCAA进行错配处理)。
错配后序列如下：
Hsa-miR-124-5p-错配1：CGUGUCCACAGCGGACCUUGAU
Hsa-miR-124-5p-错配2：CGUGUCAACAGCGGACCUUGAU
Hsa-miR-124-5p-错配3：CGUGUCAGCAGCGGACCUUGAU
Hsa-miR-124-3p-错配1：UAAGGCAUGCGGUGAAUGCCAA
Hsa-miR-124-3p-错配2：UAAGGCAUACGGUGAAUGCCAA
Hsa-miR-124-3p-错配3：UAAGGCAUAGGGUGAAUGCCAA
其中，待检测微小RNA的序列为以下至少一种：
Hsa-miR-19a-3：UGU GCA AAU CUA UGC AAA ACU GA
Hsa-miR-145-5：GUC CAG UUU UCC CAG GAA UCC CU
Has-miR-197-5：CGG GUA GAG AGG GCA GUG GGA GG
Hsa-miR-124-5p：CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU
Hsa-miR-124-3p：UAAGGCACGCGGUGAAUGCCAA
Hsa-miR-223-3p：UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA
Hsa-miR-223-5p：CGU GUA UUU GAC AAG CUG AGU UG
Hsa-miR-23a-5p：GGGGUUCCUGGGGAUGGGAUUU
Hsa-miR-23a-3p：AUCACAUUGCCAGGGAUUUUCC
适配子为：
HPN CP-124-5-dabcylCCCACCAACCAT-Dabcyl-CTAATCGTGATAGGGGTA atcaaggtccgctgtgaacacgTACCCCTATCACGATTAGCATTAA-FAM
HPN CP-124-3-dabcyl CCCACCAACCAT-Dabcyl-CTAATCGTGATAGGGGTA ttggcattcaccgcgtgccttaTACCCCTATCACGATTAGCATTAA-FAM
将微小RNA Hsa-miR-124-5p：CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU和微小RNA Hsa-miR-124-3p：UAAGGCACGCGGUGAAUGCCAA分别配置成1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、20pM、50pM、100pM、200pM、500pM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM和50nM的浓度备用，其中，干扰物的浓度为10nM。
所述干扰物为上述错配的序列以及其他非待检测小RNA。
2.对微小RNA Hsa-miR-124-5p：CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU和微小RNA Hsa-miR-124-3p：UAAGGCACGCGGUGAAUGCCAA不同浓度的检测。
将本发明实施例1-6以及对比例1-3对应的磁性探针分别与不同浓度不同种类的微小RNA混合孵育10分钟后利用全功能微孔板检测仪进行检测，确定不同的微小RNA对磁性探针的响应情况，确定磁性探针对待检测微小RNA的检测效果，根据响应情况拟合出检测的线性曲线以及方程式。
图4为本试验例对特定非编码核酸检测提供的标准检测曲线图，其中：图4中a为定量PCR的检测miR-124-3P的标准曲线；图4中b为定量PCR的检测miR-124-5P的标准曲线；图4中c为探针材料检测miR-124-3P的标准曲线；图4中d为探针材料检测miR-124-3P的标准曲线；
图5为本试验例探针材料对不同的小RNA检测对比结果图，图5中a为miR-124-3P探针的对比结果，图5中b为miR-124-5P探针的对比结果。
3.对实际的样品检测
实际待检测的样本为：从医院获取患有心肌梗死的病人样本、其他心血管疾病(例如高血压)的样本以及经体检检测未患心血管疾病的人的血液样本，分离血清后获得分别对应心肌梗死病人、其他心血管疾病的病人以及未患心血管疾病的人的实际待检测样本。
利用实时荧光定量PCR的方法对实际待检测样本中提取的RNA进行检测，同时计算出不同的实际待检测样本中待检测的微小RNA的含量，随后将本发明实施例1-6以及对比例1-3对应的磁性探针与实际待检测的样混合孵育10分钟后利用全功能微孔板检测仪进行检测，根据响应情况，结合检测曲线确定样本中待检测的微小RNA的含量，测量结果见下表1：
表1
将本发明实施例2的实际检测结果与利用实时荧光定量PCR方法检测的结果进行比较发现，本发明的磁性探针检测的实验结果与通过定量PCR方法得当的实验结果基本吻合，这也说明了我们探针材料的有效性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (45)

1.一种磁性探针，其特征在于，所述磁性探针包括磁性探针材料和修饰于所述磁性探针材料表面的适配子；
所述磁性探针材料包括：顺次连接的磁性材料、氨基、羰基、PEG以及N-羟基硫代琥珀酰；还包括硅基材料，硅基材料包覆所述磁性材料，且所述硅基材料与氨基、羰基、PEG以及N-羟基硫代琥珀酰顺次连接；所述硅基材料为二氧化硅，所述磁性材料为四氧化三铁；
