CN108362876B - 一种检测克罗诺杆菌的免疫磁珠层析试纸条及快速检测方法 - Google Patents

一种检测克罗诺杆菌的免疫磁珠层析试纸条及快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测克罗诺杆菌基因的免疫磁珠层析试纸条。试纸条的硝酸纤维膜上设有检测T线和对照C线，检测T线由100μM的长度20 bp的捕获探针、5 mg/mL链霉亲和素和50mM的磷酸盐缓冲液按体积比1∶1∶6混匀的捕获探针溶液制成；对照C线由抗牛血清白蛋白抗体溶液和磷酸缓冲液混匀的浓度1～5 mg/mL的标准溶液制成。用于检测奶粉中是否存在克罗诺杆菌时，将被测奶粉通过细菌DNA提取、聚合酶链反应、PCR产物与免疫磁珠结合制得被检测液；将被检测液滴加于免疫磁珠层析试纸条的样品垫上，室温反应10 min，即可观察结果。若检测T线和对照C线均显示黄色线条，表示被检测液为阳性；若对照C线显示黄色，表示被检测液为阴性。对实际样品的检测反应时间缩短至8‑11 h。

Description

一种检测克罗诺杆菌的免疫磁珠层析试纸条及快速检测方法
技术领域
本发明属于克罗诺杆菌基因检测技术领域，具体涉及快速检测克罗诺杆菌基因的免疫磁珠层析试纸条及其制备方法。
背景技术
克罗诺杆菌（又称阪崎肠杆菌）是肠杆菌科的一种，能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡率高达50% 以上。克罗诺杆菌已引起世界多国相关部门的重视。据报道，国外乳业巨头曾因此被召回产品。在美国FDA2002年在本土某一些国际乳业巨头生产的婴儿配方奶粉中检出克罗诺杆菌后，2003年又一家国际乳业巨头公司主动召回在美国生产的一批检出极微量克罗诺杆菌的罐装早产儿特殊配方奶粉，克罗诺杆菌从此成为世界瞩目的焦点。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）原理凭借敏感、特异、快速的特点荣获1993年诺贝尔化学奖。因其在病原体检测方面的独特优势，因而发达国家在相关方法和仪器方面的研发非常快，成为分子生物学诊断的主流，至今仍处于学术和应用前沿。酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay，简称为ELISA）和胶体金免疫层析法（Colloidal Gold Irnmuno-Chromatography Assay，简称为GICA）由于其廉价，特异，灵敏和快速等特点，被广泛地使用于致病菌的快速检测中。但ELISA试剂需要专用的实验室和专业人员进行检验，操作复杂，时间较长；胶体金类试剂操作简便、快速、适于现场检测，但灵敏度稍低，结果用肉眼直接观察，会产生误差，亦不能记录。
纳米免疫磁珠是含有铁元素的超顺磁纳米颗粒，外面包覆着聚乙烯类高分子物质，并可带有羧基或氨基，用于和蛋白质分子交联。免疫磁珠在细胞和大分子分离、纯化及诊断上都已得到应用。免疫试纸条是一种制作简便、操作简单并且适宜于现场快速检测的技术，一般主要有两种方法：夹心法和竞争法，前者一般适用于检测大分子物质，后者适于检测小分子物质。试纸条上喷有检测线和质控线。夹心法是指当有目标物存在时，目标物流经试纸条上两条线时，会被捕获在检测线上，两条线都出现表示为阳性，只有质控线即为阴性。而竞争法是指有目标物存在时，检测线则不显线，即为阳性，只会出现质控线，两条线都出现表示为阴性。
发明内容
为了实现快速、灵敏、简便地检测出婴幼儿乳粉中的克罗诺杆菌，本发明提供一种检测克罗诺杆菌基因的免疫磁珠层析试纸条，同时提供一种奶粉中克罗诺杆菌的快速检测方法。
一种检测克罗诺杆菌基因的免疫磁珠层析试纸条包括衬板，衬板上依次衔接设有的样品垫、硝酸纤维膜和吸水垫，所述硝酸纤维膜上设有隐形的检测T线和对照C线；
所述检测T线由100 μM的长度20 bp的捕获探针、5 mg/mL链霉亲和素和50 mM的磷酸盐缓冲液以体积比1∶1∶6混匀的捕获探针溶液制成，所述捕获探针的DNA序列为：5'-Biotin-GGCGGAGCCGAATAACTGGG-3'；
所述对照C线由抗牛血清白蛋白抗体溶液和磷酸缓冲液混匀的浓度1～5 mg/mL的标准溶液制成。
用上述的免疫磁珠层析试纸条快速检测奶粉中克罗诺杆菌的操作步骤如下：
（1）提取奶粉中的DNA
（1.1）奶粉均质液的制备
将奶粉按照1:9的比例稀释，得到奶粉均质液；增菌培养，获得奶粉均质液；
（1.2）奶粉均质液的裂解
将奶粉均质液离心分离，取沉淀物，加入细菌裂解液，震荡裂解沉淀物，得到奶粉均质液的裂解物；
（1.3）磁性纳米粒子吸附
向奶粉均质液的裂解物中加入溶有磁性纳米粒子的吸附缓冲液，吸附奶粉均质液的裂解物中的DNA，磁性分离去上清，得到吸附DNA的磁性纳米粒子；
（1.4）杂质的去除
