JP2013503352A - 統合されたサンプル調製及び検体検出 - Google Patents
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Abstract
サンプル調製及び検体検出のためのシステムは、流体チャネル、導波路、及び捕捉スポットを備えたカートリッジを含む。システムはさらに、力場発生装置、画像化システム、並びに検体を潜在的に含むサンプル、標的検体に特異的な結合部分を含み、且つ力場に応答する第一の種類の粒子、及び標的検体に特異的な結合部分を含み、且つ信号を生成することができる第二の種類の粒子を含む液体を含む。サンプルが標的検体を含む場合、標的検体と結合部分との特異的な結合相互作用は、標的検体を介して第一及び第二の種類の粒子を連結させ、捕捉スポットで多重粒子複合体を形成する。力場は、第二の種類の粒子からの検出される信号が、サンプル中の標的検体の指標となるように、粒子及び多重粒子複合体の操作を可能にする。
Description
政府の権利
この発明は、米国国立衛生研究所により与えられた契約AI065357の下に、政府支援で成された。政府はこの発明において所定の権利を有する。
この発明は、米国国立衛生研究所により与えられた契約AI065357の下に、政府支援で成された。政府はこの発明において所定の権利を有する。
優先権及び関連出願
この出願は、2009年8月31日に出願された米国仮特許出願番号61/238,376の利益を主張する。この出願番号61/238,376の詳細は、その全体において、及び全ての目的のために、参照により本出願に組み込まれる。
この出願は、2009年8月31日に出願された米国仮特許出願番号61/238,376の利益を主張する。この出願番号61/238,376の詳細は、その全体において、及び全ての目的のために、参照により本出願に組み込まれる。
背景
体液(例えば、血液、尿、鼻洗浄液)を含む生物学的サンプル、環境的サンプル、及びバイオプロセスサンプルにおける標的検体を測定するための方法は、いくつかの特異的検出アッセイが後に続く、生物学的サンプル調製の組み合わせがしばしば要求される。検体、例えば生物学的サンプルにおけるタンパク質、核酸、及び細胞は、典型的に、複合的な液体又は固体環境中の低濃度成分である。
体液(例えば、血液、尿、鼻洗浄液)を含む生物学的サンプル、環境的サンプル、及びバイオプロセスサンプルにおける標的検体を測定するための方法は、いくつかの特異的検出アッセイが後に続く、生物学的サンプル調製の組み合わせがしばしば要求される。検体、例えば生物学的サンプルにおけるタンパク質、核酸、及び細胞は、典型的に、複合的な液体又は固体環境中の低濃度成分である。
核酸、例えばリボ核酸(「RNA」)及びデオキシリボ核酸(「DNA」)は、生物学的アッセイにおいて、特に有用な標的検体である。例えば、インフルエンザウイルス検出について、標的検体は、鼻スワブ中の低濃度のウイルス粒子内に含まれるRNAから成り得る。生物学的サンプルを調製するために、例えば、標的RNAが分解酵素から保護される一方で、試料は、スワブから放出され、鼻粘膜マトリックスは壊され、ウイルス粒子はオープンになるに違いない。同様の処理ステップは、体液又は組織を含む他の生物学的マトリックス、環境的サンプル、法医学的サンプルなどにおける核酸標的検体に要求される。適切なサンプル調製を実施後、多くの進歩した核酸検出方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)、核酸配列ベース増幅(「NASBA」)、転写仲介増幅(「TMA」)、ループ仲介等温増幅(「LAMP」)、又は他の酵素的増幅技術などの方法を経た標的検体の増幅を要求する。これらの方法の全ては、標的マトリクスにおける混入物に対する様々な感度を有し、従って、慎重なサンプル調製が要求される。最終的に、増幅は、典型的に、増幅産物を測定するために、信号変換のいくつかの種類と結合される。
他の有用な標的検体は、ペプチド、抗原、抗体、及び他のタンパク質を含む。しばしばこれらの標的は、残屑、様々な細胞種類、及び標的検体よりも何桁も大きい濃度であり得るタンパク質のバックグラウンドを含む複合体マトリックスにおいて、非常に低濃度である(例えば、1ミリリットルの血液あたり、ピコグラムの抗原濃度)。ペプチド又はタンパク質標的の検出のための一般的な手法は、標的を選択的に固定する、及び検出するための標的検体に対して特異的な親和性を有する抗体を用いる、サンドイッチイムノアッセイのバリエーションである。イムノアッセイにおける信号変換は、しばしば、いくつかの信号変換手段、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(「ELISA」)において色変化をもたらすために使用される酵素、蛍光イムノアッセイ(「FIA」)に用いられる蛍光標識、化学発光、及び放射性標識で標識された抗体に基づく。粒子凝集アッセイ及びイムノクロマトグラフィーアッセイは、可視的な信号を生じる粒子集合に基づくイムノアッセイの例である。組織学、蛍光顕微鏡検査法、及びフローサイトメトリー適用では、細胞集団の分析はまた、典型的に、標識された検体特異的抗体が、標的検体を比色分析的に又は蛍光的に標識するために用いられる免疫染色ステップを要求する。磁性粒子はまた、磁気的信号変換のための標識として用いられ得る。
全細胞(例えば、哺乳動物、植物、又は細菌)及びウイルス粒子は、標的検体の別の分類を定義する。さらに、標的検体細胞又は粒子は、しばしば、複合的サンプル環境において低濃度で発見される。例えば、血中の臨床的に意義のある細菌濃度は、1ミリリットルあたり、1〜10コロニー形成単位である。多数の複合的なサンプル調製及び標識は、典型的に、細胞標的の検出が要求される。
マイクロスフェア、ビーズ、及びナノ粒子を含む機能化された粒子は、多数の生物学的アッセイ用途に用いられている。いくつかの手法は、下記で強調される。
粒子に基づくサンプル調製:機能化された磁性粒子及びビーズは、生物学的なサンプル洗浄、濃縮、及び分離に関連して用いられる。磁性粒子は、大きさ、担体マトリックス(例えば、ポリマー、シリカ)、デザイン(例えば、コア‐シェル、埋め込まれた酸化鉄ナノ粒子)、及び表面化学の範囲において、市販されている。磁性粒子は、高額又は複雑な設備を要求することなく、サンプル操作を可能にする。非磁性粒子はまた、生物学的サンプル調製に使用される。一つの例は、選択的に核酸と結合するカオトロピックバッファの存在におけるシリカ粒子の使用である。
粒子に基づく検出:粒子は、生物学的アッセイにおける検出又は信号変換を提供するために用いられ得る。典型的な方法は、ラテックス凝集アッセイ、イムノクロマトグラフィーアッセイ、光散乱アッセイ、及び蛍光粒子アッセイを含む。標的検体の存在が機能化されたラテックス粒子の凝集(agglutination)又は凝集(flocculation)を引き起こす、凝集アッセイは、単純で、視覚的に読み取る(visually−read)アッセイである。特異的な結合基(例えば、抗体)を有する粒子は、多孔質体を通して移動し、標的検体の存在下で、特異的な結合基が固定されている多孔質体においてライン又はスポットの上に蓄積する、側方流動アッセイ及び他のイムノクロマトグラフィー法はまた、典型的に視覚的に読み取るアッセイである。多数の粒子種(例えば、着色されたラテックス、金、及びセレンコロイド)は、イムノクロマトグラフィーアッセイに用いられる。ラテックス凝集及びイムノクロマトグラフィー手法の主な不都合な点は、限られた感度及び限られた多重化能力である。視覚的な読み取りはまた、これらの技術を定性的及び主観的にする。
検体検出を目的とする別の粒子に基づく手法は、生物学的アッセイにおいて、信号変換を提供する蛍光標識粒子の使用である。蛍光色素及び他の発色団、例えばランタノイドキレートを含むポリマー及びガラス粒子は、市販されており(例えば、Molecular Probes/Invitrogen,Thermo Scientific)、さらなる機能化を実施するための表面反応基と共に供給される。蛍光粒子は、平面導波路に基づく検出に関連して用いられ、様々な蛍光標識粒子の多重化された測定に基づく多重検体検出方法は、実証される(Moll et alらにより、WAVEGUIDE WITH INTEGRATED LENSの表題の下に、2009年11月12日に出願された米国特許出願、出願番号12/617,535を参照のこと、それは、その全体において、参照により本明細書に組み込まれる)。光散乱粒子はまた、平面同波路表面で結合した光散乱粒子を含む検体検出に用いられる。
場支援(field−assisted)粒子アッセイ:大量輸送は、固体表面で行われる実際の不均一アッセイにおいて重大な制限を示す。この制限は、特に、対流混合が制限される低容量液体システムにおいて重要である。大量輸送制限を克服するための提案された方法は、核酸、タンパク質、及び全細胞の濃縮及び検出のための電気泳動的手法、及び磁性粒子標識を使用する方法を含む。
二重粒子手法:いくつかの二重粒子手法、例えば、標的検体の存在下で、ラテックス粒子対は形成され、近接に基づくドナー‐アクセプター酸素チャネリング機構を介して信号の生成を可能にする手法は記述されている。加えて、核酸配列の検出のためのシステムは記述されており、それは標的特異的なオリゴヌクレオチド配列を含む磁性粒子、及び標的特異的オリゴヌクレオチド配列をまた含む色素‐カプセル化リポソームを使用する。粒子‐リポソームの組み合わせは、特異的なRNA標的のためのセンサとして用いられる。「バイオバーコード」アッセイとして集合的に呼ばれる一連の手法では、バーコード配列分子の多数のコピーは、検体の存在下で生成される。あるいは、自己較正アッセイは、粒子複合体及び二重波長検出を利用する。
様々な有用な粒子に基づく分離及び精製方法は、それに続く検出アッセイのための生物学的サンプルを処理することに使用できる。粒子に基づくシステムは、信号変換の方法を提供し、様々な生物学的アッセイ形式における検出モードとして役割を果たし得る。これらの手法の多くは、しかしながら、典型的に、多数の利用者又は機械介入を伴う、複数のサンプル調製及び検体検出ステップが要求される。
概要
一つの実施形態では、サンプル調製及び検体検出のためのシステムは、開示される。システムは、カートリッジを含み、そのカートリッジは、流体チャネル、導波路、及び導波路上且つ流体チャネル内に配置される捕捉スポットを含む。システムは、さらに、力場発生装置、画像化システム、及び流体を含む。流体は、標的検体を潜在的に含むサンプルを含む。流体はさらに、標的検体に特異的な結合部分を含み、且つ力場に応答する第一の種類の粒子、及び標的検体に特異的な結合部分を含み、且つ信号を生成することができる第二種類の粒子を含む。サンプルが標的検体を含む場合、第一及び第二の種類の粒子上の標的検体と結合部分の間の特異的な結合相互作用は、少なくとも一つの第一種類の粒子及び少なくとも一つの第二の種類の粒子を、標的検体を介して連結させ、多重粒子複合体を形成する。その上、流体は、捕捉スポットと接触させられた場合、多重粒子複合体は、一つ又は複数の捕捉スポットで捕捉され得る。なおさらには、第二の種類の粒子により生成され、画像化システムで捕捉された信号が、サンプル内で標的検体の存在の指標となるように、力場は、第一の種類の粒子、第二の種類の粒子、及び多重粒子複合体の少なくとも一つの操作を可能にする。
一つの実施形態では、サンプル調製及び検体検出のためのシステムは、開示される。システムは、カートリッジを含み、そのカートリッジは、流体チャネル、導波路、及び導波路上且つ流体チャネル内に配置される捕捉スポットを含む。システムは、さらに、力場発生装置、画像化システム、及び流体を含む。流体は、標的検体を潜在的に含むサンプルを含む。流体はさらに、標的検体に特異的な結合部分を含み、且つ力場に応答する第一の種類の粒子、及び標的検体に特異的な結合部分を含み、且つ信号を生成することができる第二種類の粒子を含む。サンプルが標的検体を含む場合、第一及び第二の種類の粒子上の標的検体と結合部分の間の特異的な結合相互作用は、少なくとも一つの第一種類の粒子及び少なくとも一つの第二の種類の粒子を、標的検体を介して連結させ、多重粒子複合体を形成する。その上、流体は、捕捉スポットと接触させられた場合、多重粒子複合体は、一つ又は複数の捕捉スポットで捕捉され得る。なおさらには、第二の種類の粒子により生成され、画像化システムで捕捉された信号が、サンプル内で標的検体の存在の指標となるように、力場は、第一の種類の粒子、第二の種類の粒子、及び多重粒子複合体の少なくとも一つの操作を可能にする。
さらなる実施形態はで、第一の種類の粒子は磁性粒子であり、力場発生器は磁石である。例えば、磁性粒子は、磁性成分を含むポリスチレンマイクロスフェアである。
なおさらなる実施形態では、多重粒子複合体は、方向性のある信号増幅を示す。
なおさらなる実施形態では、第二の種類の粒子は、発光粒子である。
さらなる実施形態では、システムはまた、流体チャネルの少なくとも一部を照射するために、励起エネルギーを提供するように励起源を含む。第二の種類の粒子は、励起エネルギーがその表面に入射する場合、蛍光信号を生成するために構成される蛍光粒子である。
