KR101661315B1 - 시료 내 다중 타겟의 동시 검출방법 및 이의 용도 - Google Patents

시료 내 다중 타겟의 동시 검출방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시료 내 다중 타겟의 동시 검출방법 및 이를 이용하는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 방법 및 키트는 (a) (i) 첫 번째 타겟팅 모이어티 및 첫 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합된 첫 번째 타겟 검출용 금속 나노입자 및 (ii) 두 번째 타겟팅 모이어티 및 두 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합된 두 번째 타겟 검출용 금속 나노입자; 및 (b) 상기 첫 번째 또는 두 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드에 각각 혼성화할 수 있는 2종의 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용하여 두 개의 타겟을 동시에 검출한다. 상기 검출은 상기 형성된 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드의 분해를 통해 얻어지는 형광 분석을 통해 다중으로 동시에 이루어진다. 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 감염 질환(특히, 바이러스-유도된 감염 질환)의 분자적 진단에 유용하고, 무엇보다도 목적 시료(예컨대, 환자로부터 채취된 소량의 혈액 시료)에서 다중 타겟(multiple target)을 동시에 분석할 수 있음에 따라 체외 진단 같은 의약 용도로 간편하고 효과적으로 적용할 수 있다.

Description

시료 내 다중 타겟의 동시 검출방법 및 이의 용도{Simultaneous Detection Methods of Multiple Targets in a Sample and Uses Thereof}
본 발명은 시료 내 다중 타겟의 동시 검출방법 및 이를 이용하는 키트에 관한 것이다.
현재까지 많은 다중 면역 분석 방법 기술이 개발되었지만 마이크로웰 플레이트 상에서 다양한 바이러스 감염에 대한 각 항원과 항체를 동시에 정량적으로 측정하는 기술은 아직까지 보고되지 않았다. 마이크로웰 플레이트 방식의 정량 분석 방법으로 ELISA가 많이 이용되고 있지만 이는 동시 다중 분석이 불가능하고, 측정을 위한 동적 범위(dynamic range)에 한계가 있다. 또한, 인체에는 항-인간 IgG와 같은 2차 항체와 결합하는 여러 항체들이 존재하여 타겟에 특이적인 신호 생성이 불가능하므로 본 발명에서는 간접적 어세이 방법을 다소 변형하여 동시 다중 측정이 가능하도록 하는 방법을 제시하고자 한다.
혈액 내의 바이러스 감염과 같은 질병 타겟을 검출하는 방법으로 많이 사용되는 방법에는 분지쇄 DNA 시그널 증폭 어세이, 전사-매개된 증폭 어세이, PCR-기반된 핵산 증폭 어세이, 등과 같은 핵산 증폭 테스팅 방법(NAT)이 있다. 그러나, 이들 방법이 매우 민감한 검출 플랫폼인 반면에 증폭 전 DNA 제조 단계가 필수적이고 고가의 장비와 잘 훈련된 실험자가 필요한 단점이 있다. 또한, 원하지 않는 타겟의 증폭을 막기 위해 프라이머의 디자인에 각별한 주의가 요구된다. 이런 점 때문에 ELISA를 이용한 샘플의 전-스크리닝 과정을 거치기도 하는데, 일반적인 ELISA 시스템으로는 한 개 이상의 타겟을 검출하기는 어려운 실정이다. 이런 점들을 극복하기 위해 마이크로비드를 이용한 멀티플렉스 마이크로비드 면역어세이(MMIA) 방법으로 더 효과적이고 향상된 스크리닝 과정을 거치기도 하지만 이 방법 역시 고가의 유세포 분석 장비 등이 필요하다. 따라서, 상술한 여러 문제들을 극복하기 위해 매우 간편하면서 실행이 용이한 방식으로 다중 바이오마커를 동시에 분석하는 방법이 당업계에 시급히 요구되고 있는 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 항원 및 항체를 동시에 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 타겟팅 모이어티와 검출용 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면에 결합된 금속 나노입자(예컨대, 금 나노입자)를 이용하여 타겟 분자를 포획한 후 상기 올리고뉴클레오타이드 바코드에 상보적인 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브(구체적으로는, 형광성 RNA 프로브)를 이용하여 상기 타겟 분자를 형광으로 간편하고 효율적으로 검출할 수 있으며, 서로 다른 타겟팅 모이어티와 올리고뉴클레오타이드 바코드를 이용하여 제조된 2종 이상의 금속 나노입자들 및 상기 바코드에 상보적인 2종 이상의 형광성 프로브들을 이용하는 경우 목적 시료에서 2종 이상의 타겟 분자들(예컨대, 간염 바이러스 A, B, C, D, 등)을 동시에 높은 민감도로 검출 또는 동정할 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 시료 내 이중 타겟의 동시 검출용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 시료 내 이중 타겟의 동시 검출방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 첫 번째 타겟팅 모이어티(targeting moiety) 및 첫 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드(barcode)가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합된 첫 번째 타겟 검출용 금속 나노입자; (b) 두 번째 타겟팅 모이어티 및 두 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합된 두 번째 타겟 검출용 금속 나노입자; 및 (c) 상기 첫 번째 또는 두 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드에 각각 혼성화할 수 있는 2종의 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는 시료 내 이중 타겟의 동시 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 시료 내 이중 타겟의 동시 검출방법을 제공한다:
(a) 목적 시료(sample of interest)를 2종의 금속 나노입자와 접촉시키는 단계로, 상기 금속 나노입자는 (i) 첫 번째 타겟팅 모이어티 및 첫 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합된 첫 번째 타겟 검출용 금속 나노입자 및 (ii) 두 번째 타겟팅 모이어티 및 두 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합된 두 번째 타겟 검출용 금속 나노입자로 이루어지고;
(b) 상기 단계 (a)의 혼합물을 상기 첫 번째 타겟 및 두 번째 타겟과 각각 결합할 수 있는 2종의 항체가 코팅된 기판과 반응시키는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 기판에 포획된 복합체와 2종의 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브를 혼성화시키는 단계로, 상기 2종의 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브는 상기 첫 번째 또는 두 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드에 각각 혼성화하며; 및
(d) 상기 단계 (c)의 복합체 내 금속 나노입자 위에서 혼성화되어 형성되는 2종의 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 분자를 가수분해시켜 상기 프로브-유래된 형광 시그널을 검출하는 단계.
