JP6210009B2

JP6210009B2 - 試料分析用基板及び基板分析装置

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Publication number: JP6210009B2
Application number: JP2014065010A
Authority: JP
Inventors: 辻田　公二; 公二辻田; 雅之小野; 祐一長谷川; 柳生　慎悟; 慎悟柳生; 糸長　誠; 誠糸長
Original assignee: JVCKenwood Corp
Current assignee: JVCKenwood Corp
Priority date: 2013-09-30
Filing date: 2014-03-27
Publication date: 2017-10-11
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Also published as: JP2015092148A

Description

本発明は、各種の細胞が分泌するエクソソームを分析するための試料分析用基板及び基板分析装置に関する。

疾病と関連付けられている特定の抗原（または抗体）をバイオマーカとして検出して分析することで、疾病の発見や治療の効果等を定量的に分析することが広く行われている。近年、エクソソーム（exosome）と称されている微小な膜小胞が新たなバイオマーカとして期待されている。

エクソソームは、血液，リンパ液，唾液，尿，母乳，精液等に含まれている。エクソソームは液体中では概略球形であり、直径は数十〜１００ｎｍ程度である。エクソソームは、脂質二重膜で覆われており、脂質二重膜には、様々な物質、例えば膜たんぱく質が存在している。なお、エクソソームは、マイクロベシクル、細胞外小胞と称されることもあり、複数の呼称が存在している。

国際公開第２００９／０９２３８６号

特許文献１には、免疫学的測定法（イムノアッセイ法）を用いてエクソソームを検出して分析することが記載されている。特許文献１に記載されている免疫学的測定法を用いると、エクソソームの脂質二重膜に存在する膜たんぱく質を抗原とする抗体を認識することによってエクソソームを検出することができる。しかしながら、膜たんぱく質の数はエクソソームの個体で一定ではないため、エクソソームの数を精度よく検出することができない。

そこで、エクソソームを高精度に検出することができる試料分析用基板が求められている。エクソソームを高精度に検出することができれば、エクソソームを高精度に定量的に測定することが可能となる。併せて、エクソソームを高精度に検出することができる試料分析用基板を簡易に製造することができる試料分析用基板の製造方法、エクソソームを高精度に検出することができる基板分析装置も求められる。

本発明はこのような要望に対応するため、エクソソームを高精度に検出することができる試料分析用基板、及び、エクソソームを高精度に検出することができる基板分析装置を提供することを目的とする。

本発明は、円形の基板と、前記基板の表面に周方向に配列されて形成され、検出対象のエクソソームに存在する抗原と結合する抗体を固定させる凹状のピットと、前記表面の前記ピット以外の部分に形成され、前記抗体の固定を防止する抗体固定防止面とを備え、前記ピットの前記基板の半径方向における幅は、前記エクソソームの平均粒径の４倍よりも小さいことを特徴とする試料分析用基板を提供する。

また、本発明は、上記の試料分析用基板であり、前記ピットには前記抗体が固定され、前記抗体には前記エクソソームが結合している試料分析用基板を再生する光ディスクドライブと、前記光ディスクドライブが前記試料分析用基板を再生することによって生成される再生信号に基づいて、前記エクソソームの存在を検出する検出装置とを備えることを特徴とする基板分析装置を提供する。

本発明の試料分析用基板によれば、エクソソームを高精度に検出することが可能となる。本発明の基板分析装置によれば、エクソソームを高精度に検出することができる。

第１実施形態の試料分析用基板を示す部分斜視図である。第１実施形態の試料分析用基板に抗体を含む液体を滴下した状態を示す部分断面図である。第１実施形態の試料分析用基板のピットに抗体を固着させた状態を示す部分断面図である。第１実施形態の試料分析用基板のピットによってエクソソームを捕捉した状態を示す部分断面図である。第１実施形態の試料分析用基板によってエクソソームを定量的に測定する方法の一例を模式的に示す部分断面図である。図５に示す方法を用いたときのレーザ光の反射光に基づく再生信号波形を示す波形図である。第２実施形態の試料分析用基板を示す部分斜視図である。第２実施形態の試料分析用基板に抗体を含む液体を滴下した状態を示す部分断面図である。第２実施形態の試料分析用基板のピットに抗体を固着させた状態を示す部分断面図である。第１実施形態の試料分析用基板の製造方法を示す図である。第２実施形態の試料分析用基板の製造方法を示す図である。一実施形態の基板分析装置を示すブロック図である。各実施形態の試料分析用基板にエクソソームを固定させるために用いるジグの構成例を示す斜視図である。基板分析装置によって各実施形態の試料分析用基板を分析する前の準備の工程を示すフローチャートである。第１実施形態の試料分析用基板のピットが捕捉したエクソソームをビーズによって修飾した状態を示す断面図である。図１４に示す準備の工程によって、各実施形態の試料分析用基板にエクソソームが固定されたエクソソーム固定領域が形成されている状態を概念的に示す図１４のステップＳ１１の具体的な工程を示すフローチャートである。第１実施形態の試料分析用基板上に形成されているエクソソーム固定領域の状態を概念的に示す部分拡大図である。各実施形態の試料分析用基板を再生したときの再生信号波形の例を示す波形図である。一実施形態の基板分析装置が図１９に示す再生信号波形に基づいて検出した検出結果を示す図である。

