JP6760508B2 - 分析方法及び分析装置 - Google Patents
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Description
本開示は、分析方法及び分析装置に関する。詳細には、本開示は、抗原、抗体等の生体物質を分析するための分析方法及び分析装置に関する。
疾病の発見又は治療の効果等を定量的に分析するため、サンドイッチ法を用いたイムノアッセイによって、疾病に関連付けられた特定の抗原又は抗体をバイオマーカーとして検出する方法が知られている。
そして、このようなイムノアッセイの技術を用い、光ディスク上に固定した抗体に抗原を捕捉させ、抗原をさらに標識用ビーズで修飾することで、光学的手法により検出対象となる抗原を計数する方法が開発されている。
例えば、特許文献１には、ディスク面における溝構造またはピットが設けられた構造を有するトラック領域に固定化された、生体高分子が結合している標識用ビーズの数量を、光学的読み取り手段によって計測するための試料分析用ディスクが記載されている。
また、特許文献２には、検出対象のエクソソームに存在する抗原と結合する抗体が固定された凹部を有する注入部内に、エクソソームを含む試料液を注入して、凹部にエクソソームを固定させるエクソソーム固定工程を含む捕捉方法が記載されている。また、特許文献２に記載の捕捉方法は、注入部内に、エクソソームが有する抗原と結合する抗体が表面に固定されたビーズを含む緩衝溶液を注入して、エクソソームをビーズで修飾する修飾工程をさらに含んでいる。そして、特許文献２には、光ピックアップのレーザ光源から発せられたレーザ光でビーズを計数することが記載されている。
また、非特許文献１には、光ディスク技術とナノビーズ技術を組み合わせた高感度なバイオマーカーセンシングシステムが記載されている。非特許文献１には、ターゲットとなるバイオマーカーが抗原抗体反応により光ディスク表面上に特異的に固定され、さらにナノビーズがバイオマーカーに固定されることが記載されている。そして、非特許文献１には、光ピックアップを用いてナノビーズを計測することによりターゲットとなるバイオマーカーを計測することが記載されている。
Koji Tsujita、他６名、"Ultrahigh-Sensitivity Biomarker Sensing System Based on the Combination of Optical Disc Technologies and Nanobead Technologies"、Japanese Journal of Applied Physics52 (2013) 09LB02
しかしながら、先行技術文献に記載された方法は以下のような課題を有する。すなわち、検出対象物質を抗原抗体反応により分析用基板上に捕捉させたり、未反応の不要な物質を洗浄したりする過程において、ブロッキングに用いたタンパク質の凝集塊並びに洗浄液に含まれる塩及び界面活性剤等が残渣として分析用基板に付着する場合がある。
残渣には、大きさ又は形状が異なる様々な種類のものが含まれる。そして、ある種類の残渣に起因する検出信号（ノイズ信号）とビーズなどの粒子に起因する検出信号（粒子検出信号）とは似たようなパルス波形を有することがある。そのため、従来の分析方法及び分析装置では、ノイズ信号と粒子検出信号が似たようなパルス波形の場合、これらの信号を高い精度で識別することは困難であった。特に、検出対象物質が極微量である場合、検出対象物質と結合して分析用基板上に捕捉されているビーズなどの粒子も極微量となる。そのため、ノイズ信号による影響が相対的に大きくなり、粒子の定量精度、すなわち、粒子の検出限界又は分解能など粒子を定量的に分析する際の精度（検出限界）を悪化させる要因となっている。
本開示は、このような従来技術の有する課題に鑑みてなされたものである。そして、本開示の目的は、粒子検出信号を従来よりも高い精度で抽出し、抽出された粒子検出信号に基づいて検出対象物質を検出することにより、検出精度を向上させることができる分析方法及び分析装置を提供することを目的とする。
上記課題を解決するために、本開示の態様に係る分析方法は、反応領域を有する分析用基板の反応領域に検出対象物質が結合され、検出対象物質に結合する抗体が設けられた第１粒子が検出対象物質に結合され、抗体に結合する抗原が設けられて金属により形成されかつ第１粒子と異なる複素屈折率を有する第２粒子が第１粒子に結合された分析用基板に光ピックアップがレーザ光を照射し、光ピックアップが反応領域からの反射光を受光して受光レベル信号を生成し、判定回路が反応領域において所定の信号レベルよりも高い信号レベルの受光レベル信号を粒子検出信号として抽出し、計数回路が抽出された粒子検出信号に基づいて検出対象物質を検出する。第２粒子が結合した第１粒子に起因する受光レベル信号は、所定の信号レベルよりも高い。
上記課題を解決するために、本開示の態様に係る分析装置は、反応領域を有する分析用基板の反応領域に検出対象物質が結合され、検出対象物質に結合する抗体が設けられた第１粒子が検出対象物質に結合され、抗体に結合する抗原が設けられて金属により形成されかつ第１粒子と異なる複素屈折率を有する第２粒子が第１粒子に結合された分析用基板にレーザ光を照射し、反応領域からの反射光の受光レベルを検出して受光レベル信号を生成する光ピックアップと、反応領域において所定の信号レベルよりも高い信号レベルの受光レベル信号を粒子検出信号として抽出する判定回路と、粒子検出信号に基づいて検出対象物質を検出する計数回路と、を備える。第２粒子が結合した第１粒子に起因する受光レベル信号は、所定の信号レベルよりも高い。