본 발명자들은 항원 및 항체를 동시에 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 타겟팅 모이어티와 검출용 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면에 결합된 금속 나노입자(예컨대, 금 나노입자)를 이용하여 타겟 분자를 포획한 후 상기 올리고뉴클레오타이드 바코드에 상보적인 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브(구체적으로는, 형광성 RNA 프로브)를 이용하여 상기 타겟 분자를 형광으로 간편하고 효율적으로 검출할 수 있으며, 서로 다른 타겟팅 모이어티와 올리고뉴클레오타이드 바코드를 이용하여 제조된 2종 이상의 금속 나노입자들 및 상기 바코드에 상보적인 2종 이상의 형광성 프로브들을 이용하는 경우 목적 시료에서 2종 이상의 타겟 분자들(예컨대, 간염 바이러스 A, B, C, D, 등)을 동시에 높은 민감도로 검출 또는 동정할 수 있다는 것을 확인하였다.
종래의 면역어세이 방법들은 항원-항체 결합을 이용하는 직접적인 또는 간접적인 방법들로, 항원과 항체가 모두 존재하는 시료에서는 상기 항원과 항체를 동시에 검출하기는 어려웠다. 간략하게는, 검출하고자 하는 물질이 항체 또는 항원인 경우 기판 상에 고정된 물질은 각각 항원 또는 항체이다. 기판에 고정된/결합된 물질과 검출하고자 하는 물질이 서로 결합하여 복합체를 형성하는 경우, 최종적으로 상기 복합체(즉, 항체-항원 또는 항원-항체 복합체)를 검출하기 위해서 1차 검출 항체를 이용한다. 따라서, 상기 1차 검출 항체를 확인하기 위해서는 동일한 2차 항체(예컨대, 항-인간 IgG)를 사용하기 때문에 양자(항체-항원 복합체 및 항원-항체 복합체) 간의 검출 시그널을 구분할 수 없다는 문제가 있어 실제적인 질환 진단에 적용하기 어렵다. 이를 극복하고 보다 효율적인 검출 또는 진단 방법을 극복하기 위해, 본 발명자들은 간접적인 금 나노입자-올리고뉴클레오타이드 연결된 면역어세이(oligonucleotide-linked immunosorbent assay, OLISA) 방법을 고안하였고, 이를 이용하여 동일 시료 내에서 항원 및 항체를 동시에 검출/동정할 수 있었다(참고: 도 1 및 도 2).
먼저, 금속 나노입자 복합체들을 제조하였다(참고: 도 1). 상기 금속 나노입자 복합체는 각각 개별적으로 독특한 타겟팅 모이어티 및 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드와 결합된 금속 나노입자 복합체로, 각 금속 나노입자 복합체는 서로 다른 타겟에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 검출하고자 하는 타겟이 2종인 경우 2종의 금속 나노입자 복합체를 이용하며, 상기 금속 나노입자 복합체 내 첫 번째 타겟팅 모이어티와 두 번째 타겟팅 모이어티는 서로 다른 타겟에 대한 결합능 및 특이성을 가진다.
본 발명의 동시 검출방법의 첫 단계로서, 목적 시료를 금속 나노입자 복합체들과 접촉시킨다. 본 발명에서 사용되는 용어“목적 시료(sample of interest)”는 상기 금속 나노입자 복합체를 이용하여 타겟을 검출하는 데 이용되는 어떠한 생물학적 시료를 의미하며, 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 타액, 객담, 소변, 림프, 골수액, 타액, 우유, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수, 양막액 또는 세포 조직액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 혈액, 혈장 및 혈청을 포함한다.
목적 시료에서 2종의 타겟을 동시에 검출하는 경우, 서로 상이한 구성을 가지는 2종류의 금속 나노입자 복합체를 이용한다. 보다 상세하게는, 2종의 금속 나노입자 복합체는 (i) 첫 번째 타겟팅 모이어티 및 첫 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합된 첫 번째 타겟 검출용 금속 나노입자 및 (ii) 두 번째 타겟팅 모이어티 및 두 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합된 두 번째 타겟 검출용 금속 나노입자로 구성되고, 보다 구체적으로는 (i) 항원-타겟팅 모이어티 및 첫 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합된 첫 번째 타겟 검출용 금속 나노입자 및 (ii) 항체-타겟팅 모이어티 및 두 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합된 두 번째 타겟 검출용 금속 나노입자로 구성된다. 예를 들어, 목적 시료에서 B형 및 C형 간염 바이러스를 동시에 검출하는 경우, 2종의 금속 나노입자 복합체는 (i) HCV(hepatitis C virus)의 항원-타겟팅 모이어티 및 첫 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합된 첫 번째 타겟 검출용 금속 나노입자 및 (ii) HBV(hepatitis B virus)에 대한 검출항체(detection antibody)-타겟팅 모이어티 및 두 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합된 두 번째 타겟 검출용 금속 나노입자로 구성될 수 있으며, 또한 반대로 HCV 항체-타겟팅 모이어티 및 HBV 항원-타겟팅 모이어티가 각각 이용될 수도 있다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 키트 및 방법에서 3종의 타겟을 동시에 검출하는 경우, 서로 상이한 구성을 가지는 세 번째 금속 나노입자 복합체를 이용할 수 있고, 보다 구체적으로는 세 번째 타겟팅 모이어티 및 세 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합된 금속 나노입자 및 상기 세 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드에 상보적인 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 키트 및 방법이 금속 나노입자 복합체의 종류에 따라 3개 이상의 타겟을 검출하는 데 적용될 수 있지만, 특별히 다르게 지시되지 않는 한 이하 기재는 2종의 금속 나노입자 복합체를 이용하는 경우로 예시된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “나노입자”는 나노 단위의 직경, 구체적으로는 8-100 nm, 보다 구체적으로는 10-50 nm, 및 가장 구체적으로는 20-30 nm의 직경을 가지는 다양한 물질의 입자를 의미한다. 