用70%的乙醇溶液洗涤吸附DNA的磁性纳米粒子两次，去除蛋白质等杂质，得到洗涤物；
（1.5）DNA的溶解
将洗涤物用洗脱液溶解，涡旋混匀，磁性分离取上清，即得奶粉的细菌DNA溶液；
（2）聚合酶链反应（PCR）
利用已合成好的分别修饰了生物素的上游引物和FITC的下游引物，以及奶粉的细菌DNA溶液进行聚合酶链反应（PCR），得到聚合酶链产物（PCR产物）；
所述上游引物：5'-Biotin-CGTGCCCTGCATGAGAAAA-3'
所述下游引物：5'-GGCGGAGCCGAATAACTG-3'；
（3）电泳确证聚合酶链产物
将CR产物进行琼脂糖电泳确证PCR扩增，若电泳图上出现条带，根据电泳图中的条带对比Marker得出PCR产物长度，与所查得目的片段为673 bp碱基数对比，若两者碱基数完全一致则表示PCR过程成功，可用于免疫试纸条检测；若两者碱基数不一致，则需优化PCR参数直到对比结果一致；若电泳图上没有出现条带，则表示奶粉中不含有所需检测的克罗诺杆菌；
（4）PCR产物与免疫磁珠结合
将PCR产物和免疫磁珠按体积比1∶4混合反应30 min，由于PCR产物一端含有生物素，反应30 min，使免疫磁珠上的链霉亲和素与PCR产物中的生物素充分结合；磁性分离去上清，用50 μL 0.15 M的氯化钠溶液清洗三次，用上样液重悬至所需体积50-200 μL，得到被检测液；
所述免疫磁珠由5-20 μL 5 mg/mL的链霉亲和素与100 μL 25-50 mg/mL的带羧基的纳米磁珠偶联制备；
（5）免疫磁珠层析试纸条的快速检测
将被检测液滴加于免疫磁珠层析试纸条的样品垫上，被检测液在毛细管作用下从试纸条上流过，室温反应10 min，即可观察结果；
若被检测液中存在克罗诺杆菌基因，则被检测液中的磁标偶联物会直接泳动到检测T线和硝酸纤维膜上的链霉亲和素发生反应，从而使磁珠颗粒发生聚集，形成黄色的线条；其他未结合的磁标偶联物继续通过毛细管作用向前泳动，与对照C线上的BSA抗体发生第二次反应，同样形成黄色线条，这样NC膜上就会出现两条黄色线条，表示被检测液为阳性，其颜色强弱取决于被检测液中目标物含量的多少；最后通过测定检测T线上捕获磁珠的含量实现判断出被奶粉中克罗诺杆菌的菌落数；
若被检测液中不存在克罗诺杆菌基因，则被检测液中的磁标偶联物直接泳动到对照C线处，检测T线处就不会发生磁珠颗粒的聚集，即不会出现黄色的线条；对照C线是为检验磁标免疫层析方法本身是否有效而设定的，所以无论样品中是否存在目标物，对照C线都应该显黄色；这样NC膜上就会出现一条黄色线条，表示被检测液为阴性；如果对照C线不显现出黄色，则说明试纸条失效。
进一步限定的技术方案如下：
步骤（1.1）中，增菌培养条件：温度44℃、时间6-8 h。
步骤（1.2）中，取1 mL奶粉均质液于1.5 mL EP管中，8500 转/min，离心5 min，去上清，沉淀物溶于1 mL细菌裂解液中，震荡反应15 s，65 ℃水浴10 min；
所述细菌裂解液由50 μL 1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris-HCl）、20μL 0.5M乙二胺四乙酸（EDTA）、65 μL 15%的十二烷基硫酸钠（SDS）、30 μL 20mg/mL蛋白酶K和835μL双蒸水制成。
步骤（1.3）中，将10 μL磁性纳米粒子和500 μL 的吸附缓冲液混匀，振荡反应10min；所述吸附缓冲液由11.7 g氯化钠（NaCl）和30 g 聚乙二醇20000（PEG20000）溶于100mL双蒸水中混合均匀制成。
步骤（1.5）中，向洗涤物中加入100 μL TE洗脱液，涡旋混匀，于65 ℃水浴10 min，磁性分离取上清，所述TE洗脱液由1 mL 1M pH值8.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris-HCl）、0.2 mL 0.5 M pH值8.0的乙二胺四乙酸（EDTA）和98.8 mL的双蒸水混合均匀制成。
步骤（2）中，PCR体系：2.5 μL 25mM MgCl2，2.5 μL 10×PCR Buffer，2 μL 2.5mMdNTPs，0.5 μL 5U/μL 的Taq DNA聚合酶，2 μL（1）中的DNA模板，分别取1 μL 1-10 μM上游引物和1 μL 1-10 μM下游引物，加灭菌水至总体积为25 μL；
扩增程序为：95 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性30 s，61 ℃退火45 s，72℃延伸30s，30或35个循环；72 ℃再延伸2 min；12 ℃保存。