本開示の分析方法及び分析装置によれば、粒子検出信号を従来よりも高い精度で抽出し、抽出された粒子検出信号に基づいて検出対象物質を検出することにより、検出精度を向上させることができる。
以下、本実施形態に係る分析方法及び分析装置について詳細に説明する。なお、図面の寸法比率は説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
［分析装置］
本実施形態では、分析用基板１を用いて検出対象物質１１を検出する（図３参照）。図１〜図３を用いて本実施形態に用いられる分析用基板１について説明する。
本実施形態では、分析用基板１を用いて検出対象物質１１を検出する（図３参照）。図１〜図３を用いて本実施形態に用いられる分析用基板１について説明する。
図１に示すように、分析用基板１は、例えば、ブルーレイディスク（ＢＤ）、ＤＶＤ、コンパクトディスク（ＣＤ）等の光ディスクと同等の円板形状を有する。
分析用基板１は、例えば、一般的な光ディスクに用いられるポリカーボネート樹脂又はシクロオレフィンポリマー等の樹脂材料で形成されている。なお、分析用基板１は、上記の光ディスクに限定されるものではなく、他の形態又は所定の規格に準拠した光ディスクを用いることもできる。
分析用基板１は、反応領域１０を有する。図１の実施形態では、分析用基板１の中心部に位置決め孔２が形成されており、分析用基板１の中心Ｃａに対して同一円周Ｃｂ上に中心部がそれぞれ位置するように、８つの反応領域１０が等間隔に形成されている。ただし、反応領域１０の数又は形成位置はこれに限定されるものではない。
図２に示すように、分析用基板１の表面には、凸部３と凹部４とが半径方向に交互に配置されたトラック領域５が形成されている。凸部３及び凹部４は、分析用基板１の内周部から外周部に向かってスパイラル状に形成されている。凹部４及び凸部３の半径方向のピッチであるトラックピッチＷ４は例えば３２０ｎｍである。なお、本実施形態では、分析用基板１に凸部３と凹部４を設けなくてもよく、分析用基板１は平板であってもよい。
図２及び図３では、分析用基板１のトラック領域５に形成された反応領域１０が示されている。反応領域１０には、検出対象物質１１と、第１粒子２０と、第２粒子３０と、が捕捉されている。そして、図３に示すように、光ピックアップ５０からレーザ光５０ａを反応領域１０に照射し、凹部４に沿って走査することで、検出対象物質１１が計数される。
検出対象物質１１は、例えば疾病に関連付けられた特定のタンパク質などの抗原である。このような抗原を検出対象物質１１として用いることにより、疾患の診断、治療後の経過観察、予後の診断、治療薬の選定、治療指針を得るためのコンパニオン診断、疾患又は体調等のモニタリングなどに役立てることができる。
例えばエクソソームなどの検出対象物質１１は、モニタリング対象の疾患状態に応じ、体液内の濃度が変化するため、バイオマーカーとしての役割を果たすことができる。検出対象物質１１は、例えば、エクソソームを識別するための抗原として知られている膜貫通型の膜タンパク質であるＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１及びＣＥＡなどからなる群より選択される少なくとも１つとしてもよい。なお、検出対象物質１１をエクソソームとした場合、エクソソームの外径は３０ｎｍ〜１００ｎｍ程度であることが多い。また、検出対象物質１１をタンパク質とした場合、タンパク質の外径は数ｎｍ〜数１００ｎｍであることが多い。
図３の実施形態では、トラック領域５上の反応領域１０が形成される領域で、検出対象物質１１と特異的に結合する抗体１２が固定されている。そして、トラック領域５に固定されている抗体１２に、検出対象物質１１を特異的に結合させることにより、検出対象物質１１をトラック領域５に捕捉させている。
第１粒子２０には、検出対象物質１１を認識する抗体２１が設けられる。具体的には、第１粒子２０の表面上に、検出対象物質１１と特異的に結合する複数の抗体２１がそれぞれ固定されている。そして、トラック領域５上に捕捉されている検出対象物質１１に、抗体２１を介して特異的に第１粒子２０が結合している。第１粒子２０の抗体２１が、検出対象物質１１と特異的に結合することにより、第１粒子２０はトラック領域５に捕捉される。なお、凸部３の幅を凹部４の幅より狭くすると、第１粒子２０の大部分が凹部４に捕捉されやすくなるため、検出対象物質１１が微量しか存在しない場合であっても、検出精度を向上させることができるため好ましい。
第１粒子２０としては、検出対象物質１１を認識する抗体２１が設けられていれば特に限定されないが、例えばポリマー粒子、金属粒子及びシリカ粒子などからなる群より選択される少なくとも１つの標識用ビーズなどが挙げられる。また、第１粒子２０は、内部にフェライト等の磁性材料を含む磁気ビーズなどであってもよい。磁気ビーズを用いた場合には、磁気によってトラック領域５に第１粒子２０を誘導することができるため、検出対象物質１１と第１粒子２０とを結合させる時間を短縮することができる。