なおさらなる実施形態では、励起エネルギーが、平面導波路を通じて全内部反射による少なくとも一部の流体チャンネルの一部に向けられるように、導波路は平面導波路である。
なおさらなる実施形態では、カートリッジは、導波路上、且つ流体チャネル内に配置された多数の捕捉スポットを含む。
さらなる実施形態では、画像化システムは、電荷結合素子(「CCD」)、及び相補型金属酸化物半導体(「CMOS」)センサからなる群から選択される画像センサを含む。
別の実施形態では、サンプル処理及び標的検出のための方法は開示される。方法は、標的検体を潜在的に含むサンプルを提供することを含む。本方法はまた、標的検体に特異的な結合部分及び力場に反応的であることを含む、第一の種類の粒子を提供することを含む。本方法は、標的検体に特異的な結合部分及び信号を生成し得ることをまた含む、第二の種類の粒子を提供することをさらに含む。本方法は、標的検体の存在下で、第一の種類の粒子の一つ及び第二の種類の粒子の一つが、標的検体を介して連結し、多重粒子複合体を形成するように、標的検体と第一及び第二の種類の粒子上の結合部分の特異的な結合相互作用を許容する条件下で、サンプルと、第一及び第二の種類の粒子とを接触させることさらに含む。本方法はさらに、少なくとも一つの第一及び第二の種類の粒子及び多重粒子複合体を、力場を用いて操作することを含む。最終的には、本方法は、多重粒子複合体に感受性であり、第一及び第二の種類の粒子の個別の一つには感受性でない方法で、多重粒子複合体を検出することを含み、ここでそのように検出される多重粒子複合体は、標的検体の指標である。
さらなる実施形態では、少なくとも一つの第一及び第二の種類の粒子及び多重粒子複合体を操作することは、少なくとも一部の第一及び第二の種類の粒子及び多重粒子複合体に磁場を適用することを含む。なおさらなる実施形態では、操作することは、第一の種類の粒子及び多重粒子複合体を第二の種類の粒子から分離することを含む。
なおさらなる実施形態では、第二の種類の粒子は、発光分子又はイオンを含んでもよい。なおさらなる実施形態では、第二の種類の粒子は、励起エネルギーに曝露された場合、信号を生成する。さらに、別の実施形態では、照射することは、ボリュームに隣接して配置された第一の種類の粒子、第二の種類の粒子、及び多重粒子複合体のみが、照射されるように、ボリューム内で励起エネルギーを含むこと及びガイドすることを含む。なおさらには、操作することは、第一の種類の粒子、及び多重粒子複合体のみが照射されるように、ボリュームから第二の種類の粒子を移動させることを含む。
なおさらなる実施形態では、操作することは、標的検体と連結していない第二の種類の粒子をサンプルから取り除く一方で、多重粒子複合体を保持するように、力場にサンプルを曝露することを含む。方法は、サンプル中でそのように保持された多重粒子複合体において連結した第二の種類の粒子が検出可能な信号を生成するように、サンプルに励起エネルギーを提供することをさらに含む。
さらなる実施形態では、多重粒子複合体は指向性の信号増幅を示し、多重粒子複合体を検出することは、指向性の信号増幅に感受的である方法において検出可能な信号を感知することを含む。
説明の明確性の目的のために、図中の特定の要素は縮小されてはならないことが言及される。
詳細な説明
本明細書で記述される実施形態は、生物学的アッセイのための、単純化され、統合されたサンプル調製及び検出システムの必要性に取り組む。典型的な実施形態は、サンプル調製及び検体検出が、複合的で、時間のかかる、又は自動化の集約的な方法でそれぞれ分離して行われる、現在の技術分野における主な制約に取り組む。わずかな、あったとしても少しの、すでに記述された手法は、首尾よく合わせられ、一回に統合された方法における、サンプル調製及び検出を有する。本明細書で記述された手法は、生物学的アッセイのための、単純化され、統合されたサンプル調製及び検出システムの著しい必要性に取り組む。
本明細書で記述される実施形態は、生物学的アッセイのための、単純化され、統合されたサンプル調製及び検出システムの必要性に取り組む。典型的な実施形態は、サンプル調製及び検体検出が、複合的で、時間のかかる、又は自動化の集約的な方法でそれぞれ分離して行われる、現在の技術分野における主な制約に取り組む。わずかな、あったとしても少しの、すでに記述された手法は、首尾よく合わせられ、一回に統合された方法における、サンプル調製及び検出を有する。本明細書で記述された手法は、生物学的アッセイのための、単純化され、統合されたサンプル調製及び検出システムの著しい必要性に取り組む。
検体の例は、核酸、タンパク質、及び複雑な環境下の細胞、例えば生物学的サンプルを含む。例えば、標的検体は、タンパク質又はペプチド標的であってもよく、粒子は、特異的な結合基、例えば抗体、Fabフラグメント、又はアプタマーで機能化されてもよい。少なくとも二つの異種の粒子種類の複合体は、標的検体の統合された精製、濃縮、及び検出に用いられ得る。例えば、標的検体が、磁場反応性粒子、例えば磁性粒子、と信号生成粒子、例えば蛍光粒子との連結を形成した場合、多重粒子複合体は形成し得る。すなわち、多重粒子複合体は効率的にサンドイッチアッセイとして作用する。
用語「粒子」及び「ビーズ」とは、本明細書で区別せずに用いられ、直径約0.01〜20マイクロメーターの大きさに及ぶ様々な組成物のいくつかの粒子を意味する。粒子は、有機材料、例えば、ラテックス、ポリスチレン、アガロース、及び脂質を含むがこれに限定されない。粒子は、多くの場合球状(例えば、ラテックスマイクロスフェア)である一方で、本明細書で開示される粒子は、球状であることは要求されない。粒子はまた、無機材料、例えば、シリカ、及び他のシリカ系ガラス組成物、酸化鉄を含む酸化物、セラミックス、及び半導体を含むがこれに限定されない。粒子はまた、複合構造、例えばコアシェル粒子(例えば、有機ポリマーシェルを含む金属又は金属酸化物コア)、及びその中に金属酸化物サブ粒子を組み込んだポリマーでもよい。
図1は、一つの実施形態に従って、標的検体を介した第一の種類の粒子と第二の種類の別の粒子の連結による、多重粒子複合体の形成の図を示す。複合体100は、核酸鎖としてここで示される標的検体110を含む。標的検体110は、第一の末端配列112及び第二の末端配列114を含む。第一の種類の粒子120は、標的検体110の第一の末端配列112と相補的である、第一のプローブ125(例えば、「捕捉プローブ」)で機能化されている。第一の種類の粒子120は、例えば、標的検体110の第一の末端配列112と相補的な捕捉配列で機能化された、磁場反応性粒子、例えば磁性粒子でもよい。特定の例として、第一のプローブ125は、50ヌクレオチド、一本鎖DNA捕捉配列でもよい。場反応性粒子は、外力の場、例えば磁場、電場、及び、重力又は沈降場であるがこれに限定されない、に反応する任意の粒子でもよい。
続けて図1に言及すると、第二の種類の粒子130は、第二のプローブ(「検出プローブ」)135で機能化されており、それは、標的検体110の第二の末端配列114に相補的である。例えば、第二の種類の粒子130は、信号粒子、例えば、第二の末端配列114に相補的なDNA配列で機能化された蛍光粒子でもよい。信号粒子(又は信号生成粒子)は、検出可能な信号を生成する任意の粒子、例えば適切な照射源で励起された場合、光を発する発光粒子でもよい。検出可能な信号の例は、発光、蛍光、リン光、化学発光、光散乱、及び磁場を含むが、これに限定されない。複合体100は、それぞれ第一及び第二の種類の粒子120及び130の特徴の組み合わせを示す。例えば、第一の種類の粒子120が磁性粒子であり、第二の種類の粒子130が蛍光粒子である場合、その後複合体100は、磁場の適用により操作され得、また適切な励起エネルギー、例えばレーザー又は発光ダイオード(「LED」)からの光の適用により蛍光信号を生成することが誘導される。
様々な実施形態では、標的検体110は、それぞれ異なる機能性を有する少なくとも二つの異種の粒子との間のブリッジを形成する。一つの粒子の種類(例えば、第一の種類の粒子120)は、力場に反応的(すなわち、場反応性粒子)でもよく、適切な力場の適用で、これらの粒子の分離、精製、及び/又は濃縮を可能にする。例えば、場反応性粒子は、常磁性粒子でもよく、それは、永久磁石又は電磁石からの磁場に反応的である。場反応性粒子はまた、他の磁性粒子種を含んでもよい。場反応性粒子としての使用に適したさらなるの種類の粒子は、沈降粒子、例えば、自然の重力場において又は遠心分離を通じて、沈殿を許容する液体密度と比較して十分な密度を有する粒子、及び電気泳動移動性を有する粒子(すなわち、適用された電場に反応的な粒子)でもよい。
さらに、第二の種類の粒子130は、例えば、蛍光分子で含浸されたラテックス又はガラス粒子、発光粒子(例えば、ランタニドキレートで含浸された粒子)、光散乱粒子、共鳴光散乱粒子、ナノ粒子、及び/又は磁性粒子でもよい。第一及び第二の種類の粒子120及び130の双方は、それを生物学的アッセイに適応させた結合部分での機能化を要求し得る。粒子機能化プロトコールは、当該技術分野で確立されており、磁性粒子及び蛍光粒子機能付与のためのキットは、市販されている。
図2は、実施形態に従って、多重粒子複合体の形成の別の手法の図を示す。この場合では、第一の種類の粒子及び第二の種類の粒子は、標的検体が抗原、例えば、タンパク質、細菌、又は細胞である標的検体を介して連結する。複合体200は、標的検体210を含む。標的検体210は、第一のエピトープ領域212、及び第二のエピトープ領域214を含む。第一の種類の粒子220は、第一の特異的結合リガンド225、例えば、標的検体210の第一のエピトープ領域212に特異的な親和性を有するために選択された抗体で機能化される。第一の種類の粒子220は、さらに、場反応性粒子、例えば磁性粒子でもよい。第二の種類の粒子230は、標的検体210の第二のエピトープ領域214に特異的な親和性を有するために選択された、第二の特異的結合リガンド235で同様に機能化される。第二の種類の粒子230は、例えば、信号粒子、例えば適切な励起エネルギーの適用により蛍光信号を精製する蛍光粒子でもよい。
一つの実施形態では、核酸標的は、標的核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド捕捉プローブで機能化された磁性粒子、及び標的配列の異なる部分に相補的なオリゴヌクレオチドプローブで機能化された蛍光粒子を用いて、迅速に濃縮され、検出される。単純な洗浄ステップは、磁気的洗浄を用いて行われ得、磁石は、その後、粒子複合体が定量される検出表面に粒子対を移動させるために用いられる。図3〜6は、そのようなサンプル調製及び多重粒子複合体形成及び検出のための典型的なプロセスを説明する一連の図である。
まず、図1と併せて図3に関しては、バッファ302は、容器304内に閉じ込められている。サンプル、例えば血液、血清、又は標的検体110を含む他の生物学的見本は、バッファ302に添加される。バッファ302は、例えば、溶解バッファ、又は機能化された粒子を含む安定化バッファでもよい。図3で示される典型的なプロセスでは、バッファ302は、先述のようにそれぞれ機能化された第一及び第二の種類の粒子120及び130を含む。例えば、図1及び3に示されるように、第一の種類の粒子は、特異的な目的の標的検体の第一の末端配列112と結合するために好適な捕捉プローブ125で機能化された磁性粒子でもよい。また、第二の種類の粒子130は、標的検体110の第二の末端配列114と結合するために好適な検出プローブ135で機能化された蛍光粒子でもよい。
図4に関しては、ハイブリダイゼーションは多重粒子複合体100の形成を導く。多重粒子複合体100のそれぞれは、標的検体100の第一の末端配列112に結合する第一の種類の粒子120の捕捉プローブ125、及び標的検体110の第二の末端配列114に結合する第二の種類の粒子130の検出プローブ135により形成される。バッファ302中に残っている、結合していない第一及び第二の種類の粒子120及び130のそれぞれは、その後、図5に示されるように、一回又は複数回の「洗浄」ステップにより取り除かれる。第一の種類の粒子120の磁気的性質を生かして、非磁性である未結合の第二の種類の粒子130は、バッファ302中に懸濁されて残る一方で、磁性粒子複合体100及び未結合の第一の種類の粒子120は、磁石510の方に引っ張られるように、磁石510は、容器304の近くに運ばれる。一連の液体交換(すなわち、「洗浄」)ステップにより、実質的に全ての未結合の第二の種類の粒子130は、容器304から取り除かれ得る。それらは、図6で説明される検出のステップにおいて検出可能な信号を生成しないので、未結合の第一の種類の粒子120は、洗浄ステップにより取り除かれる必要がないことは、指摘され得る。
洗浄ステップに続いて、磁石510は取り除かれ、残った多重粒子複合体100及び、未結合の第一の種類の粒子120は、図6で示されるように、容器304の底に沈殿する。あるいは、多重粒子複合体100、及び未結合の第一の種類の粒子120は、容器304の底に磁気的に濃縮され得る。多重粒子複合体100内で標的検体110と結合した第二の種類の粒子130は、適切な励起エネルギーで励起され(示されない)、第二の種類の粒子から得られる信号は、画像化システム610により検出される。