以下、各実施形態の試料分析用基板及びその製造方法、一実施形態の基板分析装置について、添付図面を参照して説明する。

＜第１実施形態の試料分析用基板＞
図１において、第１実施形態の試料分析用基板１００は、例えば円形の樹脂基板１０を備える。図１は、試料分析用基板１００を破断した状態の部分斜視図である。樹脂基板１０は中心部に光ディスクと同様の貫通孔を有していてもよい。

樹脂基板１０は、一般的な光ディスク用基板に用いられているポリカーボネート樹脂ではなく、疎水性を有する樹脂材料によって形成されていることが好ましい。樹脂基板１０は、分子構造内に極性基を有さない炭化水素のみから構成される樹脂材料により形成されていることが好ましい。

樹脂基板１０には、凸状のランド１０Ｌと凹状のグルーブ１０Ｇとが直径方向に交互に並んで形成されている。グルーブ１０Ｇの深さは、２０〜８０ｎｍである。樹脂基板１０の表面は、略長丸穴状のピット１２の部分を除き、抗体固定防止膜（抗体固定防止面）として機能する無機レジスト膜１１によって覆われている。無機レジスト膜１１の厚さは、３０〜１００ｎｍであり、好ましくは４０〜６０ｎｍである。

後述するように、グルーブ１０Ｇの底面を覆っている無機レジスト膜１１が部分的に除去されることによって、凹状のピット１２が形成されている。ピット１２の部分は、樹脂基板１０が露出している。

なお、後述する試料分析用基板１００の製造方法による製造工程で、グルーブ１０Ｇの側面の底面近傍の部分も、無機レジスト膜１１が除去される場合がある。グルーブ１０Ｇの側面の部分についても、抗体の固定を防止することが好ましいが、側面であれば、抗体防止膜がなくてもエクソソームの検出精度を確保できる。

図２は、試料分析用基板１００をグルーブ１０Ｇの幅方向の中央で周方向に切断した状態を示す部分断面図である。図２に示すように、ピット１２の底面には無機レジスト膜１１が存在していない。試料分析用基板１００を用いて、所定の生体試料を分析する際には、試料分析用基板１００の表面に、エクソソーム内に存在している膜たんぱく質との抗原抗体反応によって結合する抗体６０を含む液６０Ｆを滴下させる。

すると、図３に示すように、抗体６０はピット１２の底面に疎水結合によって固着する。ランド１０Ｌの上面は抗体固定防止膜として機能する無機レジスト膜１１によって覆われているため、ランド１０Ｌの上面には抗体６０は結合しない。

なお、抗体固定防止膜は、抗体６０の固定を完全に防止して、抗体６０を全く結合させないことが好ましいが、必ずしも完全に防止する必要はなく、少なくとも、ピット１２の部分よりも、抗体６０を結合しづらくすればよい。ピット１２の部分よりも、抗体６０を結合しづらくすることも含めて「防止」と称することとする。

また、製造を簡易にする点から、抗体固定防止膜は無機レジスト膜１１で形成することが好ましいが、これに限らず、他の方法で抗体固定防止膜を形成してもよい。例えば、表面形状の粗さを調整して撥水性を持たせることで抗体６０を結合しづらくてもよい。

図４は、エクソソーム５０の膜たんぱく質５２が抗体６０と結合して、エクソソーム５０がピット１２内に固定された状態を示している。図４も、試料分析用基板１００をグルーブ１０Ｇの幅方向の中央で周方向に切断した状態を示す部分断面図である。

ランド１０Ｌの上面及びグルーブ１０Ｇのピット１２が形成されていない部分の底面は無機レジスト膜１１によって覆われている。よって、ランド１０Ｌの上面及びグルーブ１０Ｇのピット１２が形成されていない部分の底面には抗体６０が結合していないため、ピット１２以外の部分にエクソソーム５０が固定されることはほとんどない。