第１粒子２０の平均粒子径は特に限定されないが、１００ｎｍ〜１μｍとすることが好ましい。第１粒子２０の平均粒子径を１００ｎｍ以上とすることにより、検出対象物質１１を高い精度で検出しやすくすることができる。また、第１粒子２０の平均粒子径を１μｍ以下とすることにより、検出対象物質１１を高い精度で計数しやすくすることができる。なお、第１粒子２０の平均粒子径は１００ｎｍ〜２００ｎｍであることがより好ましい。また、第１粒子２０の平均粒子径は、体積基準における粒度分布の累積値が５０％の時の粒子径を表し、例えば、レーザ回折・散乱法により測定することができる。
抗体２１は検出対象物質１１を認識することができれば特に限定されない。例えば、上記のようにエクソソームを検出対象物質１１とする場合、抗体２１は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１及びＣＥＡなどからなる群より選択される少なくとも１つのような抗原を認識する抗体とすればよい。抗体１２と抗体２１とは、認識する抗原が同じであってもよく、異なっていてもよい。ただし、検出対象物質１１に対象となる抗原が１つしかない場合は、認識する抗原を同じにすると第１粒子２０が検出対象物質１１に結合することができないため、抗体１２と抗体２１とでそれぞれ異なる抗原を認識できるようにする必要がある。
第２粒子３０には、抗体２１と結合する抗原３１が設けられる。具体的には、第２粒子３０の表面に、第１粒子２０の抗体２１と特異的に結合する抗原３１が固定されている。そして、複数の第２粒子３０が抗原３１を介して複数の抗体２１にそれぞれ特異的に結合している。第２粒子３０の抗原３１が、第１粒子２０の抗体２１と特異的に結合することにより、第２粒子３０はトラック領域５に捕捉される。
従って、分析用基板１のトラック領域５には、検出対象物質１１、第１粒子２０及び第２粒子３０が捕捉される。そして、検出対象物質１１、第１粒子２０及び第２粒子３０が捕捉されている領域が図１に示すような反応領域１０となる。
第２粒子３０は金属により形成される。第２粒子３０を金属により形成することで、レーザ光５０ａの反射率を向上させることができる。
なお、第２粒子３０の複素屈折率をｎ−ｋｉ（ｎは第２粒子３０の屈折率を表し、ｉは虚数単位を表し、ｋは第２粒子３０の消衰係数を表す。）で表した場合に、（ｋ−０．２３）２／１．２２＋（ｎ−１．３６）２／０．９４２＞１を満たすことが好ましい。この関係は、以下で説明するように、ＦＤＴＤ法（Finite-Difference Time-Domain method）による光学シミュレーションによって導き出されている。
シミュレーションでは、図４に示すモデル図を使用した。図４に示すモデル図は、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）からなる分析用基板１の凹部４に、粒子が捕捉された状態を示している。また、この粒子は、第１粒子２０に相当する磁気ビーズの表面全体を、金属で被覆した状態をモデル化したものである。磁気ビーズは、フェライトからなる核部と、核部が中心部に配置されるように包囲し、Ｐｏｌｙ（ＧＭＡ）（poly (glycidyl methacrylate)）からなる母材と、により構成されている。磁気ビーズの表面を被覆する金属からなる被覆層は、第２粒子３０に相当する。本シミュレーションでは、被覆層の厚さを２０ｎｍとしており、この厚さは、第１粒子２０の表面全体を第２粒子３０で均一に覆うことができた理想的な状態を想定している。なお、図４に示された数値の単位は、マイクロメートル（μｍ）であり、例えば、第１粒子２０を構成する磁気ビーズの直径は２００ｎｍである。
図５は、第２粒子３０の複素屈折率におけるｎを１．７かつｋを０とし、レーザ光の波長を４０５ｎｍ、Ｐｏｌｙ（ＧＭＡ）の複素屈折率を１．５３（ｎ＝１．５３及びｋ＝０）とした場合に、シミュレーションによって導き出されたパルス波形を示す図である。なお、図５において、横軸は位置（時間）を示し、縦軸はレーザ光の反射率を示している。図５から分かるように、粒子が存在しない位置における反射率は約０．０３５（約３．５％）であることを示している。また、このパルスのピーク値は、粒子の中心部における反射率を示しており、０．００６５４９（０．６５４９％）である。
図６は、第２粒子３０の複素屈折率におけるｎとｋの値をそれぞれ変更した場合において、シミュレーションによって導き出されたパルスのピーク値がどのように値を取るか示した表である。なお、シミュレーションは、上記と同様、レーザ光の波長を４０５ｎｍ、かつ、Ｐｏｌｙ（ＧＭＡ）の複素屈折率を１．５３（ｎ＝１．５３及びｋ＝０）とする条件で実施されている。図６において、グレーで示されていない領域は、パルスのピーク値が０．０３５以下の領域であり、グレーで示された領域は、パルスのピーク値が０．０３５を超える領域である。すなわち、本シミュレーションの条件において、グレーで示されていない領域では、パルスが下向きに凸となり、グレーで示された領域では、パルスが上向きに凸となる。
このグレーで示された領域と、グレーで示されていない領域との境界は、略楕円形状をしており、計算の結果、（ｋ−０．２３）２／１．２２＋（ｎ−１．３６）２／０．９４２＝１で表される。そのため、グレーで示された領域は、（ｋ−０．２３）２／１．２２＋（ｎ−１．３６）２／０．９４２＞１の条件を満たす。そして、本実施形態では、レーザ光の反射率を向上させる観点から、上記条件を満たすことが好ましい。