「洗浄」ステップのない、サンプル調製及び検体検出の代わりの方法は、図7〜9に示される。この実施形態では、多重粒子複合体、及び未結合の第一の種類及び第二の種類の粒子を含む全ての粒子は、容器304の底に存在し、多重粒子複合体にのみ反応的である検出方法は、標的検体検出に用いられる。図3と同様である図7に示されるように、容器304内のバッファ302は、多数の標的検体110、第一の種類の粒子120、及び第二の種類の粒子130を含む。図8に示されるように(図4と同様である)、標的検体110は、多数の多重粒子複合体100を形成するように、第一及び第二の種類の粒子120及び130のそれぞれと一緒に連結する。図3〜6に関して記述される方法と対照的に、この代わりの方法は、図5に示される洗浄ステップを取り除く。その後、図9に示されるように、多重粒子複合体100の存在にのみ感受的な検出方法は、標的検体の存在を検出するために用いられる。そのような検出方法の例は、下記の実施例VIIに記述される。
図3〜9に示されるプロセスは、流体チャネルと磁気的配置、例えば、任意で活性化及び不活性化され得る、移動可能な一組の磁石又は複数の磁石(例えば、電磁石)を組み合わせたプロセスを用いることにより、標的検体及び/又は多重粒子複合体の空間的移動に作用するように構成され得る。統合されたサンプル調製及び検体検出に適したそのような空間的移動プロセスの例は、図10〜17に図解される。
図10は、基板1012、上部の構成部分1014、及び流体チャネル1020を特徴付けるガスケット1016から形成されるカートリッジ1010を含むシステム1000を示す。あるいは、基板1012及び上部の構成部分1014の組み合わせのみが、流体チャネル1020の輪郭を示すように、基板1012及び/又は上部の構成部分1014は、ガスケット1016の代わりに、完全に形成された側壁(示されない)を含む。流体チャネル1020は、液体が入口1030を通って導入され、その後出口1040を通って取り除かれ得るように、入口1030及び出口1040を含む。捕捉スポットのアレイ(図10でA1〜A4で示される)は、基板1012上にプリントされる。捕捉スポットは、固定化された生体分子、例えば、抗原、抗体、タンパク質、ペプチド、多糖、又は核酸を含み得る。接触プリンディング、インクジェットプリンティング、圧電的プリンティング、及び電磁弁ジェットプリンティングを含む、プリントされたアレイを調製する様々な方法は利用できる。M0〜M8は、空間的移動プロセスに使用のための磁石の配置についての様々な位置を示す。固定された磁石は、アッセイの間、異なる位置に移動され得、又は電磁石は、これらの位置で移動する磁場を作るために、オン・オフで切り替わるように構成され得る。画像化システム1050は、光源1065からの励起1060により捕捉スポットA1〜A4で生成された光学的な信号の画像を捕捉するために用いられる。
一つの実施形態では、図11に関して、チャネル1020は、バッファ1025で前もって充填される。サンプルは、その後、導入され入口1030において導入される。サンプルは、標的検体110、第一及び第二の種類の粒子120及び130、及びそれと共に第一及び第二の種類の粒子120及び130と連結する標的検体110の組み合わせにより形成された多重粒子複合体100の組み合わせを含む。
図12に関して、位置M0で固定された磁石又は電磁石は活性化され、その後、さらなる量のバッファ1025が入口1030に添加される。さらなるバッファは、第一の種類の粒子120及び多重粒子複合体100が捕捉スポットのアレイから上流に保持される一方で、未結合の第二の種類の粒子は、出口140に排出されるように、流体チャネル1020を介した流れを引き起こす。
図13に示されるように、捕捉スポットA1の真下の位置M1に位置する第二の電磁石は、残った第一の種類の粒子120及び多重粒子複合体100が、捕捉スポットA1上に移動するように、その後活性化される。あるいは、固定された磁石は、位置M0から捕捉スポットA1の真下の位置M1に移動され得、一定時間(例えば、5秒)活性化される。磁石は、第一の種類の粒子120及び多重粒子複合体100を、スポットA1で固定化された捕捉分子と自由に相互作用させることために、その後不活性化される。捕捉スポットへの捕捉分子固定化及び結合のモードは、下記の図18及び19の記述に記載される。特異的な結合イベントが生じた場合(例えば、抗原‐抗体、タンパク質‐タンパク質、核酸ハイブリダイゼーション)、その後、第一の種類の粒子120及び多重粒子複合体100はスポットA1で結合する。
一定時間(例えば、20秒)後、電磁石は捕捉スポットA2の真下で活性化され、又は、あるいは、図13で示される磁石は、位置M1から、捕捉スポットA2の真下の位置M2に移動され得、その後、図14に示されるように、所定の時間(例えば、5秒)、活性化される。それ故、捕捉スポットA1と結合しなかった第一の種類の粒子120及び多重粒子複合体100は、捕捉スポットA2に向けて移動する。図14に示される実施例では、スポットA1との特異的結合は生じず、及び全ての第一の種類の粒子120及び多重粒子複合体100は、捕捉スポットA2に磁気的に移動される。一度M2における磁石が不活性化される、又は取り除かれると、未結合の第一の種類の粒子120及び多重粒子複合体100は、一定時間(例えば、20秒)、捕捉スポットA2に固定化された捕捉分子と自由に相互作用することが許容される。プロセスは、その後、図15及び16に示されるように、捕捉スポットA3及びA4のそれぞれに相当する磁石の位置M3及びM4についてそれぞれ繰り返される。この実施例では、生じる捕捉スポットA2での特異的結合、及び粒子複合体は、連続的な磁気的移動ステップの間、スポットA2で保持された。最終的には、任意の残った第一の種類の粒子120及び多重粒子複合体100は、位置M5に磁石を移動すること又は活性化することにより、捕捉アレイから取り除かれた。
図10〜17に図解される方法では、流体チャネル及び磁石の配置の組み合わせは、一回容量内のサンプル調製及び検体検出の性能を許容する。すなわち、図11に示されるように、最初に添加したサンプルは、チャネル1020に導入される前に、未結合の第二の種類の粒子を含んでもよい。例えば、図3〜6に図解されるサンプル調製方法は、チャネル1020へのサンプル導入の前に別に行われ得る一方で、図10の流体チャネル及び磁石配置は、任意で別のサンプル調製をさせる。そのような単純化は、全般的なアッセイプロトコールの複雑性を減少させるのに特に望ましい。
図10〜17に示される実施形態では、位置M6及びM8における磁石は、チャネルを通じた磁石の移動速度を変更するために、適用される磁場の指向性を調整するために、さらに構成され得る。例えば、任意で、位置M6における、固定された磁石又は電磁石は、図12に示されるように、チャネル1020を通して第一の種類の粒子120及び多重粒子複合体10の流動性及び捕捉を助けるために、位置M0における磁石と同時に活性化され得る。同様に、位置M8で固定された磁石又は電磁石はまた、図17に示されるように、出口1040に向けて、未結合の第一の種類の粒子120及び多重粒子複合体100の流動を助けるために、同時に活性化される。
図18及び19は、捕捉スポットへの捕捉分子固定化及び結合の異なるモード説明する概略図が示される。多重粒子複合体100の特異的結合は、第一の種類の粒子120上の第一のプローブ125を介して(図18)、又は第二の種類の粒子130(上の第二のプローブ135を介して図19)生じるように設計され得る。説明の目的のために、図18及び19は、それぞれの粒子種類上のオリゴヌクレオチドプローブを伴う核酸標的を想定する。
図10と併せて図18に関して、基板1012上の捕捉スポットA1は、第一の種類の粒子120上に固定されたオリゴヌクレオチド(すなわち、第一のプローブ125)の配列に相補的な、第一の末端配列112を有する、第一の固定化されたオリゴヌクレオチドプローブ1910を含む。捕捉スポットA2は、第一のプローブ125又は第二のプローブ135のどちらにも相補的でない別の配列を有する、第二の固定化されたオリゴヌクレオチドプローブ1920を含む。図10〜17に記述されるようなアッセイの間、多重粒子複合体100は、第一のプローブ125で機能化された第一の種類の粒子120と結合しないように、第一のプローブ125を介して捕捉スポットA1と特異的に結合する。捕捉スポットA2は、この例において非相補的な配列を有する第二の固定化されたオリゴヌクレオチドプローブ1920のみを含むので、いずれの種類の粒子もスポットA2に結合しない。
図19は、多重粒子複合体100が第二の種類の粒子130を介して結合する、代替の構造を示す。この例では、捕捉スポットA2’が、第二の種類の粒子130上に固定化された第二の末端配列135に相補的である、第二の末端配列114を含む第二の固定化されたオリゴヌクレオチドプローブ2020を含む一方で、捕捉スポットA1’は、非相補的な配列を含む第一の固定化されたオリゴヌクレオチドプローブ2010を含む。図10〜17に記述されるようなアッセイの間、多重粒子複合体100、及び未結合の第二の種類の粒子130は、第二のプローブ135を介して捕捉スポットA2’と特異的に結合する。第一のプローブ125とも第二のプローブ135とも相補的でない配列のみを含む、第一の固定化されたオリゴヌクレオチドプローブ2010として、いずれの種類の粒子もスポットA1’に結合しない。未結合(すなわち、遊離の)の第二の種類の粒子130が、流体チャネル1020に導入される前にサンプルから取り除かれると仮定すれば、図20に示されるように、第二の種類の粒子を介して特異的な結合を行う利点は、多重粒子複合体のみが、捕捉スポット上に固定化されることである。図3〜6は、未結合の第二の種類の粒子が、図19に示されるように、捕捉配置で使用のためのサンプルから除かれ得る、サンプル調製方法を記述した。
もっとも、図18及び19は、オリゴヌクレオチドプローブを介した特異的な結合を説明し、図18及び19で示される構想は、特異的に結合する分子、例えばペプチド、タンパク質、抗体、アプタマーなどと共に、タンパク質、又は細胞内標的に容易に適用され得ることは、認識される。
さらに図10〜17に関して、図11〜17に示されるステップ後、カートリッジ1010は、その後、光源1065からの励起1060で照射され得る。結果として、一つ又は複数の捕捉スポットA1〜A4上で捕捉された多重粒子複合体100の中で連結した第二の種類の粒子130は、標的検体検出のための画像化システム1050により捕捉され得る励起1060に反応して信号を生成する。
任意で、図20及び21に示されるように、洗浄磁石1910は、「磁気的洗浄」ステップを提供するために用いられ得る。例えば、図20に示されるように、第一の種類の粒子120及び多重粒子複合体100は、図11〜17に図解されるように、段階的な方法でスポットからスポットへと移動されるよりもむしろ、粒子が一つ又は複数の捕捉スポットA1〜A4に同時に定まるように、流体チャネル1020を介して分散され得る。特異的結合プロセスの少なくとも一つは、図18及び19に図解されるように、特定の粒子が一つ又は複数の捕捉スポットA1〜A4上に捕捉されるように、行われ得る。捕捉スポットA1〜A4の一つに特異的に結合しなかった未結合の第一の種類の粒子120及び多重粒子複合体100が、捕捉スポットA1〜A4に近接した画像化ゾーンから取り除かれるように、洗浄磁石1910は、その後、一定時間(例えば、1分)、位置M7で活性化される。例えば、光源1065により与えられる、得られた励起1060、基板1012の配置、及び画像化システム1050の設定について、画像化ゾーンは、その上に捕捉スポットA1〜A4が配置される基板1012の表面からチャネル1012にマイクロメーター未満に広がる領域として定義される(例えば、基板1012を介して照射の全内部反射モードにおける、基板1012を超えるエバネッセント波伝搬の範囲)。未結合の第一の種類の粒子120の画像化ゾーンからの除去は、望ましくない粒子が、磁力によって画像化ゾーンから取り除かれる「磁気的洗浄」として、本質的に機能する。磁場の強度は、捕捉スポットに特異的に結合する粒子が、位置M7から磁場の適用によって取り除かれないように、調整され得る。4つのスポットA1〜A4が図10〜17及び図20〜21に示される一方で、より少ない、又はより多い捕捉スポットは、目的の特定の生体分子に応じて用いられてもよい。
図18に示される磁気的洗浄ステップのさらなる詳細は、図22〜24で説明される。図22〜24に示される状況は、サンプル中のいずれの粒子も、捕捉スポットA2に結合しない一方で、第一の種類の粒子120は、捕捉スポットA1に特異的に結合する点で、図18に示されるそれと同等である。上からの磁力の適用上(例えば、図21に示されるように、位置M7における磁石から)、未結合の粒子及び多重粒子複合体は、図23に示されるように、基板1012の表面から取り除かれる。磁場強度が特異的に結合した粒子を取り除くために十分でない場合、磁気的洗浄ステップは、大変低い非特異的粒子バックグラウンド結合を有する捕捉スポット上で、特異的に結合した粒子をもたらす(図24)。