步骤（3）中，取5 μL PCR产物，用2％琼脂糖凝胶电泳进行分析，采用前染，即在溶胶前期加入4S Red Plus Nucleic Acid Stain水溶液，电压为120-180 V，时间T为20-40min，进行电泳，确证PCR扩增。
步骤（4）中，免疫磁珠的制备：吸取100 μL浓度25-50 mg/mL的钠米磁珠，16 μL浓度10 mg/mL的碳化二亚胺水溶液和10 μL浓度10mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺水溶液于1.5 mL离心管中，涡旋混合，于室温低速搅拌孵育反应15 min，磁性分离去上清，再用双蒸水或磷酸盐缓冲液清洗磁珠两次，重悬至80-100 μL；再缓慢滴加入浓度0.5-2.0 mg/mL的链霉亲和素，低速搅拌孵育反应3 h，加入等体积的质量浓度10%的牛血清白蛋白，持续反应1 h；以饱和游离的磁珠，磁性分离去上清，然后再用双蒸水或磷酸缓冲液清洗磁珠去除未结合的蛋白质，将磁珠转移至新管，弃去上清液，用水重悬，放4 ℃冰箱存放备用；用时则定量加入到PCR产物中，滴加于试纸条的样品垫上。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
（1）本发明免去了磁珠结合垫的制作这一较繁琐的一步，为实验节省了时间，同时，对于试纸条的制作也方便了很多。利用免疫磁珠标记一种物质，在试纸条的硝酸纤维膜上喷上链霉亲和素与牛血清白蛋白抗体。当在样品垫上滴入待测样品溶液后，样品溶液沿着试纸条通过毛细管作用泳动，和胶体金试纸类相比，免疫磁珠检测试纸最大的不同在于将标记胶体金改为标记磁珠，免除了制备磁珠结合垫这一步，同时将生物素标记的免疫磁珠加入PCR产物后磁性分离，避免了PCR体系中一些其他杂质对结果的干扰，这样可使得结果判定更为精确、灵敏和客观，且利用纳米免疫磁珠研制克罗诺杆菌基因的快速检测诊断试纸条尚无报道。
（2）本发明利用免疫磁珠的磁性很好的特点，避免了PCR过程中一些杂质的干扰，减少了跑试纸条过程的非特异性结合造成的假阳现象，简化了试纸条的优化过程。同时，本发明免疫磁珠的制备方法与普通的方法相比较，所需材料试剂较少，过程较简便，大大缩短了反应时间，其他方法的反应时间为1-2天，本发明方法的对实验样品的反应时间缩短至4-5h，对实际样品的检测反应时间缩短至8-11 h。最重要的是所制得的磁珠偶联物分散性较好，粒径较均一，为后续免疫试纸条的检测提供了方便。
（3）利用解链后的PCR产物与试纸条的检测T线上的捕获探针发生杂交反应，提高了检测效率。由于碱基互补配对的高效性，可使试纸条的检测效率达到接近100%，这与一般的检测方法的70-80%的检测效率相比提高了很多。
（4）本发明与一般的胶体金免疫试纸条相比，检测限可提高100-1000倍，达到102-103CFU/mL，可更准确地检测出婴幼儿乳粉中克罗诺杆菌，且重复性很高。
附图说明
图1为免疫磁珠的粒径图。
图2为免疫磁珠的电位图。
图3为免疫磁珠试纸条结构示意图。
图4为图3的俯视图。
具体实施方式
下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步地描述。
以下实施例所用原材料及实验仪器的来源说明如下：
实验所用奶粉购于超市；
实验所用试纸条底板、样品垫、吸水垫和硝酸纤维膜均购于上海捷宁生物科技有限公司；
实验所用牛血清白蛋白抗体（BSA抗体）购于北京索莱宝科技有限公司；
实验所用捕获探针、引物、PCR原料、链霉亲和素、蛋白酶K均购于上海生工生物科技有限公司；
实验所用的盐酸（HCl）、氢氧化钠（NaCl）、无水乙醇、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、聚乙二醇20000（PEG20000）、十二烷基硫酸钠（SDS）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、异硫氰酸荧光素（FITC）、4S Red Plus NucleicAcid Stain、Marker化学试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。
实验所用的PCR仪购于美国伯乐公司；
实验所用的电泳仪购于北京六一生物科技有限公司；
实验所用的喷膜仪购于美国Biodot公司；
实验所用的凝胶成像仪购于杭州朗基科学仪器有限公司。
实施例1
克罗诺杆菌人工污染奶粉样品中的快速检测方法
1. 制备检测克罗诺杆菌基因的免疫磁珠层析试纸条
参见图3和图4，免疫层析试纸条由底板和在底板上依次衔接的样品垫、硝酸纤维膜、吸水垫组成，在硝酸纤维膜上有用捕获探针印制的直线式隐形检测线T线，用抗牛血清白蛋白抗体溶液印制的直线式隐形对照线C线。
（1）所述检测T线由2.5 μL浓度为100 μM的长度为10 bp、20 bp、30 bp和40 bp的捕获探针溶液制成，捕获探针序列如下：