상기 나노입자는 나노크기를 갖는 입자라면 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 나노카본, 금속 나노입자, 금속산화물 입자, 양자점(quantum dot), 고분자 라텍스, 고분자 나노스피어 등을 들 수 있다. 본 발명에서 이용되는 나노입자는 금속 나노입자를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어“금속 나노입자”는 나노 단위의 직경, 구체적으로는 8-100 nm, 보다 구체적으로는 10-50 nm, 및 가장 구체적으로는 20-30 nm의 직경을 가지는 금, 은, 백금, 구리, 팔라듐 및 철 등의 금속입자를 포함하나, 이에 제한되지 않고 금속의 성질을 갖는 모든 나노 크기의 입자를 포함한다. 이러한 작은 입자 크기는 본 발명의 금속 나노입자가 목적 타겟(예컨대, 바이러스에 대한 항원 또는 항체)과 효율적으로 결합하는 것을 용이하게 해준다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명에서 이용되는 금속 나노입자는 금, 백금, 은, 구리 또는 팔라듐 나노입자이고, 보다 구체적으로는 금 나노입자이다. 금 나노입자는 안정한 입자의 형태로 제조가 쉬우며, 크기 조절이 용이하고, 망간, 알루미늄, 카드늄, 납, 수은, 코발트, 니켈, 베릴륨 등의 중금속과 달리 인체에 무해하여 높은 생체친화성을 가진다. 예를 들어, 본 발명에서 이용되는 금 나노입자는 다음과 같이 제조될 수 있다: HAuCl4를 금 공급원으로 하고, 소듐 시트레이트를 환원제로 하여 HAuCl4를 환원시켜 금 나노입자를 제조할 수 있다. 이러한 경우에 금 나노입자의 크기는 첨가하는 시트레이트를 달리해 줌으로써 조절이 가능한다. 즉, 시트레이트의 첨가량을 증가시킬수록 핵형성(nucleation)이 많이 되기 때문에 금 나노입자의 크기는 감소할 수 있다. 금 나노입자는 직경이 100 nm 이상으로 커질 경우 나노 입자로서의 특성이 소멸될 뿐 아니라, 나노 물질의 특성이 없는 금 표면과 티올기 등의 작용기와의 결합이 약하기 때문에 금 입자를 매개로 하여 작용기를 유니버설 결합파트너 분자가 결합된 입자가 제조되기 어렵다. 따라서, 본 발명의 금 나노입자의 직경은 구체적으로는 8-100 nm, 보다 구체적으로는 10-50 nm, 및 가장 구체적으로는 20-30 nm이다.
본 발명에서 이용되는 유니버셜 결합파트너 분자는 금속 나노입자(구체적으로는, 금 나노입자)의 표면에 서로 독립적으로 결합되는 타겟팅 모이어티 및 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “타겟팅 모이어티(targeting moiety)”는 금속 나노입자의 표면에 결합되어 타겟(즉, 목적 분자)과 결합할 수 있는 공지의 물질 또는 신규한 물질을 의미한다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 타겟팅 모이어티는 항체, 항원, 펩타이드, 단백질 또는 이의 단편이고, 보다 구체적으로는 항체, 항원, 펩타이드 또는 이의 단편이며, 보다 더 구체적으로는 항체, 항원 또는 이의 단편이다. 예를 들어, 본 발명에서 이용될 수 있는 타겟팅 모이어티는 항체 또는 항체의 Fab 및 Fc 부위를 포함할 수 있으며, 상기 Fab 부위를 통하여 타겟의 항원과 비공유적으로 결합하게 되고 결합 특성을 가지는 범위 내에서 통상적인 전장 Fab부위의 일부 영역일 수도 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “Fab 부위”는 타겟의 항원과 상호작용하는 항체의 하나의 부위를 의미한다. 일반적으로, 하나의 클래스에서 모든 항체의 Fab 부위는 거의 동일한 특성을 나타낸다.
상기 타겟팅 모이어티가 항체인 경우, 전장 항체 또는 이의 일부가 이용될 수 있다. 전장 항체는 다중클론 항체 및 단일클론 항체를 포함하며, 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 “단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드(single strand oligonucleotide barcode)”는 타겟과 결합되어 있는 금속 나노입자의 검출에 이용되는 모이어티로서, 본 발명의 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브(예컨대, RNA 프로브)와 혼성화되어 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드(예컨대, DNA-RNA 복합체)를 형성할 수 있는 ‘바코드’ 기능을 가지는 올리고뉴클레오타이드이며, 말단(구체적으로는, 5'-말단)에 금속 나노입자와 결합할 수 있는 작용기를 가진다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 5'-말단에 티올기 또는 아민기가 결합되어 있고, 보다 구체적으로는 티올기가 결합되어 있다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 길이는 6 내지 20개의 염기이며, 보다 구체적으로는 10 내지 15개의 염기이다. 통상적으로, 염기 서열의 수가 6개 미만이면 식별력이 떨어지거나, 혼성화된 이중 가닥 형성이 용이하지 않고 20개를 초과하는 경우 식별력과 이중 가닥 형성의 측면에서 개선되는 효과가 미미하지만 20개를 초과하는 것도 가능하다. 본 발명에서, 본 발명의 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1 및 서열번호 2로 예시되어 있지만, 상기 서열에 한정되는 것은 아니다. 또한, 저해 효과가 없는 한 본 발명의 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 안정성을 위해 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수도 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol ., 5(3):343-55, 1995).