別の実施形態では、粒子複合体、例えば図1及び2に示されるそれらは、単純な機械的移動を用いて遊離の蛍光粒子から分離され得る。図25〜27は、典型的な手法を説明する。標的検体を含むサンプルが、機能化された第一の種類の粒子120及び機能化された第二の種類の粒子130を含む溶液に導入される場合、図25に示されるように(図25は、先に記述された図4及び8と同様である)、多重粒子複合体100は形成された。特定の場合では、遊離の機能化された第二の種類の粒子130(例えば、遊離の蛍光粒子)を多重粒子複合体100から物理的に分離することが、必要である。この分離は、液体チャンバー2620を集合的に定義付ける基板2612、上部構成要素2614、及びガスケット2616から形成される、カートリッジ2610を用いることにより行われ得る。液体チャンバー2620は、バッファ2625で満たされる。多重粒子複合体100、第一の種類の粒子120、及び第二の種類の粒子130は、図26に示されるように、液体チャンバー2620に導入される。薄いチャネル装置(例えば、チャネルの高さ<0.2ミリメートル)について、対流的混合が最小限になり、粒子の塊が一般的に入口の近くに残る。場反応性粒子(例えば、第一の種類の粒子120及び多重粒子複合体100)が、磁石2650に対して引っ張られるように、磁石2650は、磁力を発揮する。磁石2650の移動(又電磁石のは活性化)は、図27に示されるように、多重粒子複合体100及び第一の種類の粒子120を所望の位置まで移動させるために、その後用いられ得る。このプロセスは、混同する遊離の第一の種類の粒子120の物理的分離を提供する。所望の位置における多重粒子複合体100は、その後、適切な検出方法、例えば蛍光画像化により、分析され得る。
別の実施形態では、高い屈折率の粒子は、図28〜37に示されるように、増幅された光学的な検出信号を作るために用いられ得る。例えば、高い屈折率の粒子−蛍光粒子複合体を伴う指向性の発光信号増幅は、得ることができる。磁性粒子は、高い屈折率の球面レンズとして作用し得、それは、発光粒子に向けて、発光放射を効率的に集束させることに役立つ。あるいは、磁性粒子球面レンズは、発光粒子から放射された光信号を回収し、集束させ得る。
図28〜32は、矢印により表される照射場2810について、多重粒子複合体100の様々な配向性を示す。第一の種類の粒子120は、レンズ効果を提供するように物質の組み合わせかれ形成され得、従って、それを通して伝えられる照射場2810の一部を集束させる。例えば、第一の種類の粒子は、磁性成分、例えばマグネタイト(Spherotech)で含浸された、又はコートされたポリスチレンコア粒子でもよい。従って、照射に応じて検出信号を生成することを設定し得る、第二の種類の粒子130上の照射場2810の入射の量は、第一の種類の粒子120に対する第二の種類の粒子の配向性に依存する。例えば、図28〜30に示されるように、第二の種類の粒子130が照射場2810内で第一の種類の粒子120の「上流」にある場合、従って、第二の種類の粒子130は、それが多重粒子複合体100の部分でないように照射される。しかしながら、第二の種類の粒子130が、図28〜30に示される場合においてよりもより少ない照射を受けるように、多重粒子複合体100の配向性は、第一の種類の粒子120が、第二の種類の粒子130から離れて照射場2810を集束するように、なり得る(図31を参照のこと)。あるいは、図32に示されるように、第二の種類の粒子130が、多重粒子複合体100の他の配向性においてよりもより激しく照射されるように、第二の種類の粒子130は、照射場2810が第一の粒子120により集束される領域内にあり得る。
加えて、図33〜37に示されるように、第二の種類の粒子130により生成された信号はまた、第一の種類の粒子120により与えられるレンズ効果により、影響を受け得る。それ故、第二の種類の粒子130により生成された信号3310(矢印により示される)の同じ量について、観測器3320に達する信号3310の量は、多重粒子複合体100の配向性に依存する。例えば、図33に示されるように、第一の種類の粒子120が、第二の種類の粒子130と観測器3320の間で、信号3310の進路において直行的である場合、第一の種類の粒子120は、観測器3320に達する信号3310の量を増大するように、信号3310を屈折させ得る。あるいは、第一の種類の粒子120が、観測器3320から離れて信号3310を屈させるように、多重粒子複合体は、配向され得、従って、観測器3320に達する信号3310の量は減少する(図34〜37を参照のこと)。集束及び光収集効果は、下記の実施例VIIに実験的に説明される。
集束及び光収集効果の双方は、多重粒子複合体検出の感度を著しく向上させるために、検出システムに用いられ得る。検出器(例えば、CCD又はCMOSカメラ)に対して適切に配向している場合、測定される発光信号は、単離され多発光粒子からの信号に対して、著しく増幅され得る。例えば、多重粒子複合体は、溶液中で、回転することが許容され得る。照射源及び検出器に対する多重粒子複合体の配向性に応じて、この回転効果は、発光粒子における照射強度入射を著しく変化させ得る。同様に、発光の間、磁性粒子球体レンズは、粒子複合体の配向性に連結した方向に、光を集束する又は向かわせる役割を果たし得る。
図28〜37に図解される信号増幅効果の高い指向性特性のために、回転する多重粒子複合体は、画像化検出器、例えばCMOS又はCCDカメラを用いて可視化される場合、フラッシュするように見える。遊離の蛍光粒子(すなわち、多重粒子複合体において、磁性粒子と連結しない蛍光粒子)は、そのようなフラッシュ効果を示さず、代わりに定常状態の蛍光発光を示す。多重粒子複合体において磁性粒子と結合した場合、フラッシングする粒子は(それらの「明るい」方向に捕捉される場合)、遊離の蛍光粒子よりも物理的に大きく、より強く見える蛍光発光を示す。さらに、粒子対は、放出された光検出を増加させるために、検出器に対して意図的に方向付けられ得る。粒子対は、例えば磁場及び流体力を用いて方向付けられ得る。
この局所的な粒子レンズ効果は、高い屈折率の粒子の使用により、著しく増幅されることは指摘され得る。一つの実施形態では、磁性ポリマーマイクロスフェアは、非磁性ポリマーマイクロスフェアよりも高い効果的な屈折率を示す。例えば、マイクロスフェア内の磁性鉄の組み込みは、マイクロスフェアの効果的な屈折率を増加させ得、従って、強力な集束効果を生じる。この実施形態に記述される粒子の径範囲について、磁性ポリマーマイクロスフェアは、同じ直径の非磁性ポリマーマイクロスフェアと比較して、著しい信号増幅を与える。この信号増幅効果は、下記に述べる実施例VIIIで実験的に実証される。
本技術の典型的な実施形態の実施のいくつかの例は、本明細書で開示される。これらの記述的実施例は、限定することなく、説明することを意図する。本明細書で述べられる特定の量及び化学物質は、当業者により理解されるように、代表的なものに過ぎない。
実施例I:迅速で特異的なDNA標的濃縮及び検出
本技術のこの実施例は、オリゴヌクレオチドサンドイッチアッセイ及び二つの粒子捕捉及び検出フォーマットを用いた標的DNAの検出を説明する。磁性粒子は、DNA標的の部分に特異的な50ヌクレオチド一本鎖DNA捕捉配列(「捕捉プローブ」)で機能化された。「検出プローブ」は、捕捉配列に隣接したDNA標的の部分に特異的な50ヌクレオチドビオチン化DNA配列であった。DNA標的の存在下で、捕捉及び検出プローブは、標的の隣接した部分に特異的にハイブリダイズし、サンドイッチを形成する。粒子複合体は、ビオチン化検出プローブと結合する、アビジン機能化蛍光粒子を添加することにより形成される。核酸プローブ配列は、表1に提供され、実験的詳細は、ここで提供される。一つの例では、標的検体/粒子複合体は、周囲の重力により受動的な沈殿により検出表面に運ばれ得る。別の手法では、標的検体/粒子複合体は、遠心分離による能動的な沈殿により検出表面に運ばれ得る。別の手法では、標的検体/粒子複合体は、二次元表面の下から磁力を適用し、磁石、従って粒子複合体を分析的領域に移動させることにより、二次元表面に沿って分析的領域に移動され得る。
本技術のこの実施例は、オリゴヌクレオチドサンドイッチアッセイ及び二つの粒子捕捉及び検出フォーマットを用いた標的DNAの検出を説明する。磁性粒子は、DNA標的の部分に特異的な50ヌクレオチド一本鎖DNA捕捉配列(「捕捉プローブ」)で機能化された。「検出プローブ」は、捕捉配列に隣接したDNA標的の部分に特異的な50ヌクレオチドビオチン化DNA配列であった。DNA標的の存在下で、捕捉及び検出プローブは、標的の隣接した部分に特異的にハイブリダイズし、サンドイッチを形成する。粒子複合体は、ビオチン化検出プローブと結合する、アビジン機能化蛍光粒子を添加することにより形成される。核酸プローブ配列は、表1に提供され、実験的詳細は、ここで提供される。一つの例では、標的検体/粒子複合体は、周囲の重力により受動的な沈殿により検出表面に運ばれ得る。別の手法では、標的検体/粒子複合体は、遠心分離による能動的な沈殿により検出表面に運ばれ得る。別の手法では、標的検体/粒子複合体は、二次元表面の下から磁力を適用し、磁石、従って粒子複合体を分析的領域に移動させることにより、二次元表面に沿って分析的領域に移動され得る。
磁性粒子機能化。磁性粒子は、下記のプロトコールを用いて、アミン機能化したDNAプローブでコートされた。100マイクロリットルの1マイクロメーター直径の磁性粒子(Dynabead(登録商標)MyOne Carboxylic Acid,Invitrogen)の10mg/ml溶液は、1.7mlマイクロ遠心チューブに移された。チューブは、チューブの側壁にビーズを濃縮するために、磁気的分離装置(Invitrogen Dynal)中に置かれた。液体は取り除かれ、粒子は水に再懸濁された。この洗浄ステップは、水で繰り返され、その後、粒子は200マイクロリットルの0.1M MES(2−モルホリノエタンスルホン酸、Fluka)、pH5.2に懸濁された。100マイクロリットルの10mg/ml 1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC、Pierce)、及び100マイクロリットルの10mg/ml スルホ−N−ヒドロキシスクシンイミド(スルホ−NHS、Pierce)は、磁性粒子溶液に添加された。溶液は、回転することにより30分間混合された。チューブは、その後、磁気的分離装置中に置かれ、液体は取り除かれた。粒子はその後、0.1Mリン酸バッファ、pH8.0中の500マイクロモーラーのアミン修飾捕捉プローブ(表1参照のこと)の100マイクロリットルの溶液に懸濁された。溶液は、回転装置上で、室温で、3時間混合された。チューブは、その後、磁気的分離装置中に置かれ、液体は取り除かれた。粒子はその後、それぞれのステップについて磁気的分離装置を用いて、1X PBS、0.05%Tween20(PBST)で、3回洗浄された。粒子は、その後、1X PBS、0.3モーラー塩化ナトリウム(NaCI)、20マイクログラム/mlのニシン精子DNA(Sigma−Aldrich)、200マイクログラム/mlのウシ血清アルブミン(BSA、Sigma−Aldrich)、及び0.05%Tween20(Pierce)を含む、ビーズバッファ(「BB」)に再懸濁された。この時点における粒子の濃度は、1mg/mlであった。機能化された粒子は、4℃で保存された。
蛍光粒子機能化。蛍光粒子(Thermo,Dark Red,0.39マイクロメーター、2%wt/vol)は、4℃で4時間、0.2モーラーのリン酸ナトリウム中、100マイクロリットルの0.2mg/mlのNeutrAvidin(Pierce)を含む100マイクロリットルの粒子ストック溶液と、混合することにより、機能化された。200マイクロリットルのBBは添加された。溶液は、0.1マイクロメーター精密濾過遠心チューブ(Millipore)に移され、6000rpmで8分間遠心分離された(Fisher Scientific Accuspin Micro17遠心分離機)。粒子は、ビーズバッファに再懸濁され、濾過ステップは、2回繰りかえされた(すなわち、全部で3回の洗浄)。粒子はその後、ビーズバッファに再懸濁され、0.1%w/vの濃度で、4℃で保管された。
標的DNA捕捉。標的DNAは、捕捉プローブ修飾された磁性粒子上で捕捉された。ビオチン化検出プローブは、ハイブリダイゼーションの最中に添加された。NeutrAvidinコートされた蛍光粒子は、完全なサンドイッチを完了するために、ハイブリダイゼーション後に添加された。
合成標的DNA C05 d100tar(IDT、表1、実施例I)は、インフルエンザH1N1ゲノムの一部に由来する。捕捉オリゴヌクレオチド(すなわち、捕捉プローブ)は、標的DNAの5’末端に相補的であり、Integrated DNA Technologies,Inc.(IDT,Inc.)により、C6−アミン3’修飾(表1中の捕捉プローブc05 5pcomp 50)を伴って、合成された。ビオチン化検出オリゴヌクレオチド(検出プローブ)は、標的DNAの3’末端に相補的であり、5’C6−アミン誘導体として(表1中の検出プローブc05 3pcomp50)、IDT,Inc.により合成された。ビオチンは、スルホ−NHS−LC−ビオチン(Pierce)との反応によりこの配列に結合した。