10bp:5'-Biotin-GGCGGAGCCG-3'
20bp:5'-Biotin-GGCGGAGCCGAATAACTGGG-3'
30bp:5'-Biotin-ATGACGTGACCGGCCAGTATTTCATGCACC-3'
40bp:5'-Biotin-GGCGGAGCCGAATAACTGGGAATCGATTTTCAGCGGCTCG-3'
已经修饰好生物素的100 μM的捕获探针与5 mg/mL的链霉亲和素和50 mM的磷酸盐缓冲液以体积比1∶1∶6混匀后振荡反应3 h，所得的溶液用于喷制试纸条的检测T线。
（2）所述对照C线为牛血清白蛋白抗体溶液配制成的标准溶液制成。将购买的的浓度为6 mg/mL的牛血清白蛋白抗体溶液用磷酸缓冲液稀释成所需喷制对照C线的浓度，即1-5 mg/mL印制于试纸条的C线上。
（3）试纸条NC膜的制备：用喷膜仪分别将按上述方法准备好的检测T线溶液和对照C线溶液喷制在NC膜上，37 ℃烘箱干燥10 min。
（4）检测试纸条的制作：将样品垫、已制好的1.3中的NC膜和吸水垫依次衔接在衬板上，重叠部分多出2 mm以便于样品流动，组成克罗诺杆菌免疫磁珠层析检测试纸条。
2. 制备被测物
（1）奶粉中克罗诺杆菌基因组DNA的提取
（1.1）人工污染奶粉均质液的制备
取1 g奶粉（运用国家标准检测方法，该奶粉克罗诺杆菌为阴性）溶解于9 mL水中，制得奶液；
（1.2）人工污染克罗诺杆菌奶粉样品的制备
分别将克罗诺杆菌菌液用已配制的均质液稀释至108～101 CFU/mL，制得了含有108～101 CFU/mL克罗诺杆菌的均质液；
（1.3）奶粉中克罗诺杆菌的裂解
分别吸取含108～101 CFU/mL克罗诺杆菌的均质液1 mL于1.5 mL EP管中，8500转/分钟 离心5 min，去上清，沉淀溶于1 mL细菌裂解液中，震荡反应15 s，65 ℃水浴10min，制得裂解物；
所述细菌裂解液由50 μL 1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris-HCl）、20 μL 0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）、65 μL 15%的十二烷基硫酸钠（SDS）、30 μL 20mg/mL蛋白酶K和835μL双蒸水制成；
（1.4）磁性纳米粒子吸附克罗诺杆菌的DNA
加入10 μL 25mg/mL磁性纳米粒子和500 μL的吸附缓冲液，混匀，振荡反应10min。得到吸附有DNA的磁性纳米粒子；
所述吸附缓冲液由11.7 g 氯化钠（NaCl）和30 g 聚乙二醇20000（PEG20000）溶于100 mL双蒸水中混合均匀制成；
（1.5）杂质的去除
磁性分离去上清，用500 μL 70%的乙醇溶液洗涤沉淀两次，置于37 ℃恒温箱中，使乙醇完全挥发，得到洗涤物；
（1.6）克罗诺杆菌DNA的溶解
再向其中加入100 μL TE洗脱液，涡旋混匀后，于65 ℃水浴10 min，磁性分离取上清，得到奶粉中克罗诺杆菌的DNA溶液。
所述TE洗脱液为由1 mL 1M pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris-HCl）和0.2 mL 0.5 M pH值为8.0的乙二胺四乙酸（EDTA）和98.8 mL的双蒸水制成的溶液。
（2）PCR：利用已合成好的修饰了生物素的上游引物和无修饰的下游引物，以及（1）中已制得的奶粉中克罗诺杆菌的DNA溶液进行PCR。
实验所需的引物序列：
上游引物：5'-Biotin-CGTGCCCTGCATGAGAAAA-3'
下游引物：5'-GGCGGAGCCGAATAACTG-3'
PCR体系：2.5 μL 25mM MgCl2，2.5 μL 10×PCR Buffer，2 μL 2.5mM dNTPs，0.5μL 5 U/μL 的Taq DNA聚合酶，2 μL（1）中的DNA模板，分别取1 μL 1-10μM上游引物和1 μL1-10 μM下游引物，加灭菌水至总体积为25 μL。
扩增程序为：95 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性30 s，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸30s，30或35个循环；72 ℃再延伸2 min；12 ℃保存，得PCR产物，即为含有一端修饰了生物素的双链DNA的溶液，可与修饰了链霉亲和素的磁珠特异性结合用于免疫层析检测。
（3） 琼脂糖凝胶电泳确证PCR扩增产物