エクソソーム５０の直径は、数十〜１００ｎｍ程度である。無機レジスト膜１１の厚さを３０〜１００ｎｍとすればピット１２の深さが３０〜１００ｎｍとなり、エクソソーム５０が良好に捕捉される。

半径方向におけるピット１２の最も狭い部分の幅は、エクソソーム５０の平均粒径よりも大きく、平均粒径の４倍よりも小さいのが好ましい。第１実施形態の試料分析用基板１００では、ピット１２がグルーブ１０Ｇの幅の全体に形成されているとすれば、ピット１２の最も狭い部分の幅はグルーブ１０Ｇの幅となる。ピット１２の幅とエクソソーム５０の平均粒径との大きさの関係をこのようにすれば、１つのピット１２に１つのエクソソーム５０が捕捉される可能性が高くなる。

ところで、エクソソーム５０の平均粒径とは、エクソソーム５０の粒径を任意の測定方法で測定した値の平均値を意味する。測定方法としては、例えば、ナノ粒子トラキング法を用いた、エクソソーム５０が溶液中にある状態で観測する湿式の測定方法や、透過型電子顕微鏡でエクソソーム５０の形態を保ったまま観測する乾式の測定方法がある。

後者の測定方法では、エクソソーム５０の形態を保ったまま乾式で観測可能とするために、エクソソーム５０を含む試料に対して細胞を観測する手法に準じた処理を施す。

具体的には、試料を基体上に固定し、低濃度のエタノールから純度１００％のエタノールまで、ステップごとにエタノールの濃度を高くして数ステップをかけてエタノールの含浸を繰り返す。これによって、試料中の水分がエタノールへと置換されて脱水される。

次に、試料を、エタノールに可溶な合成樹脂を含む溶液で含浸することによって、エタノールを合成樹脂に置換する。そして、合成樹脂に置換された試料を薄片化して観測する。

また、エクソソーム５０を含む試料を急速冷凍することにより、エクソソーム５０の形態を保ったまま脱水して観測可能とすることもできる。

グルーブ１０Ｇの側面の底面近傍の部分も樹脂基板１０が露出している場合には、抗体６０はグルーブ１０Ｇの側面の底面近傍にも固着することがある。しかしながら、ほとんどの場合、エクソソーム５０はピット１２の底面に固着している抗体６０と結合する。

図５は、エクソソーム５０を定量的に測定する方法の一例を示している。図５も、試料分析用基板１００をグルーブ１０Ｇの幅方向の中央で周方向に切断した状態を示す部分断面図である。図５に示す左右のピット１２のうち、右側のピット１２にはエクソソーム５０が捕捉されており、左側のピット１２にはエクソソーム５０が捕捉されていない。一点鎖線にて示すレーザ光を集光レンズ７１によって集光させて、ピット１２上にスポット７２を形成させたとする。

図５では理解を容易にするため、２つのピット１２それぞれの上方に集光レンズ７１を配置しているが、実際には、１つの集光レンズ７１をそれぞれのピット１２に順次移動させていけばよい。

図６は、図５のようにレーザ光を照射したときの、レーザ光の反射光に基づく再生信号波形を示している。波形Ｗｆ０はエクソソーム５０が捕捉されていないピット１２からの再生信号波形であり、波形Ｗｆ１はエクソソーム５０が捕捉されたピット１２からの再生信号波形である。波形Ｗｆ０は閾値ＴＨを越えず、波形Ｗｆ１は閾値ＴＨを越える。

このように、エクソソーム５０が捕捉されたピット１２とエクソソーム５０が捕捉されていないピット１２とでは、レーザ光を照射したときの再生信号波形が異なるので、エクソソーム５０の数を計測することができる。

後述するように、エクソソーム５０の検出を容易とするために、エクソソーム５０を、エクソソーム５０の直径よりも大きい直径を有するビーズで修飾してもよい。エクソソーム５０をビーズで修飾した場合も、再生信号波形は波形Ｗｆ１であるとする。

第１実施形態の試料分析用基板１００によれば、ランド１０Ｌの上面及びグルーブ１０Ｇのピット１２が形成されていない部分の底面にエクソソーム５０が固定されることはほとんどないため、エクソソーム５０を高精度に定量的に測定することが可能である。

＜第２実施形態の試料分析用基板＞
図７は、第２実施形態の試料分析用基板２００を示す。図７において、図１と同一部分には同一符号を付し、共通部分の説明を適宜省略する。第２実施形態の試料分析用基板２００は、例えば円形の樹脂基板２０を備える。図７は、試料分析用基板２００を破断した状態の部分斜視図である。樹脂基板２０は中心部に光ディスクと同様の貫通孔を有していてもよい。