상기 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 금속 나노입자에 직접적으로 결합하는 것이 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브와의 결합(이합체 형성) 및 이후 혼성화된 이중 가닥에 대한 리보핵산 분해 효소(예컨대, RNase H)의 활성을 방해하는 영향을 미칠 수 있음을 고려하여, 상기 금속 나노입자와 상기 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드 간에 링커(또는 스페이서)가 개입될 수 있다. 상기 링커는 상기 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 나노입자에 높은 밀도로 결합될 수 있게 해 줄 뿐 아니라 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브와의 결합도 보다 용이하게 해 주는 기능을 할 수 있다. 상기 링커는, 적당한 길이의 올리고뉴클레오타이드, 구체적으로는 올리고 A 뉴클레오타이드, 올리고 T 뉴클레오타이드, 올리고 C 뉴클레오타이드, 또는 A, T 또는 C가 조합된 올리고뉴클레오타이드일 수 있으며, 올리고 G 뉴클레오타이드의 경우는 G-4중 나선(G-quadruplex) 같은 이차 구조를 유발하여 효소의 활성을 저해시킬 수 있다는 단점이 있지만 G 염기는 A, T 또는 C와 조합된 올리고뉴클레오타이드를 형성하여 링커에 포함될 수도 있다.
다음으로, 상기 목적 시료 내 타겟과 금속 나노입자 복합체 간에 형성되는 결합 복합체를 분리하기 위해 첫 번째 타겟 및 두 번째 타겟에 결합할 수 있는 항체가 코팅된/고정화된 기판(substrate)과 상기 결합 복합체를 포함하는 혼합물을 반응시킨다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 기판은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 플레이트, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함하고, 보다 구체적으로는 플레이트이며, 가장 구체적으로는 마이크로웰 플레이트이다.
마지막 단계로, 기판 위에 고정화된 타겟과 결합된 금속 나노입자 복합체 내 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드와 혼성화될 수 있는 2종의 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브를 첨가하여 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드를 형성시킨다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “혼성화(hybridization)”는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 상기 용어“어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브는 양 말단에 각각 형광물질(fluorophore) 및 퀀처(quencher) 분자를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브(fluorescent oligonucleotide probe)”는 상기 검출성 올리고뉴클레오타이드 바코드에 상보적인 서열, 보다 구체적으로는 RNA 서열로, 상기 검출성 올리고뉴클레오타이드 바코드 서열과 혼성화되어 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 서열을 형성하는 분자를 의미하며, 구체적으로는 서열번호 3 및 서열번호 4로 제시되지만, 이는 하나의 실시예일 뿐 이에 한정되는 것은 아니다.
이후 리보핵산 분해 효소 H(RNase H)를 첨가하여 상기 형성된 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드를 분해시켜 상기 분해된 형광성 뉴클레오타이드 프로브의 말단으로부터 유래되는 형광을 검출함으로써 상기 목적 시료 내 2종 타겟의 존재를 정량적으로 확인한다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브의 양 말단은 로다민, 쿠마린, 시아닌, EvoBlue, 옥사진, 카르보피로닌(carbopyronin), 나프탈렌, 바이페닐, 안트라센(anthracene), 페난트렌, 파이렌, 카르바졸 등을 기본 백본으로 가지는 형광 색소 또는 이의 유도체 같은 형광성 모이어티가 선택적으로 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 형광성 모이어티는 ATTO 390™ (479), ATTO　425™ (484), ATTO　465™ (508), ATTO　488™ (523), ATTO　495™ (527), ATTO　520™ (538), ATTO　532™ (553), ATTO　Rho6G™ (570), ATTO　550™ (576), ATTO　565™ (592), ATTO　Rho3B™ (565), ATTO　Rho11™ (608), ATTO　Rho12™ (532), ATTO　Thio12™ (579), ATTO　610™ (634), ATTO　611 X™ (681), ATTO　620™ (643), ATTO　Rho14™ (625), ATTO 633™ (657), ATTO　647™ (669), ATTO　647 N™ (669), ATTO　655™ (684), ATTO　Oxa12™ (663), ATTO　700™ (719), ATTO 725™ (752), ATTO　740™ (764), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), EvoBlue10™, EvoBlue30™, MR121, Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), 로다민(Rhodamine) 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), 피코에리트린 R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), 피로닌 Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-피코시아닌 (642), C-피코시아닌 (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), 티아디카르보시아닌 (671), Cy5.5(694), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705), Quasar 705 (610) 및 이의 유도체 또는 컨쥬게이트와 연결될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다. 또한, 본 발명의 형광성 모이어티 유도체는 자유 카르복실기, 에스테르(예컨대, N-하이드로숙신이미드(NHS) 에스테르) 또는 말레이미드 유도체를 추가적으로 포함할 수 있으며, 본 발명의 형광성 모이어티의 컨쥬게이트는 스트렙타비딘, 바이오틴, 팔로이딘, 아민, 아자이드 또는 이오도아세트아미트 컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “연결(link)” 또는 “컨쥬게이션(conjugation)”은 최소 하나의 화학적 결합을 통해 두 개의 구성요소들을 연결하는 것을 의미하며, 상기 연결 또는 컨쥬게이션은 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 배위 결합, 등과 같이 당업계에 알려진 어떠한 결합을 포함할 수 있고, 구체적으로는 공유 결합을 통해 이루어진다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브의 5'-말단은 ROX 또는 Cy5.5의 형광물질로 표지되고, 상기 3'-말단은 BHQ-2로 표지된다.
또한, 본 발명의 방법은 상기 첫 번째 또는 두 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드와 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브 간에 형성된 2종의 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 분자를 상기 금속 나노입자로부터 해리시키는 과정을 추가적으로 실시할 수 있고, 상기 과정은 혼성화 단계 전 또는 상기 단계에서 동시에 실시될 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 해리 과정은 환원제의 처리, 보다 구체적으로는 DTT(dithiothreitol), β-머캅토에탄올(mercaptoethanol) 또는 이의 혼합물을 처리하여 실시할 수 있다.