取5 μL PCR产物，用2％琼脂糖凝胶电泳进行分析，采用前染，即在溶胶前期加入4S Red Plus Nucleic Acid Stain水溶液，电压为120-180 V之间，时间T为20-40 min，进行电泳，确证PCR扩增。根据电泳图中的条带对比Marker得出PCR产物长度，与所查得目的片段的碱基数（673 bp）对比，若两者碱基数完全一致则表示PCR过程成功，可用于免疫试纸条检测。若两者碱基数不一致，则需优化PCR参数直到对比结果一致。若是电泳图上没有出现条带，则表示奶粉中不含有所需检测的克罗诺杆菌。
（4） PCR产物与免疫磁珠的结合：将已扩增成功的PCR产物与2.4中制得的5 mg/mL含有SAV的免疫磁珠按体积比1∶4的比例混合反应30 min，由于PCR产物一端含有Biotin，反应30 min后，磁珠上的SAV与PCR产物中的Biotin充分结合，再磁性分离去上清，用50 μL0.15 M的NaCl溶液清洗三次，用上样液重悬至所需体积50-200 μL。
所述免疫磁珠由0.5-2.0 mg/mL的链霉亲和素与5 mg/mL的带羧基的纳米磁珠偶联制备；
所述免疫磁珠的制备：吸取100 μL 25-50 mg/mL的钠米磁珠，16 μL 10 mg/mL新鲜配置的碳化二亚胺水溶液和10 μL 10 mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺水溶液于1.5 mL离心管中，涡旋混合后于室温低速搅拌孵育反应15 min，磁性分离去上清，再用双蒸水或PB缓冲液清洗磁珠两次，重悬至80-100 μL，随后缓慢滴加入0.5-2.0 mg/mL的链霉亲和素于磁珠悬液中低速搅拌孵育反应3 h，再加入等体积的质量浓度为10%的牛血清白蛋白，持续反应1h，以饱和游离的磁珠；磁性分离去上清，然后再用双蒸水或磷酸缓冲液清洗磁珠去除未结合的蛋白质，将磁珠转移至新管，弃去上清液，用水重悬，放4 ℃冰箱存放备用；用时则定量加入到PCR产物中，滴加于试纸条的样品垫上。
所述免疫磁珠的偶联效果见图1和图2，磁性纳米粒子和链霉亲和素偶联物与单一的磁性纳米粒子相比，粒径变大，而电位变小，则表示磁性纳米粒子和链霉亲和素偶联成功，这是因为磁性纳米粒子本身带负电，而链霉亲和素也带负电，二者相结合后，仍然带负电，所以电位变小；磁性纳米粒子与链霉亲和素和被检测物三者的偶联物与磁性纳米粒子和链霉亲和素二者的偶联物相比较，粒径继续变大，电位也变大但不会大于磁性纳米粒子，则表示偶联成功。在此，只要三者相比较，电位发生了变化即表示偶联成功。
3.免疫磁珠层析试纸条的快速检测
将被检测液滴加于免疫磁珠层析试纸条的样品垫上，被检测液在毛细管作用下从试纸条上流过，室温反应10 min后，即可观察结果。
若被检测液中存在克罗诺杆菌基因，则磁标偶联物会直接泳动到检测T线和硝酸纤维膜上的链霉亲和素发生反应，从而使磁珠颗粒发生聚集，形成黄色的线条，然后其他未结合的磁标偶联物继续通过毛细管作用向前泳动，与对照C线上的牛血清白蛋白抗体发生第二次反应，同样形成黄色线条，这样NC膜上就会有两条黄色线条，表示样品为阳性，其颜色强弱取决于待测样品溶液中目标物含量的多少。最后通过测定检测T线上捕获磁珠的含量实现判断出被奶粉中克罗诺杆菌的菌落数。
若被检测液中不存在克罗诺杆菌基因，则磁标偶联物直接泳动到对照C线处，检测T线处就不会发生磁珠颗粒的聚集，即不会出现黄色的线条。对照C线是为检验磁标免疫层析方法本身是否有效而设定的，所以无论样品中是否存在目标物，对照C线都应该显黄色。如果对照C线不显现出黄色，则说明试纸条失效。
实施例2
实际婴幼儿奶粉样品中克罗诺杆菌的快速检测方法
1. 制备检测克罗诺杆菌基因的免疫磁珠层析试纸条
参见图3和图4，免疫磁珠层析试纸条由底板和在底板上依次衔接的样品垫、硝酸纤维膜、吸水垫组成，在硝酸纤维膜上有用捕获探针印制的直线式隐形的检测T线，用抗牛血清白蛋白抗体溶液印制的直线式隐形的对照C线。
（1）检测T线由2.5 μL100 μM的长度20bp的捕获探针、2.5 μL 5 mg/mL链霉亲和素和15 μL 50 mM的磷酸盐缓冲液（体积比1∶1∶6）混匀振荡反应3 h，制得捕获探针溶液，所述捕获探针的DNA序列为：5'-Biotin-GGCGGAGCCGAATAACTGGG-3'。
（2）对照C线由浓度6 mg/mL的牛血清白蛋白抗体溶液和磷酸缓冲液混匀，得到浓度1-5 mg/mL的标准溶液制成。
（3）试纸条硝酸纤维膜的制备：用喷膜仪分别将上述捕获探针溶液和标准溶液喷制在硝酸纤维膜上，37 ℃烘箱干燥10 min。
（4）检测试纸条的制作：将样品垫、NC膜和吸水垫依次衔接在衬板上，重叠部分多出2 mm以便于样品流动，制成检测克罗诺杆菌基因的免疫磁珠层析试纸条。
2. 制备检测被测物
（1）婴幼儿奶粉中细菌基因组DNA的提取
1.1）婴幼儿奶粉均质液制备及增菌
取100 g婴幼儿奶粉溶于900 mL的无菌水中，得到奶粉均质液，44℃培养6 h，得到奶粉均质液；