アッセイプロトコール。標的DNAの希釈物は、2ナノモーラーのビオチン化検出プローブを含む、ハイブリダイゼーションバッファ(「HB」)である(3X SSPE(生理食塩水−リン酸ナトリウム−エチレンジアミン四酢酸(「EDTA」))バッファ0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(「SDS」))、100マイクログラム/ml BSA、及び20マイクログラム/mlのニシン精子DNA(「hsDNA」))中で2E6捕捉プローブ修飾された磁性粒子と混合され、55℃で1100rpmで2時間、回転するヒートブロック上で混合され、粒子/捕捉プローブ/標的/検出プローブ複合体の形成を許容した。
粒子複合体は、その後、下記のように、永久磁石及び液体交換を用いて洗浄された。上清は、取り除かれ、粒子は、3X SSPE、0.1%SDS(1X)に再懸濁された。これは、続いてPBSHT(1X PBS、500ミリモーラーNaCI、2mg/ml BSA、20μg/ml hsDNA、0.05%Tween20)で2回洗浄(上清交換)された。粒子は、その後、100マイクロリットルのPBSHTで懸濁され、2E8 NeutrAvidin−蛍光粒子が添加された。溶液は、室温で15分間、回転装置上で混合され、ビオチン−NeutrAvidin結合を許容した。磁性−蛍光粒子複合体はこのステップで形成され、標的DNAは粒子間で連結を形成した。
粒子複合体は、磁気的単離によりPBSHTにより3回洗浄され、100マイクロリットルのPBSHT中の最後の再懸濁を含む上清は除去された。それぞれの反応の全体の容量は、384ウェルプレートの別々のウェルに移され、棒磁石は、粒子複合体をウェルの底表面に引き寄せるために用いられた。この洗浄手順は、残った蛍光粒子のみが、標的との相互作用を介して磁性粒子と複合体化するそれらとなるように、未結合の蛍光粒子を取り除く。
粒子複合体は、20X対物レンズ、及びCy5フィルターを備えた落射蛍光顕微鏡(Olympus IX−71)上で画像化することにより定量化される。画像における粒子複合体は、オープンソースソフトウェアImageJにおいて開発された粒子計測ツールを用いて自動的に計測される。結果は、図38に表され、約1フェムトモーラー標的で検出限界を有する、得られた滴定曲線が示される。
本実施例では、1マイクロメーターの直径の磁性粒子が、典型的な実証に用いられた。あるいは、0.01〜20マイクロメーターの範囲の直径の磁性粒子が用いられてもよい。あるいは、0.2〜10マイクロメーターの範囲の直径の磁性粒子が用いられてもよい。あるいは、0.3〜6マイクロメーターの範囲の直径の磁性粒子が用いられてもよい。磁性粒子径分布は、単分散でもよいことはまた、指摘される。あるいは、磁性粒子径の範囲は、同時に用いられてもよい。非球形磁性粒子が用いられてでもよいことはまた、指摘される。
本実施例では、市販の単分散のポリマーシェル超常磁性粒子が、典型的な実証として用いられた。代替の磁性粒子の種類は、この発明に用いられてもよい。代替の磁性粒子マトリックス物質は、ラテックス、ポリスチレン、アガロース、及び他のポリマー、シリカ及びシリカ系ガラス組成物、酸化鉄を含む酸化物、及びセラミックスを含む。磁性粒子はまた、複合構造、例えばコア‐シェル粒子(例えば、有機ポリマーシェルを供えた金属又は金属酸化物コア)、及び金属酸化物サブ粒子が組み込まれたポリマーでもよい。
本実施例では、磁性粒子機能化は、典型的な実証として、EDC−NHSエステル化学構造を有するアミン修飾オリゴヌクレオチドを用いて行われた。あるいは、アミン反応性結合化学反応は、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、スルホニルクロリド、アルデヒド、グリオキサル、エポキシド、オキシラン、カルボナート、アリール化試薬、イミドエステル、カルボジイミド、及び無水物(anyhydride)に基づくそれらを含む。アミン修飾オリゴヌクレオチドに代わるものとして、チオール修飾オリゴヌクレオチドは用いられてもよい。用いられ得る代替のチオール修飾反応性結合化学反応は、ハロアセチル及びアルキルハロゲン化物誘導体、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化試薬、及びチオール−ジスルフィド交換試薬に基づくそれらを含む。別のアミン修飾オリゴヌクレオチドに代わるものとして、カルボン酸修飾オリゴヌクレオチドは用いられてもよい。用いられ得る代替のカルボン酸修飾反応性結合化学反応は、ジアゾアルカン及びジアゾアセチル化合物、カルボニルジイミダゾール、及びカルボジイミドを含む。別のアミン修飾オリゴヌクレオチドに代わるものとして、ヒドロキシル修飾オリゴヌクレオチドは用いられてもよい。用いられ得る代替のヒドロキシル反応性結合化学反応は、エポキシド及びオキシラン、カルボニルジイミダゾール、N,N’−ジスクシンイミジルカルボナート、アルキルハロゲン、イソシアネート、又は酸化化学を含む。別のアミン修飾オリゴヌクレオチドに代わるものとして、アルデヒド修飾又はケトン修飾オリゴヌクレオチドは用いられてもよい。用いられ得る代替のアルデヒド反応性又はケトン反応性結合化学反応は、ヒドラジン誘導体、シッフ塩基形成、還元的アミノ化、及びマンニッヒ縮合を含む。別のアミン修飾オリゴヌクレオチドに代わるものとして、光反応性オリゴヌクレオチドは用いられてもよい。用いられ得る代替の光反応性結合化学反応は、アリールアジド及びハロゲン化アリールアジド、ベンゾフェノン、ジアゾ化合物、及びジアジリン誘導体を含む。
本実施例では、0.39マイクロメーター直径の蛍光粒子は、典型的な実証として用いられた。あるいは、0.01〜20マイクロメーターの直径範囲の蛍光粒子が用いられてもよい。あるいは、0.2〜10マイクロメーターの直径範囲の蛍光粒子が用いられてもよい。あるいは、0.3〜6マイクロメーターの直径範囲の蛍光粒子が用いられてもよい。蛍光粒子径分布は、単分散であってもよいことはまた、指摘される。あるいは、蛍光粒子径の範囲は、同時に用いられてもよい。非球状の蛍光粒子が用いられてもよいことはまた、指摘される。
本実施例に用いられるDark Red(Thermo)蛍光粒子製品は、640/660nmにおいて中心となる励起/発光波長を有する。代替の蛍光色素は、スペクトルの青色の部分(励起360〜420nm、及び発光420〜480nm);スペクトルの緑色の部分(励起450〜500nm、及び発光500〜540nm);又はスペクトルの赤色の部分(励起540〜590nm、及び発光590〜640nm);で用いられてもよい。別の代替の蛍光色素は、発光波長>700nmのスペクトラム、例えばLi−Cor Biosciences製の製品を用いて、赤外の部分で用いられてもよい。本実施例に用いられる蛍光粒子は、有機色素蛍光分子に基づいてもよい。代替の発光分子は、用いられてもよく、ランタニド、例えば放射体に基づくユウロピウム、エルビウム、及びテルビウム、並びに放射体に基づく半導体、例えば量子ドットを含んでもよい。
本実施例では、検出プローブは、NeutrAvidin蛍光粒子と後に結合するビオチン化オリゴヌクレオチドであった。あるいは、この実施例における蛍光粒子は、ストレプトアビジン、又はアビジンで修飾されてもよい。あるいは、この実施例における蛍光粒子は、アッセイの前に、検出オリゴヌクレオチドと直接に結合してもよい。代替の蛍光粒子機能化化学物質は、磁性粒子機能化について上述したそれらと同様である。
本実施例におけるDNA標的は、典型的な実証として用いられる合成100ヌクレオチド配列であった。あるいは、DNA標的は、最短で30ヌクレオチド長を有する任意のDNA分子でもよい。あるいは、DNA標的は、30〜5000ヌクレオチド長であってもよい。
この実施例に用いられる捕捉及び検出プローブ長は、6個の炭素リンカーを有する50のヌクレオチド長であった。あるいは、オリゴヌクレオチドプローブは、10〜100のヌクレオチド長でもよい。あるいは、オリゴヌクレオチドプローブは、20〜70のヌクレオチド長でもよい。
本実施例におけるハイブリダイゼーション反応は、典型的な実証として、55℃で、1100rpmで回転するヒートブロックを用いて行われた。あるいは、ハイブリダイゼーション反応は、機械的混合(回転)することなく行われてもよい。あるいは、ハイブリダイゼーション反応は、4〜65℃の温度範囲で行われてもよい。あるいは、ハイブリダイゼーション反応は、25〜55℃の温度範囲で行われてもよい。
実施例II:検出表面に対する磁気的濃縮を用いた迅速で特異的なRNA標的検出
実施例IIは、合成RNA標的(Thermo Scientific、配列:PrP 1013−27−1、表1)が、20ナノモーラーの検出プローブと共に、100ピコモーラーで用いられることを除いて、実施例Iの方法を用いてRNA標的の検出を実証した。
実施例IIは、合成RNA標的(Thermo Scientific、配列:PrP 1013−27−1、表1)が、20ナノモーラーの検出プローブと共に、100ピコモーラーで用いられることを除いて、実施例Iの方法を用いてRNA標的の検出を実証した。
フルサンドイッチ検出のために用いられる磁性粒子は、上述のように、DNAプローブ(IDT、表1、実施例II、捕捉プローブ:PrP 1013−27−5)と共有的に連結した。対照磁性粒子は、標的RNAの5’末端に相補的なDNAプローブ(表1、実施例II 対照プローブ:NA−H1N1−6 3p30)で装填された。ビオチン化検出プローブはまた、標的RNAの5’末端に相補的であるので、標的は、捕捉プローブ粒子とハイブリダイズするが、信号を生成しない。標的の5’末端に相補的である検出プローブは、3’末端上にビオチン及びdT−10スペーサーを含んで(表1、実施例II 検出プローブ:NA−HlNl−6 3p30ビオチン)、IDTから購入された。
4つの異なる条件の全てはこの実験で試験された:1)特異的捕捉プローブ及びRNA標的(ポジティブサンプル);2)非特異的なハイブリダイゼーションを見つけるための、ミスマッチ捕捉プローブ及びRNA標的;3)特異的捕捉プローブ及びRNA標的なし;及び4)ミスマッチ捕捉プローブ及びRNA標的なし。最後の二つの条件は、非特異的な粒子−粒子相互作用を評価する。
アッセイプロトコールは、実施例I記述される通りであった。それぞれの粒子懸濁液は、マイクロプレートウェルに移され、上述のように倒立蛍光顕微鏡で画像化された。100ピコモーラーRNA標的、及び相補的な捕捉及び検出プローブを含むウェルは、実質的な蛍光ビーズカウントを検知した一方で、ゼロDNA又はミスマッチプローブを含むウェルにおいては、信号は観察されなかった。
上述のバリエーションはまた、実施例Iについて、本実施例に適用可能である。
実施例III:磁気的濃縮、特異的なマイクロアレイ表面捕捉、及び磁気的洗浄を用いた、迅速で特異的なDNA標的検出
実施例IIIは、迅速なハイブリダイゼーションに続く、マイクロアレイ表面上の捕捉スポットのアレイとの選択的な表面結合を実証する。この実験は、実施例Iにおいてと同様のDNA標的配列、捕捉プローブ、磁性粒子、及びビオチン化プローブが用いられた。
実施例IIIは、迅速なハイブリダイゼーションに続く、マイクロアレイ表面上の捕捉スポットのアレイとの選択的な表面結合を実証する。この実験は、実施例Iにおいてと同様のDNA標的配列、捕捉プローブ、磁性粒子、及びビオチン化プローブが用いられた。
4つのアミン機能化プローブは、Bio−Dot非接触マイクロアレイヤーロボットを用いて、カスタム−活性化アッセイ装置基板上にスポットされた。この実施例については、装置基板は、積分光組みレンズを備えた、環状オレフィンポリマー(COP)平面導波路、約70mm x25mm x1mmであった。カスタム活性化は、COP導波路上に酸素プラズマ処理を最初に行うことによりされ、続いて、エポキシ基で活性化されたアミン反応性表面を形成するために、(3−グリシドキシプロピル)トリエトキシシランでシラン化がされた。代替の装置基板は、ガラス、セラミックス、又はポリマー、例えばポリスチレン又はアクリルから作れられた透明な平面構成物を含む。代替のシラン化試薬は、アミノプロピルシラン、アルデヒドシラン、ビニルシラン、ビニルスルホンシラン、アクリレートシラン、メタクリレートシラン、メルカプトシラン、ヒドロキシルシラン、カルボキシシラン、アジドシランを含む。あるいは、表面活性化は、活性末端基を含むポリエチレングリコールポリマーを含む、表面上のポリマー化、又はポリマーグラフト化を介してであり得る。
アレイは、3X4のアレイのために、それぞれのプローブの3スポットでプリントされた。4つの表面捕捉プローブのうちの一つは、磁性粒子上に固定化されたプローブと相補的である。他の3つの表面捕捉プローブは、非相補的なミスマッチである。全ての表面捕捉プローブは、3’−アミンリンカー及びdT−9スペーサーを含んで、IDTから購入され、表1、実施例IIIに記述される。
3つのサンプルは、1ミリリットルのHB、上述のように捕捉プローブで装填された1E7磁性粒子、及び5ナノモーラーのビオチン化検出プローブを含む1.5mlマイクロ遠心チューブに調製された。標的DNAは、200フェムトモーラー及び20フェムトモーラーの濃度を与えるように添加された。3つ目のサンプルチューブは標的DNAを含まなかった(ゼロ対照)。