본 발명의 금속 나노입자 복합체를 이용하여 목적 시료에서 얻어진 형광 시그널은 2종 이상의 타겟 검출에 효과적으로 이용될 수 있으며, 특히 2종의 타겟(예컨대, HCV 항원 및 HBV 검출 항체)을 효과적으로 분리하는 시그널을 제공한다(참고: 도 1). 또한, 상기 형광 시그널 분석은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 실시될 수 있다. 즉, 형광 시그널은 당업계에서 이용가능한 적합한 장치(apparatus)에 의해 판독되고 프로세싱된다. 예를 들어, 형광 분석기, 마이크로플레이트 판독기(예컨대, 아플리스칸), 로봇 장치들을 이용한 자동화 프로세싱, 레이저 스캐닝 시스템을 포함하는 당업계에 알려진 프로토콜 및 과정들이 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “CV(coefficient of variation)”는 통계학에서 표준편차들의 평균값으로, 각각의 평균값이 얼마나 분포되어 있는 지를 나타내 CV값이 작을수록 신뢰도가 높아진다. 즉, 본 발명의 나노 금속입자 복합체를 이용하는 경우 측정된 형광 값들의 편차(%CV값)가 매우 낮은 범위였다는 것은 현저하게 높은 민감도로 타겟들(예컨대, 2종의 타겟들)을 분리시킬 수 있다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “정확도(recovery)”는 분석 과정에 대한 실제적인 효율을 의미하며, 알고 있는 양/농도의 시료로 실시된 분석 과정을 실시(즉, 첨가된 양/농도에 대해 측정된 양/농도의 비율 측정)하여 상기 분석 과정의 신뢰도를 평가하는 수치이다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 금속 나노입자 복합체는 매우 낮은, 보다 구체적으로는 20%CV, 및 보다 더 구체적으로는 2-15%CV 값을 나타내고, 높은 보다 구체적으로는 90% 이상, 보다 더 구체적으로는 95% 이상, 및 가장 구체적으로는 96% 이상의 정확도를 나타낸다(참고: 표 2).
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 키트 및 방법이 적용될 수 있는 타겟은 바이러스, 곰팡이, 박테리아 또는 다른 미생물을 포함하며, 보다 구체적으로는 바이러스를 포함한다. 따라서, 본 발명의 키트 및 방법은 검출 대상인 타겟에 의해 유도되는 감염 질환의 동정 및 진단에 적용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “감염 질환(infectious disease)”은 대상자(subject) 또는 환자 내에 또는 이와 접촉하는 생물체(감염성 제제; 예컨대, 바이러스)의 존재와 관계되는 질환 또는 상태를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 감염 질환 또는 상태의 동정, 상기 질환의 치료에 대한 반응성 및 이의 효과 판단)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 검출 대상이 B형 및 C형 간염 바이러스인 경우, 상기 바이러스들에 의해 유도되는 질환의 진단에 유용하다. 대상자/환자(subject/patient)로부터 유래된 시료(예컨대, 혈액)와 본 발명의 2종의 금속 나노입자(보다 구체적으로는, 금 나노입자)를 반응시키는 단계를 포함하는 방법을 통해 상기 시료에서 상이한 2종의 바이러스들(예컨대, B형 및 C형 간염 바이러스)의 존재 유무를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 키트 및 방법은 미생물에 의해 유발되는 질환, 보다 구체적으로는 바이러스에 의해 유발되는 질환, 및 보다 더 구체적으로는 간염 바이러스에 의해 유발되는 질환의 동정 또는 진단에 간편하고 효율적으로 적용될 수 있다. 이용되는 금속 나노입자 복합체에 따라서, 본 발명이 적용될 수 있는 미생물-유발 감염 질환은 다양할 수 있고, 보다 구체적으로는 포유동물(예컨대, 인간)에서 발병되는 바이러스-유도성 간 질환 및 박테리아 감염 질환(bacterial infectious disease)을 포함하며, 보다 더 구체적으로는 간염 바이러스에 의한 간 질환 및 호흡기 바이러스-감염 질환을 포함한다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 간염 바이러스(예컨대, A형, B형, C형, D형, E형 간염 바이러스)에 의해 유도되는 지방간, 간염, 간경변증 및 간암을 포함하고, 호흡기 바이러스-감염 질환은 코감기, 천식, 알러지성 및 계절성 비염, 인두염, 위막성 후두염(croup), 후두염의 상기도 감염과 이로 인한 부비동염, 중이염 합병증, 기관지염, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 폐기종(emphysema), 폐렴, 폐렴의 하기도 감염에 의한 호흡기 질환 및 염증성 기도 질환을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 시료 내 다중 타겟의 동시 검출방법 및 이를 이용하는 키트에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 방법 및 키트는 (a) (i) 첫 번째 타겟팅 모이어티 및 첫 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합된 첫 번째 타겟 검출용 금속 나노입자 및 (ii) 두 번째 타겟팅 모이어티 및 두 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합된 두 번째 타겟 검출용 금속 나노입자; 및 (b) 상기 첫 번째 또는 두 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드에 각각 혼성화할 수 있는 2종의 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용하여 두 개의 타겟을 동시에 검출한다.
(c) 상기 검출은 상기 형성된 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드의 분해를 통해 얻어지는 형광 분석을 통해 다중으로 동시에 이루어진다.
(d) 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 감염 질환(특히, 바이러스-유도된 감염 질환)의 분자적 진단에 유용하고, 무엇보다도 목적 시료(예컨대, 환자로부터 채취된 소량의 혈액 시료)에서 다중 타겟(multiple target)을 동시에 분석할 수 있음에 따라 체외 진단 같은 의약 용도로 간편하고 효과적으로 적용할 수 있다.
도 1은 항원 및 항체를 동시에 다중 측정하는 멀티플렉스(multiplex) GNP OLISA 방법에 대한 개략도이다: A 패널, 타겟팅 모이어티 및 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 결합된 금 나노입자들과 타겟과의 결합 복합체; 및 B 패널, 상기 복합체의 기판에서의 고정 후 형광성 RNA 프로브와의 반응을 통한 형광 시그널 검출.
도 2는 항 HCV 항체와 HBV 항원을 GNP OLISA 방법을 이용하여 동시에 다중 측정한 그래프이다. 가로축, 항체 또는 항원의 농도; 및 세로축, Δ 형광 강도.
도 3a 및 도 3b는 각각 항 HCV 항체와 HBV 항원을 동시에 다중 측정할 때 서로 간섭 없이 특이적으로 반응한다는 것을 보여주는 그래프이다. 가로축, 항체 또는 항원의 농도; 및 세로축, Δ 형광 강도.