1.2）奶粉增菌液的裂解
取1 mL奶粉均质液于1.5 mL EP管中，8500转/min，离心5 min，去上清，沉淀物溶于1 mL细菌裂解液中，震荡反应15 s，65 ℃水浴10 min；
所述细菌裂解液由50 μL 1 M 三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris-HCl）、20 μL 0.5M乙二胺四乙酸（EDTA）、65 μL 15%的十二烷基硫酸钠（SDS）、30 μL 20mg/mL蛋白酶K和835 μL双蒸水制成；
1.3）磁性纳米粒子吸附DNA
将10 μL磁性纳米粒子和500 μL 的吸附缓冲液混匀后一起全部加入奶液裂解物中，振荡反应10 min；吸附奶液裂解物中DNA，磁性分离去上清，得到吸附DNA的磁性纳米粒子；
所述吸附缓冲液由11.7 g 氯化钠（NaCl）和30g 聚乙二醇20000（PEG20000）溶于100 mL双蒸水中混合均匀制成；
1.4）洗涤沉淀去杂质
用70%的乙醇溶液洗涤吸附DNA的磁性纳米粒子两次，去除蛋白质等杂质，得到洗涤物；
1.5）溶解DNA
向洗涤物中加入100 μL TE洗脱液，涡旋混匀，于65 ℃水浴10 min，磁性分离取上清，即得奶粉的细菌DNA溶液。TE洗脱液由1 mL 1 M pH值8.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris-HCl）、0.2 mL 0.5 M pH值8.0的乙二胺四乙酸（EDTA）和98.8 mL的双蒸水混合均匀制成。
（2） PCR：利用已合成好的分别修饰了生物素的上游引物和FITC的下游引物，以及奶粉的细菌DNA溶液进行聚合酶链反应（PCR），得到PCR产物；
所述上游引物：5'-Biotin-CGTGCCCTGCATGAGAAAA-3'
所述下游引物：5'-GGCGGAGCCGAATAACTG-3'；
PCR体系：2.5 μL 25 mM MgCl2，2.5 μL 10×PCR Buffer，2 μL 2.5 mM dNTPs，0.5 μL 5 U/μL 的Taq DNA聚合酶，2μL（1）中的DNA模板，分别取1 μL 1-10 μM上游引物和1μL 1-10 μM下游引物，加灭菌水至总体积为25 μL；
扩增条件为：95 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性30 s，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸30s，30或35个循环；72 ℃再延伸2 min；12 ℃保存。
（3）电泳确证聚合酶链产物
取5 μL PCR产物，用2％琼脂糖凝胶电泳进行分析，采用前染，即在溶胶前期加入4S Red Plus Nucleic Acid Stain水溶液，电压为120-180 V，时间T为20-40 min，进行电泳，确证PCR扩增。
若电泳图上出现条带，根据电泳图中的条带对比Marker得出PCR产物长度，与所查得目的片段为673 bp碱基数对比，若两者碱基数完全一致则表示PCR过程成功，可用于免疫试纸条检测；若两者碱基数不一致，则需优化PCR参数直到对比结果一致。若是电泳图上没有出现条带，则表示奶粉中不含有所需检测的克罗诺杆菌。
（4）PCR产物与免疫磁珠结合
将PCR产物和免疫磁珠按体积比1∶4混合反应30 min，由于PCR产物一端含有生物素，反应30 min，使免疫磁珠上的链霉亲和素与PCR产物中的生物素充分结合，再磁性分离去上清，用50 μL 0.15 M的NaCl溶液清洗三次，用上样液重悬至所需体积50-200 μL，得到被检测液；
所述免疫磁珠由5-20 μL 5 mg/mL的链霉亲和素与100 μL 25-50 mg/mL的带羧基的纳米磁珠偶联制备；
免疫磁珠的制备：
1）吸取100 μL 25-50 mg/mL的钠米磁珠，16 μL 10 mg/mL的碳化二亚胺水溶液和10 μL 10 mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺水溶液于1.5 mL离心管中，涡旋混合，于室温低速搅拌孵育反应15 min，磁性分离去上清，再用双蒸水或磷酸盐缓冲液清洗磁珠两次，除去多余的碳化二亚胺水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺水溶液，再重悬至80-100 μL，得到100 μL 25-50mg/mL带有羧基的纳米磁珠溶液；
2）向1）中缓慢滴加入浓度5-20 μL 5 mg/mL的链霉亲和素，低速搅拌孵育反应3h，得到0.5-2 mg/mL偶联有链霉亲和素的磁珠及游离的带羧基的磁珠组成的溶液；