所述磁性材料的形状包括球形颗粒状和棒状颗粒状，球形颗粒状磁性材料的粒径在60nm，棒状颗粒状磁性材料的粒径为长50nm±1nm，宽度7nm±1nm；
所述适配子的序列包括如下(a)-(d)中的至少一种：
(a)HPN CP-124-3-dabcyl：
5’-CTAATCGTGATAGGGGTATTGGCATTCACCGCGTGCCTTATACCCCT ATCACGATTAGCATTAA-3’(SEQ ID NO.1)；
(b)HPN CP-124-5-dabcyl：
5’-CTAATCGTGATAGGGGTAATCAAGGTCCGCTGTGAACACGTACCCC TATCACGATTAGCATTAA-3’(SEQ ID NO.2)；
(c)HPN CP-23a-3-dabcyl：
5’-CTAATCGTGATAGGGGTAAAATCCCATCCCCAGGAACCCCTACCCCT ATCACGATTAGCATTAA-3’(SEQ ID NO.3)；
(d)HPN CP-23a-5-dabcyl：5’-
CTAATCGTGATAGGGGTACAACTCAGCTTGTCAAATACACGTACCCCT ATCACGATTAGCATTAA-3’(SEQID NO.4)；
其中，所述适配子的序列5'端依次带有淬灭基团和Amino C6核酸标记，3'端带有荧光基团。
2.根据权利要求1所述的磁性探针，其特征在于，基于所述磁性探针材料的总质量，所述磁性材料的含量为67.7wt％。
3.根据权利要求1所述的磁性探针，其特征在于，所述磁性探针材料的制备方法包括以下步骤：
对磁性材料依次进行氨基化处理和羰基化处理，得到羰基化磁性材料；
在所述羰基化磁性材料中依次引入PEG和N-羟基硫代琥珀酰，得到所述磁性探针材料；
所述磁性材料经过预处理，预处理包括在所述磁性材料的表面包覆硅基材料。
4.根据权利要求3所述的磁性探针，其特征在于，所述氨基化包括：将磁性材料与3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液进行第一反应。
5.根据权利要求4所述的磁性探针，其特征在于，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液的体积浓度为4-6％。
6.根据权利要求4所述的磁性探针，其特征在于，所述第一反应的时间为反应1-3小时。
7.根据权利要求4所述的磁性探针，其特征在于，将所述第一反应得到的产物进行干燥处理，所述干燥的温度为100-120℃，所述干燥的时间为10-14小时。
8.根据权利要求7所述的磁性探针，其特征在于，用乙醇清洗所述第一反应得到的产物之后再进行所述干燥处理。
9.根据权利要求3所述的磁性探针，其特征在于，所述羰基化包括：将氨基化的磁性材料与戊二醛溶液进行第二反应。
10.根据权利要求9所述的磁性探针，其特征在于，所述戊二醛溶液的体积浓度为3-5％。
11.根据权利要求9所述的磁性探针，其特征在于，所述第二反应的时间为1-3小时。
12.根据权利要求9所述的磁性探针，其特征在于，所述戊二醛溶液中含有浓度为450-550mM的氰基硼氢化钠。
13.根据权利要求9所述的磁性探针，其特征在于，离心所述第二反应的产物。
14.根据权利要求13所述的磁性探针，其特征在于，用PBS洗涤离心后的第二反应的产物。
15.根据权利要求3所述的磁性探针，其特征在于，引入PEG包括：将羰基化的磁性材料与羧基-PEG-胺溶液进行第三反应。
16.根据权利要求15所述的磁性探针，其特征在于，所述羧基-PEG-胺溶液中含有450-550mM的氰基硼氢化钠。
17.根据权利要求15所述的磁性探针，其特征在于，所述第三反应的时间为10-14小时。
18.根据权利要求15所述的磁性探针，其特征在于，离心所述第三反应的产物。
19.根据权利要求18所述的磁性探针，其特征在于，依次用PBS和纯水洗涤离心后的第三反应的产物。
20.根据权利要求3所述的磁性探针，其特征在于，引入N-羟基硫代琥珀酰包括：将引入PEG的磁性材料与N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液进行第四反应。
21.根据权利要求20所述的磁性探针，其特征在于，N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液的浓度为8-12mM。
22.根据权利要求20所述的磁性探针，其特征在于，N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液中含有浓度为4-6mM的N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。
23.根据权利要求20所述的磁性探针，其特征在于，所述第四反应的时间为10-14小时。
24.根据权利要求20所述的磁性探针，其特征在于，离心所述第四反应的产物。
25.根据权利要求24所述的磁性探针，其特征在于，用含有无核酸酶的溶液洗涤所述离心后的第四反应的产物。
26.根据权利要求25所述的磁性探针，其特征在于，依次用水、乙醇、1×PBS缓冲液以及无核酸酶的水对所述第四反应的产物进行洗涤，得到所述磁性探针材料。
27.根据权利要求1所述的磁性探针，其特征在于，所述淬灭基团为Dabcyl。
28.根据权利要求1所述的磁性探针，其特征在于，所述荧光基团包括FAM或Cy5。
29.根据权利要求1所述的磁性探针，其特征在于，所述Amino C6核酸标记的序列为：5’-CCC ACC AAC CAT-3’(SEQ ID NO.5)。