サンプルは、1200rpmで、サーモミキサー(Eppendorf)上で、55℃で1時間混合された。粒子は、その後、HBで1回、BBで2回リンスされた。粒子は、その後、90マイクロリットルのBBに懸濁された。10マイクロリットルのNeutrAvidin修飾蛍光粒子は、サンプルあたり5E8蛍光粒子の濃度について添加された。サンプルは、回転装置(Barnstead/Thermolyne Labquake)上で、15分転倒して回転され、磁気的分離装置を用いてBBで2回リンスされ、約4マイクロリットルのBBに懸濁された。
アッセイを実施するために、図10〜17に図解されるのと同様のカートリッジアッセンブリが用いられた。特に、プラスチックマイクロアレイ基板は、加圧反応性接着ガスケットでプラスチック液体上部構成部品に組み立てられ、アレイの上部の流体チャネルを定義付けた。チャネルは100マイクロリットルのBBで前もって充填された。2マイクロリットルのサンプルは、流動チャネルの入口に添加された。電磁石は、マイクロアレイの約2mm上流の位置に置かれ(例えば、位置M0)、磁石への出力は、12Vに調整され、200マイクロリットルのBBが入口に添加された。磁性粒子がマイクロアレイの上流で磁石の位置に濃縮された一方で、BBの添加はチャネルを介して流れを引き起こした(図12に示されるように)。電磁は、その後オフにされ、スポットの第一の列の直下の位置に移動された(C05−TR1SC特異的スポット;図10及び13に示されるように位置M1)。磁石は、6V DC(2アンペア電力供給)の出力で、約5秒間、電源が入れられた。粒子はスポットの第一列を超えて移動し、及び磁石はその後、オフにされた。20秒後、磁石はスポットの第二列の下に置かれ(C18−TR1SC;図10及び14に示される位置M2)、5秒間、電源が入れられた(6V)。粒子がスポットのそれぞれの列を超えて置かれるまで、この手順は、繰り返された。スライドはその後、前の実験においてのように、蛍光顕微鏡で画像化された。
最初の画像化後、棒形状の磁石は、マイクロアレイの上(例えば、図21に示されるように位置M7に)に1分間置かれた。磁力のこの適用は、図20〜24に関して先述のように、「磁気的洗浄」として機能する。すなわち、アレイスポットに特異的に結合しない磁性粒子は、チャネルを通って移動し、画像化ゾーンの外に出て、従って非特異的に吸着された粒子を磁気的に洗浄する。磁場の強度は、磁場の適用のために、特異的に結合した粒子が取り除かれないように、調整され得る。カートリッジは、画像化システムを用いて画像化され、その後、サンプルあたりのそれぞれの捕捉スポットにおける粒子対は、画像分析ソフトウェア(ImageJ)を用いて数えられた。得られる画像分析は、同種の特異的なアレイスポット上での特異的な信号、及びミスマッチスポット上での極めて少ない信号を得た。
上述のバリエーションはまた、実施例Iについて、本実施例に適用可能である。
実施例IV:導波路に基づく蛍光検出を用いた迅速で特異的なRNA標的検出
この実施例では、特異的粒子複合体検出は、平面導波路に基づく検出システムに関連して実証される。この実験に用いられる物質及び一般的な方法は、実施例IIに記載されるものと同様であった。3つのサンプルが実施された:1)10ピコモーラー標的サンプル;2)100フェムトモーラー標的サンプル;3)ゼロ標的対照。他の実験のように、顕微鏡上でマイクロタイタープレートウェルの底部において画像化する場合、ゼロ標的対照は、ごくわずかの粒子対を有する。10ピコモーラー標的サンプルは、その後、マイクロアレイ上で粒子対の捕捉を試験するために用いられた。マイクロアレイは、表1、実施例IVに記載されるように、3つの異なる捕捉プローブを含んだ。
この実施例では、特異的粒子複合体検出は、平面導波路に基づく検出システムに関連して実証される。この実験に用いられる物質及び一般的な方法は、実施例IIに記載されるものと同様であった。3つのサンプルが実施された:1)10ピコモーラー標的サンプル;2)100フェムトモーラー標的サンプル;3)ゼロ標的対照。他の実験のように、顕微鏡上でマイクロタイタープレートウェルの底部において画像化する場合、ゼロ標的対照は、ごくわずかの粒子対を有する。10ピコモーラー標的サンプルは、その後、マイクロアレイ上で粒子対の捕捉を試験するために用いられた。マイクロアレイは、表1、実施例IVに記載されるように、3つの異なる捕捉プローブを含んだ。
スライドは、図39に概略的にしめされる装置を用いる導波路照射を用いて画像化された。図39に示されるように、サンプル調製及び検出システム3900は、カートリッジアセンブリ3910を含み、それは、屈折ボリューム3915、上部の構成部分3914、及び流体チャネル3920を定義するガスケット3916と共に、平面導波路3912を含む。流体チャネル3920は、入口3930、及び出口3940を含む。システム3900はさらに、画像化システム3950を含み、それは例えば、一つ又は複数の屈折要素、回折要素、反射要素、フィルター、及びセンサを順に含み得る。システム3900はまた、励起源3965により供給される励起エネルギー3960(矢印により表される)を含む。励起源3965は、例えば、レーザー、LED、又は他の好適な励起エネルギー源でもよい。図39に示されるように、捕捉スポット3970のアレイは、標的検体(又は標的検体を含む多重粒子複合体3980)が一つ又は複数の捕捉スポット3970で捕捉され得るように、流体チャネル3920内に平面導波路3912の表面に取り付けられた。実験では、粒子複合体は、特異的なNA−H1N1−6 3p30 COMP−NH2スポット上でのみ検出された。
上述のバリエーションはまた、実施例I及びIIIについて、本実施例に適用可能である。
実施例V:特異的マイクロアレイ捕捉を用いた、多重化された迅速で特異的なDNA標的検出
別の実施形態では、粒子対の混合物は、多数の様々な標的検体を含むサンプルに添加された。標的検体/粒子複合体は、実施例IVに記述されるように、様々な粒子プローブに特異的な捕捉スポットのアレイを含む流体チャンバーに添加された。捕捉スポット上で測定される信号は、原溶液中の標的検体の存在及び量を示す。
別の実施形態では、粒子対の混合物は、多数の様々な標的検体を含むサンプルに添加された。標的検体/粒子複合体は、実施例IVに記述されるように、様々な粒子プローブに特異的な捕捉スポットのアレイを含む流体チャンバーに添加された。捕捉スポット上で測定される信号は、原溶液中の標的検体の存在及び量を示す。
この実施例は、標的検体との関連において機能化された粒子の混合物の使用を実証する。粒子の混合物は、4つの可能性のある核酸標的(表1、実施例Vを参照のこと)についてプローブを用いて調製された。それぞれの可能性のある標的について、混合物は、特異的な捕捉プローブ及びビオチン化検出プローブを有する磁性粒子を含む。それぞれの磁性粒子の種類は、2E+06粒子/mlの濃度であり、それぞれのビオチン化プローブは、10ナノモーラー濃度であった。従って、混合物中において合計で8つの異なるプローブ配列のために、4つの磁性ビーズ捕捉配列種類、及び4つのビオチン化検出配列種類が存在した。
基板は、磁性粒子上のプローブに相補的な配列を有数するマイクロアレイをプリントすることにより調製された(図18に示される表1;捕捉配置に提供される配列)。
アッセイは、100フェムトモーラーの濃度で4つの可能性のある標的の一つ(配列C05)を添加することにより行われた。アッセイステップ及び、マイクロアレイは、実施例IIIにおいてと同様であった。処理された基板は、蛍光顕微鏡を用いて画像化され、粒子複合体は、画像分析ソフトウェア(Image J)を用いて数えられた。代表的な結果は、図41に提供される。結果は、信号が、正確な相補的なスポットにおいて強いことを示す。ミスマッチスポットは、スポットのないバックグラウンドに対して最小限の信号を示す。
上述のバリエーションはまた、実施例I及びIIIについて、本実施例に適用可能である。
実施例VI:粒子複合的手法を用いたタンパク質標的の検出
この実施例は、システムがタンパク質標的を検出するために用いられ得ることを実証する。この実施例では、標的は、抗体である。200マイクロリットルのDynabeads MyOne Streptavidin T1(Life Technologies)は、1.7mlマイクロ遠心チューブにおいて磁気的分離を用いて、100ミリモーラーのpH7.2のリン酸でリンスされ、その後、200マイクロリットルのpH7.2のリン酸バッファに懸濁された。20マイクロリットルの1mg/mlのビオチン化ロバ抗ウサギIgGは、粒子に添加され、それは、サーモミキサー上で、900rpm、室温で1時間混合された。粒子は、その後、磁気的分離を用いてPBT(1X PBS、10mg/ml BSA、0.05%Tween20)で4回リンスされた。
この実施例は、システムがタンパク質標的を検出するために用いられ得ることを実証する。この実施例では、標的は、抗体である。200マイクロリットルのDynabeads MyOne Streptavidin T1(Life Technologies)は、1.7mlマイクロ遠心チューブにおいて磁気的分離を用いて、100ミリモーラーのpH7.2のリン酸でリンスされ、その後、200マイクロリットルのpH7.2のリン酸バッファに懸濁された。20マイクロリットルの1mg/mlのビオチン化ロバ抗ウサギIgGは、粒子に添加され、それは、サーモミキサー上で、900rpm、室温で1時間混合された。粒子は、その後、磁気的分離を用いてPBT(1X PBS、10mg/ml BSA、0.05%Tween20)で4回リンスされた。
100マイクロリットルの蛍光粒子(Duke Sci.,FR3040PA,0.39μm Dark Red Fluorescent polystyrene,2%w/v)は、20μlの1:5の割合でのオボアルブミン(OVA)及びウシ血清アルブミン(BSA)(1mg/ml OVA:5mg/ml BSA)の混合物で装填された。OVA/BSA溶液は、粒子に添加され、混合物は4℃で一晩インキュベートされ、その後、PBTで、0.1マイクロメーターのスピンフィルター(Amicon)によって、4回リンスされた。それぞれのリンスについて、400マイクロリットルのPBTバッファが添加され、フィルターチューブは、5000rpmで5分間遠心分離された。濾液は棄てられ、別の400マイクロリットルのPBTバッファが粒子を含む上部のチャンバーに添加された。粒子はその後、200マイクロリットルのPBTに懸濁され、1%w/v懸濁液を得た。
このアッセイについての検体は、ウサギ抗アルブミンIgGであった。128、32、8、2、0.5、及び0pg/mlの標的溶液を作るために、ウサギ抗オボアルブミンの1:4の段階希釈は、BBで調製された。
アッセイステップ。1マイクロリットルの磁性粒子(10mg/mlストック)は、1.7mlマイクロ遠心チューブ中の800マイクロリットルのサンプルにそれぞれ添加された。サンプルは、室温で1時間混合された(Barnstead/Thermolyne labquake)。粒子は、その後磁気的分離により分離され、上清は取り除かれた。100マイクロリットルのBBは添加され、10マイクロリットルのオボアルブミン修飾された蛍光粒子1:10希釈物は添加され、反応物は回転装置上で15分間混合された。200マイクロリットルのBBは添加され、チューブは磁気的分離装置に置かれ、99%の上清は取り除かれた。200マイクロリットルのBBは、その後添加され、サンプルは、96ウェルプレートに移された。ハンドヘルド磁石は、ウェルの底部上の磁性粒子、及び磁性粒子−蛍光粒子対を濃縮するために用いられた。サンプルウェルは、その後蛍光顕微鏡で画像化された。代表的な結果は、図41に提供される。この予備的実験は、約10ピコグラム/ml抗体標的の検出限界を示す。
本実施例では、1マイクロメーターの直径の磁性粒子が、典型的な実証に用いられた。あるいは、0.01〜20マイクロメーターの直径範囲の磁性粒子が用いられ得る。あるいは、0.2〜10マイクロメーターの直径範囲の磁性粒子が用いられ得る。あるいは、0.3〜6マイクロメーターの直径範囲の磁性粒子が用いられ得る。磁性粒子径分布は、単分散でもよいことはまた、指摘される。あるいは、磁性粒子径の範囲は、同時に用いられ得る。非球形磁性粒子が用いられ得ることはまた、指摘される。
本実施例では、商業的に入手可能な単分散のポリマーシェル超常磁性粒子は、典型的な実証として用いられた。代替の磁性粒子の種類は、この発明に用いられてもよい。代替の磁性粒子マトリックス物質は、ラテックス、ポリスチレン、アガロース、及び他のポリマー、シリカ及びシリカ系ガラス組成物、酸化鉄を含む酸化物、及びセラミックスを含む。磁性粒子はまた、複合構造、例えばコア‐シェル粒子(例えば、有機ポリマーシェルを供えた金属又は金属酸化物コア)、及び金属酸化物サブ粒子が組み込まれたポリマーであってもよい。