また、図６の結果から、レーザ光の反射率向上の観点より、第２粒子３０の複素屈折率をｎ−ｋｉで表した場合に、ｎ＜０．１又はｎ＞２．５、及び、ｋ＞１．９の少なくともいずれか一方を満たすことが好ましい。すなわち、ｎの値だけが０．１未満又は２．５を超えていても好ましく、ｋの値だけが１．９を超えていても好ましく、ｎの値が０．１未満又は２．５を超え、かつ、ｋの値が１．９を超えていても好ましい。なお、上記同様、ｎは第２粒子３０の屈折率を表し、ｉは虚数単位を表し、ｋは第２粒子３０の消衰係数を表す。
なお、第２粒子３０は、金、銀、白金及び銅からなる群より選択される少なくとも１種の金属により形成されることが好ましい。また、第２粒子３０は、金、銀及び白金からなる群より選択される少なくとも１種の金属により形成されることがより好ましい。これらの金属は、例えばレーザ光５０ａの波長を４０５ｎｍ付近とした場合に、反射率をより向上させることができるためである。
第２粒子３０の平均粒子径は特に限定されないが、１ｎｍ〜３０ｎｍとすることが好ましい。第２粒子３０の平均粒子径を１ｎｍ以上とすることにより、レーザ光５０ａの反射率をより向上させることができる。また、第２粒子３０の平均粒子径を３０ｎｍ以下とすることにより、立体的な障害が小さくなることから、より多くの第２粒子３０で第１粒子２０を被覆することができ、反射率をより向上させることができる。なお、第２粒子３０の平均粒子径は、電子顕微鏡を用いて実測した数〜数十個の平均値とすることができる。
抗原３１は、抗体２１と結合することができれば特に限定されないが、タンパク質及びタンパク質断片の少なくともいずれか一方であることが好ましい。なお、抗原３１は、純度又は入手の容易さの観点より、タンパク質断片であることが好ましい。タンパク質断片は、例えば、抗体２１と結合可能なエピトープを含むペプチド、又は、抗体２１と結合可能なエピトープを含むリコンビナントタンパク質とすることができる。
次に、図７を用いて、反応領域１０に検出対象物質１１と第１粒子２０と第２粒子３０とを捕捉する方法の一例について説明する。図７に示すように、反応領域１０を形成する方法は、抗体固定工程Ｓ１と、洗浄工程Ｓ２と、ブロッキング工程Ｓ３と、洗浄工程Ｓ４と、検体インキュベーション工程Ｓ５と、洗浄工程Ｓ６と、を備える。さらに、反応領域１０を形成する方法は、第１粒子インキュベーション工程Ｓ７と、第２粒子インキュベーション工程Ｓ８と、洗浄工程Ｓ９と、を備える。
抗体固定工程Ｓ１では、疾病に関連付けられた特定の抗原である検出対象物質１１と特異的に結合する抗体１２を、トラック領域５上の反応領域１０が形成される領域に固定させる。例えばトラック領域５に、抗体１２を含む緩衝液を接触させ、適切な時間反応させることにより、抗体１２をトラック領域５上に固定させる。
洗浄工程Ｓ２では、反応させた緩衝液を除去した後、トラック領域５を洗浄する。
ブロッキング工程Ｓ３では、抗体１２の抗原認識部以外に、抗原が非特異的に吸着することを防ぐため、トラック領域５の表面をブロッキング処理する。具体的には、緩衝液で希釈したスキムミルクをトラック領域５に接触させ、適切な時間反応させることにより、トラック領域５の表面をブロッキング処理する。なお、同様の効果を奏するものであれば、ブロッキング処理に用いる物質はスキムミルクに限定されない。
洗浄工程Ｓ４では、スキムミルクを含む緩衝溶液を除去した後、トラック領域５を緩衝溶液で洗浄する。洗浄に用いる緩衝溶液としては、スキムミルクを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。また、洗浄を省略することも可能である。
検体インキュベーション工程Ｓ５では、検出対象物質１１を、トラック領域５上に固定されている抗体１２と特異的に結合させる。例えば検出対象物質１１を含む試料液をトラック領域５と接触させ、適切な時間反応させることにより、抗原抗体反応によって検出対象物質１１を抗体１２と結合させ、検出対象物質１１をトラック領域５に捕捉させる。
洗浄工程Ｓ６では、反応させた試料液を除去した後、トラック領域５を洗浄して乾燥させる。洗浄工程Ｓ６により、抗原抗体反応ではなく、非特異な吸着によって分析用基板１の表面に付着した検出対象物質１１を排除することができる。なお、試料液によっては検出対象物質１１が含まれていない場合もあるが、説明を分かりやすくするために、以下では試料液に検出対象物質１１が含まれている場合について説明する。
第１粒子インキュベーション工程Ｓ７では、検出対象物質１１を標識するための第１粒子２０をトラック領域５上に捕捉されている検出対象物質１１と特異的に結合させる。第１粒子２０の表面には検出対象物質１１と特異的に結合する抗体２１が固定されている。第１粒子２０の抗体２１が検出対象物質１１と特異的に結合することにより、第１粒子２０はトラック領域５に捕捉される。従って、検出対象物質１１及び第１粒子２０は、分析用基板１のトラック領域５に捕捉される。
第２粒子インキュベーション工程Ｓ８では、第１粒子２０を標識するための第２粒子３０をトラック領域５上に捕捉されている第１粒子２０の表面に設けられた抗体２１と特異的に結合させる。第２粒子３０の表面には抗体２１と特異的に結合する抗原３１が固定されている。抗原３１が抗体２１と特異的に結合することにより、第２粒子３０はトラック領域５に捕捉される。従って、検出対象物質１１、第１粒子２０及び第２粒子３０は、分析用基板１のトラック領域５に捕捉される。