30.一种根据权利要求1-29中任一项所述的磁性探针的制备方法，其特征在于，所述的磁性探针的制备方法包括：
将氨基化的磁性探针材料与适配子混合反应，得到磁性探针。
31.根据权利要求30所述的磁性探针的制备方法，其特征在于，所述混合反应的时间为12-14小时。
32.根据权利要求31所述的磁性探针的制备方法，其特征在于，磁性探针材料的氨基化包括：将磁性探针材料与含有EDC和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的交联溶液中进行交联反应，得到氨基化的磁性探针材料。
33.根据权利要求32所述的磁性探针的制备方法，其特征在于，交联反应的时间为5-7小时。
34.根据权利要求32所述的磁性探针的制备方法，其特征在于，EDC的浓度为4-6mM。
35.根据权利要求32所述的磁性探针的制备方法，其特征在于，N-羟基硫代琥珀酰亚胺的浓度为8-12mM。
36.根据权利要求32所述的磁性探针的制备方法，其特征在于，所述交联溶液的溶剂包括MES。
37.根据权利要求32所述的磁性探针的制备方法，其特征在于，所述交联溶液的pH为4-6。
38.根据权利要求37所述的磁性探针的制备方法，其特征在于，所述交联溶液的pH为4.5。
39.一种根据权利要求1-29中任一项所述的磁性探针在制备用于诊断和/或愈后评估心脏疾病的产品中的应用。
40.根据权利要求39所述的应用，其特征在于，所述心脏疾病包括心肌梗死。
41.根据权利要求39所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。
42.根据权利要求39所述的应用，其特征在于，所述产品的检测样本包括血清、血浆或尿液。
43.一种试剂或者试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-29中任一项所述的磁性探针。
44.一种分子标记物，其特征在于，所述分子标记物被权利要求1-29中任一项所述的磁性探针进行检测。
45.根据权利要求44所述的分子标记物，其特征在于，所述分子标记物包括Hsa-miR-19a-3、Hsa-miR-145-5、Has-miR-197-5、Hsa-miR-124-5p、Hsa-miR-124-3p、Hsa-miR-223-5p、Hsa-miR-23a-5p以及Hsa-miR-23a-3p中的至少一种。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102660255A (zh) * 2012-04-20 2012-09-12 北京化工大学 一种具有生物活性的磁性荧光纳米粒子及其制备方法
CN103980365A (zh) * 2014-06-03 2014-08-13 国家纳米科学中心 一种表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子、其制备方法及用途
CN105920620A (zh) * 2016-06-21 2016-09-07 东南大学 磁性荧光多模态纳米生物探针及其制备方法和应用
CN106057394A (zh) * 2016-06-01 2016-10-26 深圳市瀚德标检生物工程有限公司 一种免疫磁性纳米微粒的制备方法
CN109001452A (zh) * 2018-07-26 2018-12-14 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 α-突触核蛋白积聚的检测探针的制备方法及其产品和应用
CN109439314A (zh) * 2018-12-07 2019-03-08 武汉工程大学 特异性识别Fe(III)的磁性纳米荧光探针的制备方法
CN110205376A (zh) * 2019-06-27 2019-09-06 青岛大学 硅基探针材料、硅基探针及其制备方法和应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102660255A (zh) * 2012-04-20 2012-09-12 北京化工大学 一种具有生物活性的磁性荧光纳米粒子及其制备方法
CN103980365A (zh) * 2014-06-03 2014-08-13 国家纳米科学中心 一种表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子、其制备方法及用途
CN106057394A (zh) * 2016-06-01 2016-10-26 深圳市瀚德标检生物工程有限公司 一种免疫磁性纳米微粒的制备方法
CN105920620A (zh) * 2016-06-21 2016-09-07 东南大学 磁性荧光多模态纳米生物探针及其制备方法和应用
CN109001452A (zh) * 2018-07-26 2018-12-14 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 α-突触核蛋白积聚的检测探针的制备方法及其产品和应用
CN109439314A (zh) * 2018-12-07 2019-03-08 武汉工程大学 特异性识别Fe(III)的磁性纳米荧光探针的制备方法
CN110205376A (zh) * 2019-06-27 2019-09-06 青岛大学 硅基探针材料、硅基探针及其制备方法和应用

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