3）再向2）中加入等体积的质量浓度10%的牛血清白蛋白，持续反应1 h，以饱和游离的磁珠；
4）磁性分离去上清，然后再用双蒸水或磷酸缓冲液清洗磁珠去除未结合的蛋白质；将磁珠转移至新管，弃去上清液，用水重悬，得到仅含有0.5-2 mg/mL偶联有链霉亲和素的磁珠溶液，放4 ℃冰箱存放备用；用时则定量加入到PCR产物中，滴加于试纸条的样品垫上；
（5）免疫磁珠层析试纸条的快速检测
将被检测液滴加于免疫磁珠层析试纸条的样品垫上，被检测液在毛细管作用下从试纸条上流过，室温反应10 min后，即可观察结果。
若被检测液中存在克罗诺杆菌基因，则磁标偶联物会直接泳动到检测T线和硝酸纤维膜上的链霉亲和素发生反应，从而使磁珠颗粒发生聚集，形成黄色的线条，然后其他未结合的磁标偶联物继续通过毛细管作用向前泳动，与对照C线上的牛血清白蛋白抗体发生第二次反应，同样形成黄色线条，这样NC膜上就会有两条黄色线条，表示被检测液为阳性，其颜色强弱取决于被检测液中目标物含量的多少。最后通过测定检测T线上捕获磁珠的含量实现判断出被奶粉中克罗诺杆菌的菌落数。
若被检测液中不存在克罗诺杆菌基因，则磁标偶联物直接泳动到对照C线处，检测T线处就不会发生磁珠颗粒的聚集，即不会出现黄色的线条。对照C线是为检验磁标免疫层析方法本身是否有效而设定的，所以无论被检测液中是否存在目标物，对照C线都应该显黄色。这样NC膜上就会有一条黄色线条，表示被检测液为阴性。如果对照C线不显现出黄色，则说明试纸条失效。

Claims (8)

1.一种用免疫磁珠层析试纸条快速检测奶粉中克罗诺杆菌的方法，包括衬板，衬板上依次衔接设有的样品垫、硝酸纤维膜和吸水垫，所述硝酸纤维膜上设有隐形的检测T线和对照C线，其特征在于：
所述检测T线由100 μM的长度20 bp的捕获探针、5 mg/mL链霉亲和素和50 mM的磷酸盐缓冲液按体积比1∶1∶6混匀的捕获探针溶液制成，所述捕获探针的DNA序列为：5'-Biotin-GGCGGAGCCGAATAACTGGG-3'；
所述对照C线由抗牛血清白蛋白抗体溶液和磷酸缓冲液混匀的浓度1～5 mg/mL的标准溶液制成；
用所述的免疫磁珠层析试纸条快速检测奶粉中克罗诺杆菌的操作步骤如下：
（1）提取奶粉中的DNA
（1.1）奶粉均质液的制备
将奶粉按照1:9比例进行稀释，得到奶粉均质液；增菌培养，获得奶粉均质液；
（1.2）奶粉均质液的裂解
将奶粉均质液离心分离，取沉淀物，加入细菌裂解液，震荡裂解沉淀物，得到奶粉均质液的裂解物；
（1.3）磁性纳米粒子吸附
向奶粉均质液的裂解物中加入溶有磁性纳米粒子的吸附缓冲液，吸附均质液的裂解物中DNA，磁性分离去上清，得到吸附DNA的磁性纳米粒子；
（1.4）洗涤去杂
用70%的乙醇溶液洗涤吸附DNA的磁性纳米粒子两次，去除蛋白质杂质，得到洗涤物；
（1.5）溶解DNA
将洗涤物用洗脱液溶解，涡旋混匀，磁性分离取上清，即得奶粉的细菌DNA溶液；
（2）聚合酶链反应
利用已合成好的分别修饰了生物素的上游引物和FITC的下游引物，以及奶粉的细菌DNA溶液进行聚合酶链反应，得到聚合酶链产物；
所述上游引物：5'-Biotin-CGTGCCCTGCATGAGAAAA-3'
所述下游引物：5'-GGCGGAGCCGAATAACTG-3’；
（3）电泳确证聚合酶链产物
将聚合酶链产物进行琼脂糖电泳确证PCR扩增，若电泳图上出现条带，根据电泳图中的条带对比Marker得出PCR产物长度，与所查得目的片段为673 bp扩增片段，若两者碱基数完全一致则表示PCR过程成功，可用于免疫试纸条检测；若两者碱基数不一致，则需优化PCR参数直到对比结果一致；若电泳图上没有出现条带，则表示奶粉中不含有所需检测的克罗诺杆菌；
（4）PCR产物与免疫磁珠结合
将聚合酶链产物和免疫磁珠按体积比1∶4混合反应30 min，由于PCR产物一端含有生物素，反应30 min，使免疫磁珠上的链霉亲和素与聚合酶链产物产物中的生物素充分结合；磁性分离去上清，用50 μL 0.15 M的氯化钠溶液清洗三次，用上样液重悬至所需体积50-200μL，得到被检测液；在均相液相中进行功能化磁珠与扩增产物的结合，可以保证反应的效率，避免了在试纸条固相界面反应不充分的弊端；利用磁性纳米粒子的性能可以实现方便分离纯化，无需在侧向层析试纸条特意设计结合垫，节省了检测成本和简化了试纸条检测制备工艺；
所述免疫磁珠由5-20 μL 5 mg/mL的链霉亲和素与100 μL 25-50 mg/mL的带羧基的纳米磁珠偶联制备；
（5）免疫磁珠层析试纸条的快速检测
将被检测液滴加于免疫磁珠层析试纸条的样品垫上，被检测液在毛细管作用下从试纸条上流过，室温反应10 min，即可观察结果；