洗浄工程Ｓ９では、反応後の試料液を除去した後、トラック領域５を洗浄して乾燥させる。
以上のようにして、検出対象物質１１と、第１粒子２０と、第２粒子３０と、が捕捉された領域である反応領域１０を形成することができる。
なお、図７の実施形態では、まず検出対象物質１１をトラック領域５に捕捉し、次いで、第１粒子２０を投入して、第１粒子２０を検出対象物質１１に固定させたが、検出対象物質１１と第１粒子２０とを同時に緩衝溶液中に投じて反応させる手順であってもよい。この場合、液中で検出対象物質１１と第１粒子２０の結合反応が生じるため、反応領域１０の形成時間を短縮できるというメリットが生じる。
また、図７の実施形態では、第１粒子インキュベーション工程Ｓ７と第２粒子インキュベーション工程Ｓ８との間に洗浄工程を入れるなど、反応領域１０の形成方法は目的に応じて適宜変更してもよい。
次に、図８を用いて、本実施形態の分析装置の一例を説明する。本実施形態の分析装置１００は、光ピックアップ５０と、判定回路６４と、計数回路６５と、を備える。
図８に示すように、分析装置１００は、ターンテーブル４１、クランパ４２、ターンテーブル駆動部４３、ターンテーブル駆動回路４４、ガイド軸４５、光ピックアップ駆動回路４６、制御部４７及び光ピックアップ５０を備える。
ターンテーブル４１上には、分析用基板１が、反応領域１０が下向きになるように載置される。
クランパ４２は、ターンテーブル４１に対して離隔する方向及び接近する方向、すなわち、図８の上方向及び下方向に駆動される。分析用基板１は、クランパ４２が下方向に駆動されると、クランパ４２とターンテーブル４１とによって、ターンテーブル４１上に保持される。具体的には、分析用基板１は、その中心Ｃａがターンテーブル４１の回転軸Ｃ４１上に位置するように保持される。
ターンテーブル駆動部４３は、ターンテーブル４１を分析用基板１及びクランパ４２と共に、回転軸Ｃ４１にて回転駆動させる。ターンテーブル駆動部４３として、例えばスピンドルモータを用いてもよい。
ターンテーブル駆動回路４４はターンテーブル駆動部４３を制御する。例えば、ターンテーブル駆動回路４４は、ターンテーブル４１が分析用基板１及びクランパ４２と共に一定の線速度で回転するようにターンテーブル駆動部４３を制御する。
ガイド軸４５は、分析用基板１と平行に、かつ、分析用基板１の半径方向に沿って配置されている。すなわち、ガイド軸４５は、ターンテーブル４１の回転軸Ｃ４１に直交する方向に沿って配置されている。
光ピックアップ５０はガイド軸４５に支持されている。光ピックアップ５０は、ガイド軸４５に沿って分析用基板１の半径方向に、かつ、分析用基板１と平行に駆動する。すなわち、光ピックアップ５０は、ターンテーブル４１の回転軸Ｃ４１に直交する方向に沿って駆動する。
光ピックアップ５０は対物レンズ５１を備えている。対物レンズ５１はサスペンションワイヤ５２に支持されている。対物レンズ５１は、分析用基板１に対して接近する方向及び離隔する方向、すなわち、図８の上方向及び下方向に駆動される。
光ピックアップ５０は分析用基板１に向けてレーザ光５０ａを照射する。レーザ光５０ａは対物レンズ５１によって分析用基板１の反応領域１０が形成されている側の面（図８では分析用基板１の下側の面）に集光される。レーザ光５０ａの波長λは例えば４０５ｎｍ程度である。
光ピックアップ５０は分析用基板１からの反射光を受光する。そして、光ピックアップ５０は、反応領域１０からの反射光の受光レベルを検出して受光レベル信号ＪＳを生成する。光ピックアップ５０は、生成した受光レベル信号ＪＳを制御部４７へ出力する。
光ピックアップ駆動回路４６は光ピックアップ５０の駆動を制御する。例えば光ピックアップ駆動回路４６は、光ピックアップ５０をガイド軸４５に沿って移動させたり、光ピックアップ５０の対物レンズ５１を上下方向に移動させたりする。
制御部４７は、ターンテーブル駆動回路４４及び光ピックアップ駆動回路４６を制御する。制御部４７として例えばＣＰＵ（Central Processing Unit）を用いてもよい。
制御部４７は、分析用基板１からの信号を検出する信号検出部６０を有する。信号検出部６０は、記憶回路６２、受光信号検出回路６３、判定回路６４、及び、計数回路６５を有する。
信号検出部６０は、光ピックアップ５０により出力された受光レベル信号ＪＳから粒子検出信号ＫＳを抽出してカウントすることにより、反応領域１０に捕捉されている検出対象物質１１を検出して定量する。ただし、検出対象物質１１は１００ｎｍ程度と小さいため、検出対象物質１１を直接検出することは難しい。そこで、本実施形態では、第２粒子３０の高い反射率を利用することにより、反応領域１０に捕捉されている検出対象物質１１を間接的に検出して定量している。
受光信号検出回路６３は、光ピックアップ５０から出力された受光レベル信号ＪＳを検出する。具体的には、受光信号検出回路６３は、光ピックアップ５０から出力された受光レベル信号ＪＳに含まれるパルス波を検出する。
判定回路６４は、反応領域１０において所定の信号レベルＬｔｈよりも高い信号レベルの受光レベル信号ＪＳを粒子検出信号ＫＳとして抽出する。判定回路６４は、記憶回路６２に記憶された閾値としての所定の信号レベルＬｔｈよりも高い信号レベルの受光レベル信号ＪＳを粒子検出信号ＫＳと判定する。