도 4a 및 도 4b는 각각 항 HCV 항체와 HBV 항원을 ELISA 방법으로 측정한 그래프이다. 가로축, 항체 또는 항원의 농도; 및 세로축, Δ 흡광도.
도 5a 및 도 5b는 GNP OLISA 방법을 이용하여 혈청에서 각각 항 HCV 항체와 HBV 항원을 측정한 그래프이다. 가로축, 항체 또는 항원의 농도; 및 세로축, Δ 형광 강도.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: Ag - GNP - DNA 또는 dAb - GNP - DNA 복합체 제조
20 nm의 금 나노입자(British Biocell International, Cardiff, UK)의 콜로이드 500 ml에 HCV 항원(Meridian Life Science, Memphis, TN, USA) 및 HBV 검출항체(Meridian Life Science, Memphis, TN, USA)를 각각 첨가하여 약 20분 동안 반응시킨 후 BSA(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)로 블로킹하였다. Tween-20(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) 및 포스페이트 완충액(pH 8.0)을 각각 최종 농도 0.05% 및 10 mM이 되도록 넣어준 후, 상기 입자 용액에 4 mM의 5'-티올화된 DNA 올리고뉴클레오타이드((주)올리고캠에서 합성됨)를 첨가하고 약하게 교반하며 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후, 5 M NaCl(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 15 ml을 넣어 1시간 동안 상온에서 염화(salting) 과정을 거쳤으며, 기능화된 GNP는 3% BSA 250 ml을 넣고 상온(20-25℃)에서 30분 동안 안정화시켰다. 모든 반응이 끝난 후, 정제를 위하여 18,000 g로 20분 동안 2회에 걸쳐서 원심분리시키고, 침전된 컨쥬게이트들(conjugates)을 0.1% BSA가 포함된 10 mM 포스페이트 용액에 담아 4℃에서 보관하였다.
HBV 항원 및 항-HCV IgG 군의 동시다중 측정을 위해 사용된 올리고뉴클레오타이드 및 이와 상보적인 RNA 프로브의 서열((주)바이오니아에서 합성됨)은 표 1에 기재되어 있다.
올리고뉴클레오타이드 서열 바이오마커
DNA2
F-RNA2-Q		 5'-ACTCTATGG-3'
ROX-5'-CCCAUAGAG-3'-BHQ2		 HCV Ab
DNA3
F-RNA2-Q		 5'-AGCGTTGTA-3'
Cy5-5'-CUACAACGC-3'-BHQ2		 HCV Ag
나노입자 결합된 DNA 서열 및 이의 검출에 이용되는 RNA 프로브 서열.
실시예 2: 멀티플렉스 GNP OLISA
포획 항체(HBV cAb) 또는 항-면역글로불린 항체(anti-IgG)(Abcam, Cambridge, UK)를 PBS에 희석하여 각각 1 ㎍/ml 또는 4 ㎍/ml의 농도로 블랙 96-웰 마이크로플레이트에 코팅해주었다. 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 3% BSA 용액으로 1시간 동안 블로킹해 주었다. 정량을 위해 상기 제조된 GNP 컨쥬게이트들과 항-HCV 또는 HBV 항원을 각각 농도별로 혼합하고 1시간 동안 반응시킨 후, 18,000 g에서 20분 동안 원심분리하여 침전물을 얻었다. 상기 침전물을 어세이 완충액(PBST에 녹여진 1% BSA)에 부유시켜 블로킹하고 반응이 완결된 웰 플레이트에 각각 넣어주었다. 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, RNase H 반응을 통해 증폭된 형광 신호를 아플리스칸(Appliskan; Thermoscientific, Walthan, MA, USA)을 이용하여 각각 544/589 nm 및 633/675 nm의 여기/발광 필터 세팅으로 판독하여 그 결과를 도 2에 예시하였다. 또한, 모든 과정 사이에 PBST 300 ㎕로 3회씩 플레이트를 세척해 주었다.
도 2에서 알 수 있듯이, 각 타겟은 다른 타겟에 대해 독립적으로(즉, 간섭 없이) 동시에 특이적으로 다중 측정된다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 멀티플렉스 GNP OLISA를 이용한 바이오마커 검출 시 상호간 간섭 반응 테스트(특이성 확인)
정량을 위해, 상기 제조된 GNP 컨쥬게이트들과 항-HCV 또는 HBV 항원을 각각 농도별로 혼합하는 단계를 제외한 나머지 단계는 멀티플렉스 GNP OLISA와 유사하다. 다만, 상호간 간섭이 없음을 확인하기 위해 각각 항-HCV는 HBV 항원의 부존재 하에서 농도별로 혼합하여 반응시키고(도 3a), 이와 반대로 항-HCV의 부존재 하에서 HBV 항원이 농도별로 혼합된 상태로 반응시켜(도 3b) 멀티플렉스 반응에 사용된 두 종류의 RNA 프로브가 특이적으로 항-HCV 또는 HBV 항원에 반응하는 지 여부를 확인하였다. 나머지 모든 반응과 측정 방법은 실시예 2와 동일하다.
도 3a 및 도 3b에서 알 수 있듯이, 각 타겟은 다른 타겟에 대해 독립적으로(즉, 간섭 없이) 동시에 특이적으로 다중 측정된다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 종래의 ELISA 를 이용하여 측정된 항- HCV 및 HBV 항원
4-1. 항- HCV 측정을 위한 간접적 ELISA
HCV 항원을 PBS에 희석하여 4 ㎍/ml의 농도로 100 ㎕를 블랙 96-웰 마이크로플레이트에 코팅해주었다. 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, PBS 300 ㎕로 3회에 걸쳐서 세척하고 3% BSA 용액 200 ㎕를 넣고 1시간 동안 블로킹해 주었다. PBST 300 ㎕로 3회에 걸쳐서 세척 후, 정량을 위해 항-HCV를 어세이 완충액에 농도별로 혼합하고 1시간 동안 반응시켰다. 이후, HRP-컨쥬게이션된 항-염소 IgG(Abcam, Cambridge, UK)를 0.4 ㎍/ml의 농도로 1시간 동안 추가적으로 반응시켰다. PBST 300 ㎕로 3회에 걸쳐서 세척 후 TMB 기질 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 100 ㎕를 넣고 10분 동안 반응시켰다. TMB 중단 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 100 ㎕를 추가적으로 첨가하였다. 이후, 450 nm에서의 흡광도를 96-웰 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax PlusTM, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다.