本実施例では、磁性粒子は、ビオチン化抗体の固定化を提供するためにストレプトアビジンで機能化された。ビオチン−ストレプトアビジン結合のいくつかの代替は、タンパク質−粒子結合に用いられ得る。あるいは、アミン反応性結合化学反応は、スクシンイミドエステルに基づくそれら、例えば、NHS、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、スルホニルクロリド、アルデヒド、グリオキサル、エポキシド、オキシラン、カルボナート、アリール化試薬、イミドエステル、カルボジイミド、及び無水物(anyhydride)を含む。用いられ得る代替のチオール反応性結合化学反応は、ハロアセチル及びアルキルハロゲン化物誘導体、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化試薬、及びチオール−ジスルフィド交換試薬に基づくそれらを含む。用いられ得る代替のカルボキシレート反応性結合化学反応は、ジアゾアルカン及びジアゾアセチル化合物、カルボニルジイミダゾール、及びカルボジイミドを含む。用いられ得る代替のヒドロキシル反応性結合化学反応は、エポキシド及びオキシラン、カルボニルジイミダゾール、N,N’−ジスクシンイミジルカルボナート、アルキルハロゲン、イソシアネート、又は酸化化学を含む。用いられ得る代替のアルデヒド反応性又はケトン反応性結合化学反応は、ヒドラジン誘導体、シッフ塩基形成、還元的アミノ化、及びマンニッヒ縮合を含む。用いられ得る代替の光反応性結合化学反応は、アリールアジド及びハロゲン化アリールアジド、ベンゾフェノン、ジアゾ化合物、及びジアジリン誘導体を含む。
本実施例では、0.39マイクロメーター直径の蛍光粒子は、典型的な実証として用いられる。あるいは、0.01〜20マイクロメーターの直径範囲の蛍光粒子が用いられ得る。あるいは、0.2〜10マイクロメーターの直径範囲の蛍光粒子が用いられ得る。あるいは、0.3〜6マイクロメーターの直径範囲の蛍光粒子が用いられ得る。蛍光粒子径分布は、単分散でもよいことはまた、指摘される。あるいは、蛍光粒子径の範囲は、同時に用いられ得る。非球状の蛍光粒子が用いられ得ることはまた、指摘される。
本実施例に用いられるDark Red(Thermo)蛍光粒子製品は、640/660nmにおいて中心となる励起/発光波長を有する。代替の蛍光色素は、スペクトルの青色の部分(励起360〜420nm、及び発光420〜480nm);スペクトルの緑色の部分(励起450〜500nm、及び発光500〜540nm);及びスペクトルの赤色の部分(励起540〜590nm、及び発光590〜640nm);で用いられ得る。別の代替の蛍光色素は、励起波長(発光>700nm)、例えばLi−Cor Biosciences製の製品を用いて、スペクトラムの赤外の部分で用いられてもよい。本実施例に用いられる蛍光粒子は、有機色素蛍光分子に基づく。代替の発光分子は、用いられ得、ランタニド、例えば放射体に基づくユウロピウム、エルビウム、及びテルビウム、並びに放射体に基づく半導体、例えば量子ドットを含む。
本実施例では、蛍光粒子は、粒子とのタンパク質の物理的吸着を介して修飾された。あるいは、タンパク質は、上述のように磁性粒子のために記述される結合化学を介して蛍光粒子と共有結合され得る。
実施例VII:粒子複合体の増幅された蛍光効果の実証
この実験は、粒子複合体との関連で、蛍光粒子信号の指向性増幅を実証する。実験は、大きい直径の粒子が、よりよい顕微鏡観察及び遅いブラウン運動を可能にするために用いられることを除いて、実施例IIに記述されるのと同様である。磁性粒子は、Spherotech製の5.9マイクロメーター直径の粒子であった。蛍光粒子は、先の実施例に記述されるように、NeutrAvidinで標識された、0.39マイクロメーター直径の、Duke Scientific Dark Red粒子であった。
この実験は、粒子複合体との関連で、蛍光粒子信号の指向性増幅を実証する。実験は、大きい直径の粒子が、よりよい顕微鏡観察及び遅いブラウン運動を可能にするために用いられることを除いて、実施例IIに記述されるのと同様である。磁性粒子は、Spherotech製の5.9マイクロメーター直径の粒子であった。蛍光粒子は、先の実施例に記述されるように、NeutrAvidinで標識された、0.39マイクロメーター直径の、Duke Scientific Dark Red粒子であった。
1ナノモーラーRNA標的は、先述の磁性粒子−ビオチン化検出プローブサンドイッチで捕捉された。粒子複合体は、3回リンスされ、NeutrAvidin蛍光ビーズとインキュベートされ、実施例IIに記述されるように、顕微鏡上で画像化する前に、リンスされた。粒子動作を促進するために、ハンドヘルド永久磁石は、画像化されるウェルの近くでゆっくりと前後に振られた。これは、フラッシング効果を導くウェルに回転動作を与えた。
顕微鏡ビデオ捕捉(Retiga冷却CCDカメラを備えたOlympus IX−71蛍光顕微鏡)は、回転する間、1秒あたり約7フレームのフレーム速度で行われた。遊離の蛍光粒子、及び磁性粒子と連結した蛍光粒子の双方を含むビデオ視野は、その後、選択された。個別の画像フレーム内で、画像分析ソフトウェア(Image J)は、回転動作を経た一つの遊離の蛍光粒子、及び一つの磁性粒子と連結した粒子について、積分強度(すなわち、蛍光粒子面積に亘る個別の画素強度の合計)を計算するために用いられた。13の連続するフレームは、この方法で分析された。時間に対する得た積分強度のプロットは、図42に提供される。連結した粒子は、蛍光粒子−磁性粒子対のように非常に大きい強度を示し、検出器に対して様々な方向に回転することが観察された(例えば、図28〜37に示されるように)。積分強度の大きな増加に続いて、強度が減少し、その後、長時間に亘り、別の増加、及び最終的には減少が続く。対照的に、遊離の蛍光粒子は、予測されたように、長時間に亘り、比較的一定の蛍光強度を示す。それは、どのように閾値化分析が遊離の蛍光粒子と磁性−蛍光粒子複合体とを区別するために用いられ得るのか、容易に想像し得る。
上述のバリエーションはまた、実施例Iについて、本実施例に適用可能である。
実施例VIII:高い屈折率の粒子の利点の実証
実施例VIIに記述される粒子は、遊離の蛍光粒子、磁性粒子−蛍光粒子複合体、及び非磁性粒子−蛍光粒子複合体の蛍光強度を比較するための同様の実験に用いられた。後者の場合について、6マイクロメーター直径のポリマーマイクロスフェアは、実施例IIにおける磁性マイクロスフェアについて記述されるように捕捉プローブで機能化された。RNA標的アッセイは、実施例IIですでに述べられたように行われた。多重粒子複合体は、予測されたように、ゼロ標的対照において観察されなかった。多重粒子複合体は、1ピコモーラー及び10ピコモーラーの双方の標的ウェルにおいて観察された。増幅された蛍光効果の証拠は、方向付けられた粒子複合体及び遊離の蛍光粒子について蛍光信号を定量的に測定することにより提示される。画像は、Retiga冷却CCDカメラを備えたOlympus IX−71蛍光顕微鏡上で回収された。所定のカメラ感度及び露出について、遊離の蛍光粒子は、約600相対蛍光単位(「RFU」)の蛍光信号を示し、粒子投影面積(Image J分析)に亘る平均画素強度として報告した。対照的に、磁性粒子−蛍光粒子複合体がそれらの「最も明るい」配置に方向付けられた場合、信号強度は12ビットカメラを飽和する。方向付けられた粒子複合体蛍光は、それ故、遊離の蛍光同等物よりも少なくとも7倍超の強度である。対照的に、非−磁性粒子−蛍光粒子複合体は、どの方向においても蛍光を示さなかった。
実施例VIIに記述される粒子は、遊離の蛍光粒子、磁性粒子−蛍光粒子複合体、及び非磁性粒子−蛍光粒子複合体の蛍光強度を比較するための同様の実験に用いられた。後者の場合について、6マイクロメーター直径のポリマーマイクロスフェアは、実施例IIにおける磁性マイクロスフェアについて記述されるように捕捉プローブで機能化された。RNA標的アッセイは、実施例IIですでに述べられたように行われた。多重粒子複合体は、予測されたように、ゼロ標的対照において観察されなかった。多重粒子複合体は、1ピコモーラー及び10ピコモーラーの双方の標的ウェルにおいて観察された。増幅された蛍光効果の証拠は、方向付けられた粒子複合体及び遊離の蛍光粒子について蛍光信号を定量的に測定することにより提示される。画像は、Retiga冷却CCDカメラを備えたOlympus IX−71蛍光顕微鏡上で回収された。所定のカメラ感度及び露出について、遊離の蛍光粒子は、約600相対蛍光単位(「RFU」)の蛍光信号を示し、粒子投影面積(Image J分析)に亘る平均画素強度として報告した。対照的に、磁性粒子−蛍光粒子複合体がそれらの「最も明るい」配置に方向付けられた場合、信号強度は12ビットカメラを飽和する。方向付けられた粒子複合体蛍光は、それ故、遊離の蛍光同等物よりも少なくとも7倍超の強度である。対照的に、非−磁性粒子−蛍光粒子複合体は、どの方向においても蛍光を示さなかった。
上述のバリエーションはまた、実施例Iについて、本実施例に適用可能である。
実施例IX:インビトロで転写されたRNAの検出
この実施例では、インビトロ反応から転写される1056塩基のRNA分子の直接検出が実証される。T7RNAポリメラーゼプロモーターの隣に位置するインフルエンザAのマトリックス遺伝子由来の配列を含むプラスミドは、それが1056塩基のRNA(InfA−M−1056)の転写のための鋳型になるように、構築された。RNA転写は、市販のキット(Qiagen)を用いて合成され、UV−可視分光法により定量化された。検出実験に用いられる物質及び一般的な方法は、実施例IIに記述されるそれらと同様である。一連の反応における10、3.3、1.1、0.37、0.12、及び0フェムトモーラー標的分子の試験溶液を作るために、ストックInfA−M−1056 RNAの段階希釈物は、作られた。上記のゼロ標的の信号は、最も低い濃度で測定され、図43に示されるように、サブフェムトモーラー濃度までの大きいRNA分子の直接検出を実証する。
この実施例では、インビトロ反応から転写される1056塩基のRNA分子の直接検出が実証される。T7RNAポリメラーゼプロモーターの隣に位置するインフルエンザAのマトリックス遺伝子由来の配列を含むプラスミドは、それが1056塩基のRNA(InfA−M−1056)の転写のための鋳型になるように、構築された。RNA転写は、市販のキット(Qiagen)を用いて合成され、UV−可視分光法により定量化された。検出実験に用いられる物質及び一般的な方法は、実施例IIに記述されるそれらと同様である。一連の反応における10、3.3、1.1、0.37、0.12、及び0フェムトモーラー標的分子の試験溶液を作るために、ストックInfA−M−1056 RNAの段階希釈物は、作られた。上記のゼロ標的の信号は、最も低い濃度で測定され、図43に示されるように、サブフェムトモーラー濃度までの大きいRNA分子の直接検出を実証する。
上述のバリエーションはまた、実施例Iについて、本実施例に適用可能である。
実施例X:ウイルス細胞培養上清からの特異的なRNAの検出
この実施例では、ウイルス細胞培養上清からの特異的RNA標的配列の直接検出が実証される。細胞培養は、インフルエンザAの10株で調製され、全RNAは、標準的な方法により回収された。検出実験に用いられる物質及び一般的な方法は、実施例IIに記述されるそれらと同様である。マトリックス遺伝子に相当する特異的な配列RNAの定量は、実施例IXに記述されるように、参照標準としてIVT−RNA InfA−M−1056を用いたRT−PCR定量アッセイにより測定された。10の上清について、15マイクロリットルの一定分量の0.2マイクロリットルは試験され、全てはゼロ標的対照を上回る信号ウェルを記録した。図44は、2427〜2432と番号付けされた臨床的インフルエンザサンプル由来の10のウイルス上清について、粒子複合体の数(すなわち、カウント)を示す。ゼロ標的対照サンプルは、プロット上に「cntl」として示される。定量データに基づいて、反応あたりの標的分子の数は、3.8E6〜1E7、又は12.6〜33フェムトモーラーに及んだ。カウントは、100〜1000内に存在し、過剰な感度の桁を表した。段階希釈は、一つのサンプルで行われ(図45を参照のこと)、2.4E5分子、又は〜100アトモーラーの標的濃度まで、ゼロ標的対照を上回る測定可能なカウントを示した。
この実施例では、ウイルス細胞培養上清からの特異的RNA標的配列の直接検出が実証される。細胞培養は、インフルエンザAの10株で調製され、全RNAは、標準的な方法により回収された。検出実験に用いられる物質及び一般的な方法は、実施例IIに記述されるそれらと同様である。マトリックス遺伝子に相当する特異的な配列RNAの定量は、実施例IXに記述されるように、参照標準としてIVT−RNA InfA−M−1056を用いたRT−PCR定量アッセイにより測定された。10の上清について、15マイクロリットルの一定分量の0.2マイクロリットルは試験され、全てはゼロ標的対照を上回る信号ウェルを記録した。図44は、2427〜2432と番号付けされた臨床的インフルエンザサンプル由来の10のウイルス上清について、粒子複合体の数(すなわち、カウント)を示す。ゼロ標的対照サンプルは、プロット上に「cntl」として示される。定量データに基づいて、反応あたりの標的分子の数は、3.8E6〜1E7、又は12.6〜33フェムトモーラーに及んだ。カウントは、100〜1000内に存在し、過剰な感度の桁を表した。段階希釈は、一つのサンプルで行われ(図45を参照のこと)、2.4E5分子、又は〜100アトモーラーの標的濃度まで、ゼロ標的対照を上回る測定可能なカウントを示した。
上述のバリエーションはまた、実施例Iについて、本実施例に適用可能である。