所定の信号レベルＬｔｈは、受光レベル信号ＪＳの内、残渣に起因するノイズ信号ＮＳと、粒子検出信号ＫＳとを区別可能な信号レベルであれば、特に限定されない。所定の信号レベルＬｔｈは、検出対象物質１１が存在しない領域からの反射光を受光して生成された信号レベル（以下、「基板信号レベルＤＬ」ともいう）であることが好ましい。その理由は、主として分析用基板１の状態が所定の信号レベルＬｔｈを決めるため、所定の信号レベルＬｔｈを分析用基板１の状態を示す特性値である基板信号レベルＤＬとすることが容易かつ正確であるためである。
計数回路６５は、粒子検出信号ＫＳに基づいて検出対象物質１１を検出する。具体的には、計数回路６５は、粒子検出信号ＫＳを抽出してカウントすることにより、反応領域１０に捕捉されている検出対象物質１１を検出して定量する。
図９は、一般的な標識用ビーズを用いた場合に得られる受光レベル信号ＪＳの一例を示している。図９の縦軸は受光レベル信号ＪＳの信号レベルを示し、横軸は時間を示す。
反応領域１０を形成する過程において、タンパク質の凝集塊、洗浄液に含まれる塩又は界面活性剤等が反応領域１０に残渣として含まれている場合がある。具体的には、検出対象物質１１を抗原抗体反応により分析用基板１上に捕捉させたり、未反応の不要な物質を洗浄したりする過程等に残渣が混入するおそれがある。このような残渣に起因するノイズ信号ＮＳも受光レベル信号ＪＳとして検出されてしまう。
一般的な標識用ビーズは、ポリスチレン又はエポキシ等の合成樹脂で形成されている。通常、これらの樹脂粒子又は上記残渣にレーザ光５０ａを照射した場合、光が散乱する傾向にあるため、分析用基板１の検出対象物質１１などが存在しない領域に対して反射率が低下してしまう。そのため、従来のような標識用ビーズを用いて検出対象物質１１を検出した場合、図９に示すように、粒子検出信号ＫＳ及びノイズ信号ＮＳは、基板信号レベルＤＬよりも低い信号レベルの受光レベル信号ＪＳとして検出される。
従来の標識用ビーズを用いた場合であっても、受光レベル信号ＪＳの信号レベルを閾値Ｌｔｈａと比較することにより、粒子検出信号ＫＳとノイズ信号ＮＳとをある程度の精度で判別することは可能である。しかしながら、検出対象物質が極微量である場合、従来の標識用ビーズを用いた場合は、ノイズ信号ＮＳによる影響が相対的に大きくなるため、本実施形態の分析方法と比較して検出対象物質の定量精度は高くない。
ところが、本実施形態では、第２粒子３０が金属により形成されている。そのため、図１０に示すように、第２粒子３０を反応領域１０に捕捉させなかった場合と比較し、レーザ光５０ａの反射率を増加させることができ、粒子検出信号ＫＳを所定の信号レベルＬｔｈよりも高い信号レベルとすることができる。図１０において、所定の信号レベルＬｔｈよりも高い信号レベル（ハイレベル）の受光レベル信号ＪＳが粒子検出信号ＫＳであり、所定の信号レベルＬｔｈよりも低い信号レベル（ローレベル）の受光レベル信号ＪＳがノイズ信号ＮＳである。また、受光レベル信号ＪＳにおける基板信号レベルＤＬは、粒子検出信号ＫＳとノイズ信号ＮＳとを含まない時間における一定の信号レベルである。
したがって、本実施形態によれば、所定の信号レベルＬｔｈよりも低い信号レベルとなるノイズ信号ＮＳとの識別を容易にすることができる。例えば、受光レベル信号ＪＳと所定の信号レベルＬｔｈとを比較することで、受光レベル信号ＪＳから粒子検出信号ＫＳのみを精度よく抽出することができる。そのため、抽出された粒子検出信号ＫＳに基づいて、反応領域１０に捕捉されている第２粒子３０で被覆された第１粒子２０を精度よく検出することができる。
以上の通り、本実施形態の分析装置１００は、分析用基板１にレーザ光５０ａを照射し、反応領域１０からの反射光の受光レベルを検出して受光レベル信号ＪＳを生成する光ピックアップ５０を備える。また、本実施形態の分析装置１００は、反応領域１０において所定の信号レベルＬｔｈよりも高い信号レベルの受光レベル信号ＪＳを粒子検出信号ＫＳとして抽出する判定回路６４と、を備える。さらに、本実施形態の分析装置１００は、粒子検出信号ＫＳに基づいて検出対象物質１１を検出する計数回路６５を備える。分析用基板１は、検出対象物質１１と、検出対象物質１１を認識する抗体２１が設けられた第１粒子２０と、抗体２１と結合する抗原３１が設けられ、金属により形成された第２粒子３０とが捕捉された反応領域１０を有し、樹脂材料で形成される。
そのため、本実施形態の分析装置１００によれば、粒子検出信号ＫＳを従来よりも高い精度で抽出し、抽出された粒子検出信号ＫＳに基づいて検出対象物質１１を検出することにより、検出精度を向上させることができる。
［分析方法］
次に、図１１のフローチャートを用いて、本実施形態の分析方法について説明する。なお、試料液によっては検出対象物質１１が含まれていない場合もある。この場合、分析用基板１の反応領域１０には検出対象物質１１、第１粒子２０及び第２粒子３０が捕捉されない。そこで、説明を分かりやすくするために、反応領域１０に検出対象物質１１、第１粒子２０及び第２粒子３０が捕捉されている場合について説明する。
次に、図１１のフローチャートを用いて、本実施形態の分析方法について説明する。なお、試料液によっては検出対象物質１１が含まれていない場合もある。この場合、分析用基板１の反応領域１０には検出対象物質１１、第１粒子２０及び第２粒子３０が捕捉されない。そこで、説明を分かりやすくするために、反応領域１０に検出対象物質１１、第１粒子２０及び第２粒子３０が捕捉されている場合について説明する。