4-2. HBV 항원 측정을 위한 샌드위치 ELISA
HBV 포획항체를 PBS에 희석하여 4 ㎍/ml의 농도로 100 ㎕를 블랙 96-웰 마이크로플레이트에 코팅해주었다. 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, PBS 300 ㎕로 3회에 걸쳐서 세척하고 3% BSA 용액 200 ㎕를 넣고 1시간 동안 블로킹해 주었다. PBST 300 ㎕로 3회에 걸쳐서 세척시킨 후, 정량을 위해 HBV 항원을 어세이 완충액에 농도별로 혼합하고 1시간 동안 반응시켰다. 바이오틴이 표지된 HBV 검출항체를 1 ㎍/ml의 농도로 1시간 동안 추가적으로 반응시켰다. PBST 300 ㎕로 3회에 걸쳐서 세척시킨 후, HRP가 컨쥬게이트된 스트렙타비딘을 1 ㎍/ml의 농도로 1시간 동안 추가적으로 반응시켰다. 다시 PBST 300 ㎕로 3회에 걸쳐서 세척시킨 후, TMB 기질 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 100 ㎕를 넣고 10분 동안 반응시켰다. 이후, TMB 중단 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 100 ㎕를 추가적으로 첨가시키고 450 nm에서의 흡광도를 96-웰 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax PlusTM, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다.
도 4a 및 도 4b에서 알 수 있듯이, 각 타겟은 농도-의존적으로 흡광도가 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 5: GNP OLISA 를 이용하여 측정된 항- HCV 및 HBV 항원
5-1. 항- HCV 측정을 위한 간접적 GNP OLISA
항-염소 IgG를 PBS에 희석하여 4 ㎍/ml의 농도로 100 ㎕를 블랙 96-웰 마이크로플레이트에 코팅해주었다. 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, PBS 300 ㎕로 3회에 걸쳐서 세척하고 3% BSA 용액 200㎕를 넣고 1시간 동안 블로킹해 주었다. PBST 300 ㎕로 3회에 걸쳐서 세척시킨 후, 정량을 위해 상기 제조된 GNP 컨쥬게이트들과 항-HCV를 농도별로 혼합하고 1시간 동안 반응시키고 18,000 g에서 20분 동안 원심분리하여 침전물을 얻었다. 상기 침전물을 어세이 완충액(PBST에 녹여진 1% BSA)에 부유시켜 블로킹하고 반응이 완결된 웰 플레이트에 각각 넣어주었다. 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, RNase H 반응을 통해 증폭된 형광 신호를 아플리스칸(Appliskan; Thermoscientific, Walthan, MA, USA)을 이용하여 각각 544/589 nm의 여기/발광 필터 세팅으로 판독하여 그 결과를 도 5a에 예시하였다.
5-2. HBV 항원 측정을 위한 샌드위치 GNP OLISA
HBV 포획항체를 PBS에 희석하여 4 ㎍/ml의 농도로 100 ㎕를 블랙 96-웰 마이크로플레이트에 코팅해주었다. 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, PBS 300 ㎕로 3회에 걸쳐서 세척하고 3% BSA 용액 200㎕를 넣고 1시간 동안 블로킹해 주었다. PBST 300 ㎕로 3회에 걸쳐서 세척한 후, 정량을 위해 상기 제조된 GNP 컨쥬게이트들과 HBV 항원을 농도별로 혼합하고 1시간 동안 반응시키고 18,000 g에서 20분 동안 원심분리하여 침전물을 얻었다. 상기 침전물을 어세이 완충액(PBST에 녹여진 1% BSA)에 부유시켜 블로킹하고 반응이 완결된 웰 플레이트에 각각 넣어주었다. 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, RNase H 반응을 통해 증폭된 형광 신호를 아플리스칸(Appliskan; Thermoscientific, Walthan, MA, USA)을 이용하여 각각 633/675 nm의 여기/발광 필터 세팅으로 판독하여 그 결과를 도 5b에 예시하였다.
도 5a 및 도 5b에서 알 수 있듯이, 각 타겟은 농도-의존적으로 형광세기 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 멀티플렉스 GNP OLISA 을 이용하여 혈청 스파이킹 ( spiking ) 실험에서 얻어진 각 바이오마커(항- HCV 및 HBV 항원)의 분석
상업적으로 구매 가능한 인간 혈청에 2종 마커를 여러 가지 농도(50, 100 또는 200 ng/ml)로 섞어 놓고 상기 혈청 용액을 분석하여 실제로 인간 혈청 상에서 다중-OLISA를 수행하였다. 멀티플렉스 GNP OLISA와 동일한 방법으로 분석 정량된 각 마커들의 양을 토대로 표준 곡선을 만들고, 혈청에서 검출할 시 검출 표준 편차(%CV) 및 정확도(recovery)를 계산하여 실제 분석 시 활용 가능한 조건 내에 있음을 확인하였다(표 2).
바이오마커 항목 농도( ng / ml )
50 100 200
항-HCV
 %CV(편차) 5.025 15.493 8.360
정확도(%) 99.5 105.9 98.1
HBV 항원
 %CV 2.237 3.642 3.524
정확도(%) 108.2 106.3 96.2
혈청에서 간접적 및 샌드위치 ELISA를 이용한 멀티플렉스 GNP OLISA 스파이킹.