若被检测液中存在克罗诺杆菌基因，则被检测液中的磁标偶联物会直接泳动到检测T线和硝酸纤维膜上的链霉亲和素发生反应，从而使磁珠颗粒发生聚集，形成黄色的线条；其他未结合的磁标偶联物继续通过毛细管作用向前泳动，与对照C线上的牛血清白蛋白抗体发生第二次反应，同样形成黄色线条，这样NC膜上就会出现两条黄色线条，表示被检测液为阳性，其颜色强弱取决于被检测液中目标物含量的多少；最后通过测定检测T线上捕获磁珠的含量实现判断出被奶粉中克罗诺杆菌的菌落数；
若被检测液中不存在克罗诺杆菌基因，则被检测液中的磁标偶联物直接泳动到对照C线处，检测T线处就不会发生磁珠颗粒的聚集，即不会出现黄色的线条；对照C线是为检验磁标免疫层析方法本身是否有效而设定的，所以无论样品中是否存在目标物，对照C线都应该显黄色；这样NC膜上就会出现一条黄色线条，表示被检测液为阴性；如果对照C线不显现出黄色，则说明试纸条失效。
2.根据权利要求1所述的一种用免疫磁珠层析试纸条快速检测奶粉中克罗诺杆菌的方法，其特征在于：步骤（1.1）中，增菌培养条件：温度44℃、时间6-8 h。
3.根据权利要求1所述的一种用免疫磁珠层析试纸条快速检测奶粉中克罗诺杆菌的方法，其特征在于：步骤（1.2）中，取1mL奶粉均质液于1.5mL EP管中，8500转/min、离心5min，去上清，沉淀物溶于1mL细菌裂解液中，震荡反应15s，65℃水浴10min；
所述细菌裂解液由50 μL 1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液、20 μL 0.5 M乙二胺四乙酸、65μL 15%的十二烷基硫酸钠、30 μL 20 mg/mL蛋白酶K和835μL双蒸水制成。
4.根据权利要求1所述的一种用免疫磁珠层析试纸条快速检测奶粉中克罗诺杆菌的方法，其特征在于：步骤（1.3）中，将10 μL磁性纳米粒子和500 μL 的吸附缓冲液混匀后加入奶液裂解物中，振荡反应10min；所述吸附缓冲液由11.7 g 氯化钠和30g 聚乙二醇20000溶于100mL双蒸水中混合均匀制成。
5.根据权利要求1所述的一种用免疫磁珠层析试纸条快速检测奶粉中克罗诺杆菌的方法，其特征在于：步骤（1.5）中，向洗涤物中加入100 μL TE洗脱液，涡旋混匀，于65 ℃水浴10 min，磁性分离取上清，所述TE洗脱液由1 mL 1M pH值8.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、0.2 mL 0.5 M pH值8.0的 乙二胺四乙酸和98.8 mL的双蒸水混合均匀制成。
6.根据权利要求1所述的一种用免疫磁珠层析试纸条快速检测奶粉中克罗诺杆菌的方法，其特征在于：步骤（2）中，PCR体系：2.5 μL 25 mM MgCl2，2.5 μL 10×PCR Buffer，2 μL2.5 mM dNTPs，0.5 μL 5 U/μL 的Taq DNA聚合酶，2 μL（1）中的DNA模板，分别取1 μL 1-10μM上游引物和1 μL 1-10 μM下游引物，加灭菌水至总体积为25μL；
扩增程序为：95 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性30 s，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30或35个循环；72 ℃再延伸2 min；12 ℃保存。
7.根据权利要求1所述的一种用免疫磁珠层析试纸条快速检测奶粉中克罗诺杆菌的方法，其特征在于：步骤（3）中，取5 μL PCR产物，用2％琼脂糖凝胶电泳进行分析，采用前染，即在溶胶前期加入4S Red Plus Nucleic Acid Stain水溶液，电压为120-180 V，时间T为20-40 min，进行电泳，确证PCR扩增。
8.根据权利要求1所述的一种用免疫磁珠层析试纸条快速检测奶粉中克罗诺杆菌的方法，其特征在于：步骤（4）中，免疫磁珠的制备：吸取体积100 μL 25-50 mg/mL的钠米磁珠，体积16 μL 10 mg/mL的碳化二亚胺水溶液和体积10μL 10 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺水溶液于1.5 mL离心管中，涡旋混合，于室温低速搅拌孵育反应15 min，磁性分离去上清，再用双蒸水或磷酸盐缓冲液清洗磁珠两次，重悬至80-100 μL；再缓慢加入浓度5-20 μL 5 mg/mL的链霉亲和素，低速搅拌孵育反应3 h，加入等体积的质量浓度10%的牛血清白蛋白，持续反应1 h，以饱和游离的磁珠；磁性分离去上清，然后再用双蒸水或磷酸缓冲液清洗磁珠去除未结合的蛋白质，将磁珠转移至新管，弃去上清液，用水重悬，放4 ℃冰箱存放备用；用时则定量加入到聚合酶链反应产物中，滴加于试纸条的样品垫上。
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