実施例XI:改良された磁気的分離を備えたHIV p24抗原の高感度検出
この実施例は、完全に形成された二つのビーズ複合体を単離するために、磁気的分離装置を用いた、抗体サンドイッチ型におけるウイルスタンパク質抗原の高感度検出を実証する。HIV p24タンパク質に対するモノクローナル抗体は、NHS/EDC結合化学により磁性ビーズに共有結合的に機能化された。手短に言えば、2.5E8のCOOH−磁性ビーズ(Life Tech)は、等量の0.1モーラーMESバッファ中10mg/mlスルホ−N−ヒドロキシスクシンイミド(SNHS;Pierce)、及び10mg/ml 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC;Aldrich)で、25℃で30分間混合することにより活性化され、続いてリンスされ、1X PBS+0.05%tween20(PBST)に再懸濁された。20マイクログラムのモノクローナルマウス抗p24抗体は、添加され、25℃で1時間混合された。100マイクログラムのウシ血清アルブミン(BSA;Sigma)は、添加され、30分間混合され、続いて100マイクロリットルのPBST+1%BSAで3回、磁気的にリンスされた。NeutrAvidin(Pierce)は、実施例Iに記述されるように、蛍光ビーズに吸着された(NA−Flビーズ)。第二の抗HIV p24モノクローナル抗体は、スルホNHS−LC−ビオチン(Pierce)を用いた化学的機能化によりビオチン化された。p24抗原(Meridian)の段階希釈物は、0.5マイクログラムの1X PBS+0.05%tween20+90%ウシ胎仔血清(PTS)中ビオチン化抗p24抗体と共に、1E7の抗p24抗体磁性ビーズの混合物に添加され、回転されながら、25℃で、25分間インキュベートされた。サンプルは、磁気的分離により、BB中で3回洗浄され、18マイクロリットルの0.2%NA−Flビーズは、添加され、続いて25℃で10分間インキュベートされた。
この実施例は、完全に形成された二つのビーズ複合体を単離するために、磁気的分離装置を用いた、抗体サンドイッチ型におけるウイルスタンパク質抗原の高感度検出を実証する。HIV p24タンパク質に対するモノクローナル抗体は、NHS/EDC結合化学により磁性ビーズに共有結合的に機能化された。手短に言えば、2.5E8のCOOH−磁性ビーズ(Life Tech)は、等量の0.1モーラーMESバッファ中10mg/mlスルホ−N−ヒドロキシスクシンイミド(SNHS;Pierce)、及び10mg/ml 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC;Aldrich)で、25℃で30分間混合することにより活性化され、続いてリンスされ、1X PBS+0.05%tween20(PBST)に再懸濁された。20マイクログラムのモノクローナルマウス抗p24抗体は、添加され、25℃で1時間混合された。100マイクログラムのウシ血清アルブミン(BSA;Sigma)は、添加され、30分間混合され、続いて100マイクロリットルのPBST+1%BSAで3回、磁気的にリンスされた。NeutrAvidin(Pierce)は、実施例Iに記述されるように、蛍光ビーズに吸着された(NA−Flビーズ)。第二の抗HIV p24モノクローナル抗体は、スルホNHS−LC−ビオチン(Pierce)を用いた化学的機能化によりビオチン化された。p24抗原(Meridian)の段階希釈物は、0.5マイクログラムの1X PBS+0.05%tween20+90%ウシ胎仔血清(PTS)中ビオチン化抗p24抗体と共に、1E7の抗p24抗体磁性ビーズの混合物に添加され、回転されながら、25℃で、25分間インキュベートされた。サンプルは、磁気的分離により、BB中で3回洗浄され、18マイクロリットルの0.2%NA−Flビーズは、添加され、続いて25℃で10分間インキュベートされた。
フローセルは、独自の導波路基板を用いて構成された。未結合の蛍光ビースが磁性ゾーンを通って、離れる一方で、ビーズ/標的混合物の導入が、磁石の上でフローセル中の実質的に全ての多重粒子複合体(すなわち、連結した磁性ビーズ、標的検体、及び蛍光ビーズの組み合わせにより形成された複合体)及び磁性ビーズの固定化を引き起こすように、フローセルは、磁石アライメントの上の第一の位置に置かれた。その後、フローセルは、図25〜27に概念的に図解されるように、実質的に全ての多重粒子複合体及び磁性ビーズがフローセルの床面から画像化ゾーンに移動されるように、フローセルの流体チャネルにおける液体流動の方向に対して直角の方向において磁石配列に対して移動させた。磁気的移動による多重粒子複合体の移動は、残存する遊離の蛍光ビーズから実質的に全てのビーズ複合体を分離する。
フローセルは、磁石配置の第一の位置に置かれ、それぞれのp24検出混合物は、フローセル装置の入口に移された。フローセルは、第二ポジションに〜1mm/秒で移動され、残存する多重粒子複合体は、蛍光顕微鏡で画像化され、先述の実施例(図46を参照のこと)に記述されるように、カスタムImageJマクロにより数えられた。その後、完全に形成された複合体の蛍光ビーズは、カスタムダイオードレーザー/カメラリーダー装置上で導波路照射により画像化され、積分された蛍光信号が記録された(図47参照のこと)。ビーズカウントモードでは、最も低い標的濃度における信号は、ゼロ標的対照信号を優に上回った。低い全体の信号をもたらす積分モードを用いて、従って、バックグラウンドを上回る3つの標準偏差を上回る最初のデータポイントは、1ミリリットル当たり4.4ピコグラムであった。
上述のバリエーションはまた、実施例Iについて、本実施例に適用可能である。
変更は、その範囲から離れることなく、上記の方法及びシステムにおいてなされてもよい。上述の記述に含まれる、又は添付の図面に示される内容は、趣旨を限定することなく、説明として解釈されるべきであることは、従って、指摘されるべきである。添付の特許請求の範囲は、本明細書に記述される遺伝的及び特定の特徴、並びに本方法及びシステムの範囲の記述を網羅することを意図し、それは、言語の問題のように、それらの間に収まると言える。
先述の実施形態のそれぞれは、特定のそれぞれの方向性を有する様々な構成要素を用いて説明されるにもかかわらず、本開示で記述されるようなシステムは、様々な位置及び相互の方向性に位置する様々な構成要素を伴って様々な特定の配置を引き受け得、本開示の趣旨及び範囲内になお残存し得ることは理解されるべきである。さらに、好適な同等物は、様々な構成要素と置き換えて又は加えて用いられてもよく、そのような置換又は追加の構成要素の機能及び使用は、当業者によく知られており、それ故本開示の範囲内であるとみなされる。従って、本実施例は、限定するものではなく、説明として解釈され、本開示は、本明細書で与えられる詳細に限定されることはないが、添付の特許請求の範囲内で変更されてもよい。
Claims (20)
- サンプル調製及び検体検出のためのシステムであって、ここでシステムは以下:
カートリッジ、ここでカートリッジは以下:
液体チャンネル、
導波路、及び
導波路上で、且つ流体チャネル内に配置された捕捉スポット、を含み;
力場生成装置;
画像化システム;及び
液体、ここで液体は以下:
標的検体を潜在的に含むサンプル、
第一の種類の粒子、ここで第一の種類の粒子は、標的検体に特異的である結合部分を含み、且つ力場に応答する、及び
第二の種類の粒子、ここで第二の種類の粒子は、標的検体に特異的である結合部分を含み、且つ信号を生成することが可能である、を含む、
を含む、システムであって、
ここで、サンプルが標的検体を含む場合、標的検体と、第一及び第二の種類の粒子上結合部分との特異的な結合相互作用は、少なくとも一つの第一の種類の粒子、及び少なくとも一つの第二の種類の粒子に、標的検体を介して連結させ、多重粒子複合体を形成し、
ここで、液体が捕捉スポットに接触した場合、多重粒子複合体は、一つ又は複数の捕捉スポットで捕捉されることができ、
ここで、第二の種類の粒子により生成され、且つ画像化システムで捕捉された信号が、サンプル中の標的検体の存在の指標となるように、力場が、第一の種類の粒子、第二の種類の粒子、及び多重粒子複合体の少なくとも一つの操作を可能にする、システム。 - 前記第一の種類の粒子が、磁性粒子であり、ここで力場発生装置が磁石である、請求項1に記載のシステム。
- 前記磁性粒子が磁性成分を含むポリスチレンマイクロスフェアである、請求項2に記載のシステム。
- 前記多重粒子複合体が、指向性の信号増幅を示す、請求項1に記載のシステム。
- 前記第二の種類の粒子が、発光粒子である、請求項1に記載のシステム。
- 前記流体チャネルの少なくとも一部を照射するように、励起エネルギーを供給するための励起源をさらに含み、且つここで、励起エネルギーがそれに入射された場合、第二の種類の粒子が、蛍光信号を生成するために設定される蛍光粒子である、請求項5に記載のシステム。
- 前記導波路が平面導波路であって、且つ励起エネルギーが平面導波路を介して全内部反射により、少なくとも一部において、流体チャネルの一部に向けられる、請求項6に記載のシステム。
- 前記導波路が平面導波路である、請求項1に記載のシステム。
- 前記カートリッジが、導波路上、且つ流体チャネル内に配置された複数の捕捉スポットを含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記画像化システムが、電荷結合素子(「CCD」)、及び相補型金属酸化物半導体(「CMOS」)センサからなる群から選択される画像センサを含む、請求項1に記載のシステム。
- サンプル処理及び検体検出のための方法であって、以下:
サンプルを提供すること、標的検体を潜在的に含むサンプル;
第一の種類の粒子を提供すること、標的検体に特異的な結合部分を含む第一の種類の粒子、力場に応答する第一の種類の粒子;
第二の種類の粒子を提供すること、標的検体に特異的な結合部分をまた含む第二の種類の粒子、信号を生成することのできる第二の種類の粒子;
標的検体の存在下で、第一の種類の粒子の一つ、及び第二の種類の粒子の一つが標的検体を介して連結して多重粒子複合体を形成するように、標的検体と第一及び第二の種類の粒子上の結合部分の間の特異的な結合相互作用を許容する条件下で、サンプルと第一及び第二の種類の粒子とを接触させること;
力場を用いて、第一及び第二の種類の粒子並びに多重粒子複合体の少なくとも一つを操作すること;並びに
多重粒子複合体に感受性であり、第一及び第二の種類の粒子の個別の一つには反応しない方法で、多重粒子複合体を検出すること、ここでそのように検出される多重粒子複合体は、標的検体の指標である、
を含む、方法。 - 前記操作することが、第一及び第二の種類の粒子、並びに多重粒子複合体の少なくとも一部に磁場を適用することを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記操作することが、第二の種類の粒子から、第一の種類の粒子及び多重粒子複合体を分離することをさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 前記第二の種類の粒子を提供することが、第二の種類の粒子として発光分子が用いられることを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記発光分子を用いることが、第二の種類の粒子として蛍光分子を用いることを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記多重粒子複合体を検出することは、以下:
第二の種類の粒子が標的検体と連結し、多重粒子複合体の一部を形成するように、励起エネルギーで多重粒子複合体の少なくとも一部を照射すること、及び
そのように照射された第二の種類の粒子により生成された信号を感知すること、
を含む、請求項15に記載の方法。 - 前記の多重粒子複合体の少なくとも一部を照射することは、ボリュームに隣接して配置された、第一の種類の粒子、第二の種類の粒子、及び多重粒子複合体のみが照射されるように、ボリューム内の励起エネルギーを含むこと、及びガイドすることを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記の第一及び第二の種類の粒子並びに多重粒子複合体の少なくとも一つを操作することは、第一の種類の粒子、及び多重粒子複合体のみが照射されるように、第二の種類の粒子を移動させてボリュームから離すことを含む、請求項17に記載の方法。
- 前記の力場を適用することは、標的検体に連結していない第二の種類の粒子をサンプルから取り除く一方で、多重粒子複合体を保持するように、サンプルを力場に曝すことを含む方法であって、以下:
サンプル中でそのように保持される多重粒子複合体において連結する第二の種類の粒子が検出可能な信号を生成するように、サンプルに励起エネルギーを供給すること、
をさらに含む、請求項11に記載の方法。 - 前記多重粒子複合体が指向性の信号増幅を示し、且つ前記多重粒子複合体を検出することが、指向性の信号増幅に反応する方法で検出可能な信号を感知することを含む、請求項17に記載の方法。
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