分析用基板回転工程Ｓ１１は、分析用基板１を回転させる工程である。制御部４７は、反応領域１０が形成されている分析用基板１が一定の線速度で回転するようにターンテーブル駆動回路４４を制御し、ターンテーブル駆動部４３にターンテーブル４１を回転駆動させる。
反応領域照射工程Ｓ１２は、分析用基板１の反応領域１０にレーザ光５０ａを照射する工程である。制御部４７は、光ピックアップ５０から分析用基板１に向けてレーザ光５０ａを照射させ、光ピックアップ駆動回路４６を制御して、光ピックアップ５０を分析用基板１の反応領域１０が形成されている半径位置まで移動させる。そして、レーザ光５０ａは、反応領域１０上を凹部４に沿って走査される。
受光レベル信号生成工程Ｓ１３は、反応領域１０からの反射光を受光して受光レベル信号ＪＳを生成する工程である。光ピックアップ５０は、反応領域１０からの反射光を受光する。光ピックアップ５０は反射光の受光レベルを検出して受光レベル信号ＪＳを生成し、受光信号検出回路６３へ出力する。
粒子検出信号検出工程Ｓ１４は、反応領域１０において所定の信号レベルＬｔｈよりも高い信号レベルの受光レベル信号ＪＳを粒子検出信号ＫＳとして抽出し、抽出された粒子検出信号ＫＳに基づいて検出対象物質１１を検出する工程である。判定回路６４は、記憶回路６２に記憶された所定の信号レベルＬｔｈよりも高い信号レベルの受光レベル信号ＪＳを粒子検出信号ＫＳと判定する。
受光レベル信号ＪＳにノイズ信号ＮＳが含まれている場合、ノイズ信号ＮＳは基板信号レベルＤＬよりも低い信号レベルである。そのため、所定の信号レベルＬｔｈに対して、高い信号レベルの粒子検出信号ＫＳと低い信号レベルのノイズ信号ＮＳとを容易に識別することができる。従って、受光レベル信号ＪＳから粒子検出信号ＫＳのみを精度よく抽出することができる。
粒子定量工程Ｓ１５では、計数回路６５が、粒子検出信号ＫＳ、具体的には粒子検出信号ＫＳのパルス数を反応領域１０毎にカウントし、トラック毎に加算する。これにより、各反応領域１０における検出対象物質１１を定量することができる。
照射停止工程Ｓ１６では、制御部４７が、光ピックアップ駆動回路４６を制御して光ピックアップ５０を初期位置へ移動させ、レーザ光５０ａの照射を停止させる。
回転停止工程Ｓ１７では、制御部４７が、ターンテーブル駆動回路４４を制御して、ターンテーブル４１の回転を停止させる。
以上の通り、本実施形態の分析方法は、分析用基板１にレーザ光５０ａを照射し、反応領域１０からの反射光を受光して受光レベル信号ＪＳを生成する。さらに、本実施形態の分析方法は、反応領域１０において所定の信号レベルＬｔｈよりも高い信号レベルの受光レベル信号ＪＳを粒子検出信号ＫＳとして抽出し、抽出された粒子検出信号ＫＳに基づいて検出対象物質１１を検出する。分析用基板１は、検出対象物質１１と、検出対象物質１１を認識する抗体２１が設けられた第１粒子２０と、抗体２１と結合する抗原３１が設けられ、金属により形成された第２粒子３０とが捕捉された反応領域１０を有する、樹脂材料で形成される。
そのため、本実施形態の分析方法によれば、粒子検出信号ＫＳを従来よりも高い精度で抽出し、抽出された粒子検出信号ＫＳに基づいて検出対象物質１１を検出することにより、検出精度を向上させることができる。
以下、本実施形態を実施例及び比較例によりさらに詳細に説明するが、本実施形態はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］
まず、エクソソームに特異的な抗原タンパク質であるＣＤ９を認識する抗体を、光ディスク基板の反応領域に固定した。そして、光ディスク基板を洗浄液で洗浄した。
まず、エクソソームに特異的な抗原タンパク質であるＣＤ９を認識する抗体を、光ディスク基板の反応領域に固定した。そして、光ディスク基板を洗浄液で洗浄した。
次に、反応領域にエクソソームを含む試料を接触させ、光ディスク基板に試料中のエクソソームを捕捉させた。そして、光ディスク基板を洗浄液で洗浄した。
次に、各種の癌との関連性が示唆されており、エクソソームに特異的なタンパク質であるＣＥＡを認識する抗体を、シリカビーズの表面に固定したものを第１粒子として準備した。そして、この第１粒子を反応領域に接触させ、光ディスク基板に捕捉されたエクソソームと結合させ、光ディスク基板に第１粒子を捕捉させた。そして、光ディスク基板を洗浄液で洗浄した。
次に、銀ナノ粒子の表面にＣＥＡリコンビナントタンパク質を固定したものを第２粒子として準備した。そして、この第２粒子を反応領域に接触させ、光ディスク基板に捕捉された第１粒子の抗体２１と結合させ、光ディスク基板に第２粒子を捕捉させた。そして、光ディスク基板を洗浄液で洗浄し、エクソソームを検出対象物質とする分析用基板を作製した。
［比較例１］
光ディスク基板に第２粒子を捕捉させない以外は、実施例１と同様にして分析用基板を作製した。
光ディスク基板に第２粒子を捕捉させない以外は、実施例１と同様にして分析用基板を作製した。
［評価］
ＣＤ６３を発現しているエクソソームは、ＣＥＡを発現しているエクソソーム比較して多量に存在する場合が多いため、従来法でも十分に検出可能である。しかしながら、ＣＥＡを発現しているエクソソーム数は、ＣＤ６３を発現しているエクソソームと比較して１％以下と非常に微量であるため、このように微量な場合であってもエクソソームが検出可能であるか評価した。具体的な評価方法は以下の通りである。