표 2에서 알 수 있듯이, 각 타겟은 약 2-15%의 편차와 96-108%의 정확도를 가지며, 실제 인간 혈청 내 분석 시 활용이 가능한 조건임을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Simultaneous Detection Methods of Multiple Targets in a Sample and Uses Thereof <130> K07446 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA2 <400> 1 actctatgg 9 <210> 2 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA3 <400> 2 agcgttgta 9 <210> 3 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA2 <400> 3 cccauagag 9 <210> 4 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA3 <400> 4 cuacaacgc 9

Claims (17)

  1. (i) 표적 항원에 결합하는 항체 및 첫 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드(barcode)가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합된 표적 항원 검출용인 제1 금속 나노입자; (ii) 표적 항체에 결합하는 항원 및 두 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합된 표적 항체 검출용인 제2 금속 나노입자; (iii) 상기 첫 번째 또는 두번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드에 각각 혼성화할 수 있는 2종의 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브; 및 (iv) 기판을 포함하는 시료 내 항원 및 항체의 동시 검출용 키트로서, 상기 기판은 상기 표적 항원에 결합할 수 있는 제1 검출용 항체 및 상기 표적 항체에 결합할 수 있는 제2 검출용 항체가 코팅된 것이고,
    상기 키트는,
    (a) 목적 시료(sample of interest)를 제1 금속 나노입자 및 제2 금속 나노입자와 접촉시키는 단계로, 상기 제1 금속 나노입자는 표적 항원에 결합하는 항체 및 첫 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드(barcode)가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합되어 있는 것이고 상기 제2 금속 나노입자는 표적 항체에 결합하는 항원 및 두 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합되어 있는 것인 단계;
    (a-1) 접촉 결과 얻어진 접촉물로부터 제1 및 제2 금속 나노입자를 분리하는 단계;
    (b) 상기 분리된 제1 및 제2 금속 나노입자를 상기 표적 항원에 결합할 수 있는 제1 검출용 항체 및 상기 표적 항체와 각각 결합할 수 있는 제2 검출용 항체가 코팅된 기판과 반응시키는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)의 기판에 포획된 복합체와 2종의 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브를 혼성화시키는 단계로, 상기 2종의 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브는 상기 첫 번째 또는 두 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드에 각각 혼성화하며; 및
    (d) 상기 단계 (c)의 복합체 내 제1 및 제2 금속 나노입자 위에서 혼성화되어 형성되는 2종의 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 분자를 가수분해시켜 상기 프로브-유래된 형광 시그널을 검출하는 단계를 포함하는 시료 내 항원 및 항체의 동시 검출방법에 사용하기 위한 것인 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 금속 나노입자에 결합된 항체 및 항원은 각각 바이러스에 대한 항체 및 항원인 것인 키트.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 금속 나노입자는 금, 백금, 은, 구리 또는 팔라듐 나노입자인 것인 키트.
  5. 제1항에 있어서, 상기 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브는 양 말단에 각각 형광물질(fluorophore) 및 퀀처(quencher) 분자로 표지되어 있는 것인 키트.
  6. 제1항에 있어서, 상기 2종의 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브는 서로 다른 형광을 나타내는 것인 키트.
  7. 제1항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 타액, 객담, 소변, 림프, 골수액, 타액, 우유, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수, 양막액 또는 세포 조직액을 포함하는 것인 키트.
  8. 제1항에 있어서, 상기 키트는 리보핵산 분해 효소 H(RNase H)를 추가적으로 포함하는 것인 키트.
  9. 제1항에 있어서, 상기 키트는 상기 제1 및 제2 금속 나노입자에 결합된 항체 및 항원과 다른 항체 또는 항원 및 세 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합된 금속 나노입자 및 상기 세 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드에 상보적인 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브를 추가적으로 포함하는 경우 3개의 서로 다른 항원 및 항체들을 동시에 동정할 수 있는 것인 키트.
  10. 다음의 단계를 포함하는 시료 내 항원 및 항체의 동시 검출방법:
    (a) 목적 시료(sample of interest)를 제1 금속 나노입자 및 제2 금속 나노입자와 접촉시키는 단계로, 상기 제1 금속 나노입자는 표적 항원에 결합하는 항체 및 첫 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드(barcode)가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합되어 있는 것이고 상기 제2 금속 나노입자는 표적 항체에 결합하는 항원 및 두 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합되어 있는 것인 단계;
    (a-1) 접촉 결과 얻어진 접촉물로부터 제1 및 제2 금속 나노입자를 분리하는 단계;
    (b) 상기 분리된 제1 및 제2 금속 나노입자를 상기 표적 항원에 결합할 수 있는 제1 검출용 항체 및 상기 표적 항체와 각각 결합할 수 있는 제2 검출용 항체가 코팅된 기판과 반응시키는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)의 기판에 포획된 복합체와 2종의 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브를 혼성화시키는 단계로, 상기 2종의 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브는 상기 첫 번째 또는 두 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드에 각각 혼성화하며; 및
    (d) 상기 단계 (c)의 복합체 내 제1 및 제2 금속 나노입자 위에서 혼성화되어 형성되는 2종의 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 분자를 가수분해시켜 상기 프로브-유래된 형광 시그널을 검출하는 단계.
  11. 삭제
  12. 제10항에 있어서, 상기 기판은 마이크로웰 플레이트인 것인 동시 검출방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 (d)단계는 상기 첫 번째 또는 두 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드와 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브 간에 형성된 2종의 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 분자를 상기 금속 나노입자로부터 해리시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 동시 검출방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 해리는 환원제의 처리를 통해 이루어지는 것인 동시 검출방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 동시 검출방법은 상기 금속 나노입자에 결합된 항체 및 항원과 다른 항체 또는 항원 및 세 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드가 서로 독립적으로 표면 영역에 결합된 금속 나노입자 및 상기 세 번째 검출성 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 바코드에 상보적인 형광성 올리고뉴클레오타이드 프로브를 추가적으로 포함하는 경우 3개의 서로 다른 항원 및 항체들을 동시에 동정할 수 있는 것인 동시 검출방법.
  16. 제10항에 있어서, 상기 표적은 바이러스를 포함하는 것인 동시 검출방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 바이러스는 간염 바이러스인 것인 동시 검출방법.
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