ＣＤ６３を発現しているエクソソームは、ＣＥＡを発現しているエクソソーム比較して多量に存在する場合が多いため、従来法でも十分に検出可能である。しかしながら、ＣＥＡを発現しているエクソソーム数は、ＣＤ６３を発現しているエクソソームと比較して１％以下と非常に微量であるため、このように微量な場合であってもエクソソームが検出可能であるか評価した。具体的な評価方法は以下の通りである。
まず、波長４０５ｎｍのレーザ光を分析用基板の反応領域に照射した。そして、検出対象物質が存在しない領域からの反射光を受光して生成された信号レベルを所定の信号レベルとし、反応領域の反射光から得られた所定の信号レベルより高い信号レベルを粒子検出信号とした。そして、所定の信号レベルと粒子検出信号とを比較することにより、検出対象物質であるエクソソームの数をカウントした。
評価の結果、実施例１のように第２粒子を用いた場合は、エクソソームに起因する信号が所定の信号レベルより高いため、ノイズに起因する信号と明確に区別することができた。
一方、比較例１のように、第２粒子を用いなかった場合は、エクソソームに起因する信号が所定の信号レベルより低いため、ノイズに起因する信号と明確に区別することができなかった。
エクソソームが有するＣＥＡ量は、ＣＤ６３と比較して１％以下と非常に微量であるため、比較例１のように第１粒子だけでは検出が困難である。しかしながら、実施例１のように、第２粒子をさらに用いることでレーザ光の反射率を向上させることができる。そのため、実施例１の分析用基板を用いた場合は、検出対象物質が微量であっても、検出対象物質を高い精度で検出することができた。
なお、上述の通り、ＣＤ６３を発現しているエクソソームは比較的多いが、エクソソームでの発現の量が少ないタンパク質を有するエクソソームを検出ターゲットとして分析する場合には、従来法であっても、ノイズ信号と粒子検出信号との区別が困難な場合がある。しかしながら、上述した本実施形態によれば、試料中のエクソソーム量が極微量である場合であっても、高い精度で検出対象物質を検出することができる。
特願２０１７−１５４９１９号（出願日：２０１７年８月１０日）の全内容は、ここに援用される。
以上、実施例に沿って本実施形態の内容を説明したが、本実施形態はこれらの記載に限定されるものではなく、種々の変形及び改良が可能であることは、当業者には自明である。
１ 分析用基板
１０ 反応領域
１１ 検出対象物質
２０ 第１粒子
２１ 抗体
３０ 第２粒子
３１ 抗原
５０ 光ピックアップ
５０ａ レーザ光
６４ 判定回路
６５ 計数回路
１００ 分析装置
ＪＳ 受光レベル信号
ＫＳ 粒子検出信号
Ｌｔｈ 所定の信号レベル
１０ 反応領域
１１ 検出対象物質
２０ 第１粒子
２１ 抗体
３０ 第２粒子
３１ 抗原
５０ 光ピックアップ
５０ａ レーザ光
６４ 判定回路
６５ 計数回路
１００ 分析装置
ＪＳ 受光レベル信号
ＫＳ 粒子検出信号
Ｌｔｈ 所定の信号レベル
Claims (6)
- 反応領域を有する分析用基板の前記反応領域に検出対象物質が結合され、前記検出対象物質に結合する抗体が設けられた第１粒子が前記検出対象物質に結合され、前記抗体に結合する抗原が設けられて金属により形成されかつ前記第１粒子と異なる複素屈折率を有する第２粒子が前記第１粒子に結合された前記分析用基板に光ピックアップがレーザ光を照射し、
前記光ピックアップが前記反応領域からの反射光を受光して受光レベル信号を生成し、
判定回路が前記反応領域において所定の信号レベルよりも高い信号レベルの受光レベル信号を粒子検出信号として抽出し、
計数回路が前記抽出された粒子検出信号に基づいて検出対象物質を検出する分析方法であって、
前記第２粒子が結合した前記第１粒子に起因する受光レベル信号は、前記所定の信号レベルよりも高いことを特徴とする分析方法。 - 前記所定の信号レベルは、検出対象物質が存在しない領域からの反射光を受光して生成された信号レベルである請求項１に記載の分析方法。
- 前記第２粒子の前記複素屈折率をｎ−ｋｉ（ｎは前記第２粒子の屈折率を表し、ｉは虚数単位を表し、ｋは前記第２粒子の消衰係数を表す。）で表した場合に、（ｋ−０．２３）２／１．２２＋（ｎ−１．３６）２／０．９４２＞１を満たす、請求項１又は２に記載の分析方法。
- 前記第２粒子は金、銀、白金及び銅からなる群より選択される少なくとも１種の金属により形成される請求項１〜３のいずれか１項に記載の分析方法。
- 前記抗原は、タンパク質及びタンパク質断片の少なくともいずれか一方である請求項１〜４のいずれか１項に記載の分析方法。
- 反応領域を有する分析用基板の前記反応領域に検出対象物質が結合され、前記検出対象物質に結合する抗体が設けられた第１粒子が前記検出対象物質に結合され、前記抗体に結合する抗原が設けられて金属により形成されかつ前記第１粒子と異なる複素屈折率を有する第２粒子が前記第１粒子に結合された前記分析用基板にレーザ光を照射し、前記反応領域からの反射光の受光レベルを検出して受光レベル信号を生成する光ピックアップと、
前記反応領域において所定の信号レベルよりも高い信号レベルの受光レベル信号を粒子検出信号として抽出する判定回路と、
前記粒子検出信号に基づいて検出対象物質を検出する計数回路と、
を備え、
前記第２粒子が結合した前記第１粒子に起因する受光レベル信号は、前記所定の信号レベルよりも高いことを特徴とする分析装置。
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