樹脂基板２０は、樹脂基板１０と同様、疎水性を有する樹脂材料であり、分子構造内に極性基を有さない炭化水素のみから構成される樹脂材料により形成されていることが好ましい。

樹脂基板２０の表面は、ランド及びグルーブのような凹凸を有さず、一様に平坦な平坦面となっている。樹脂基板２０の表面は、略長丸穴状のピット２２の部分を除き、無機レジスト膜１１によって覆われている。後述するように、樹脂基板２０の表面を覆っている無機レジスト膜１１が部分的に除去されることによって、凹状のピット２２が形成されている。ピット２２の部分は、樹脂基板２０が露出している。

図８は、試料分析用基板２００をピット２２の幅方向の中央で周方向に切断した状態を示す部分断面図である。ピット２２の底面には無機レジスト膜１１が存在していない。試料分析用基板１００を用いて、所定の生体試料を分析する際には、試料分析用基板２００の表面に、抗体６０を含む液６０Ｆを滴下させる。

すると、図９に示すように、抗体６０はピット２２の底面に疎水結合によって固着する。ピット２２以外の部分は無機レジスト膜１１によって覆われているため、抗体６０はピット２２以外の部分には固着しない。よって、エクソソーム５０はピット２２のみによって捕捉される。

ピット２２とエクソソーム５０との大きさの関係は、第１実施形態の試料分析用基板１００と同様である。

第２実施形態の試料分析用基板２００においても、ピット２２に捕捉されたエクソソーム５０は、図５，図６と同様に、定量的に測定されることになる。

＜第１実施形態の試料分析用基板の製造方法＞
図１０を用いて、図１に示す第１実施形態の試料分析用基板１００の製造方法を説明する。図１０の（ａ）〜（ｃ）は、樹脂基板１０を径方向に切断した状態を示している。まず、図１０の（ａ）に示すように、ランド１０Ｌ及びグルーブ１０Ｇよりなる連続溝が形成された疎水性を有する樹脂基板１０を用意する。

樹脂基板１０の樹脂材料としては、例えば、ポリエチレン，ポリプロピレン等のポリオレフィン，ポリスチレン等の芳香族炭化水素樹脂，脂環式ポリオレフィンを用いることができる。これらの中で、高い疎水性を有し、熱変形温度が比較的高く、透明性が高く、微細な凹凸の転写性に優れる脂環式ポリオレフィンが最も好ましい。

図１０の（ｂ）に示すように、樹脂基板１０のランド１０Ｌ及びグルーブ１０Ｇが形成されている側の面に、無機レジスト膜１１を例えば５０ｎｍの厚さとなるように、真空成膜法によって形成する。前述のように、無機レジスト膜１１の厚さは３０〜１００ｎｍでよく、好ましくは４０〜６０ｎｍである。

図１０の（ｂ）は、樹脂基板１０の表面に、検出対象のエクソソームに存在する抗原と結合する抗体の固定を防止する抗体固定防止膜を形成する抗体固定防止膜形成工程である。

次に、図１０の（ｄ）に示すように樹脂基板１０を矢印方向に回転させ、図１０の（ｃ），（ｄ）に示すように、グルーブ１０Ｇまたはランド１０Ｌにフォーカスサーボ及びトラッキングサーボをかけながら、グルーブ１０Ｇに変調したレーザ光を照射する。レーザ光を集光レンズ７３によって集光させることによって、グルーブ１０Ｇにはレーザ光のスポット７４が形成される。

図１０の（ｃ），（ｄ）では、レーザ光がグルーブ１０Ｇの幅を超えて照射されている。集光レンズ７３で集光したレーザ光はガウス分布を有するので、スポット７４の面積のうち、無機レジスト膜１１が感光する温度以上に温度を上昇させる強度を有する中央部分で無機レジスト膜１１が感光する。よって、ランド１０Ｌ上の無機レジスト膜１１は感光せず、グルーブ１０Ｇの底面の無機レジスト膜１１が感光する。

このとき、グルーブ１０Ｇの側面の底面近傍の部分の無機レジスト膜１１が感光することもある。

図１０の（ｄ）に示すように、グルーブ１０Ｇには、レーザ光によって感光した部分である記録マーク１２０が形成される。スポット７４の中央部分で無機レジスト膜１１が感光しつつ樹脂基板１０が矢印方向に回転するので、記録マーク１２０は周方向に長い略長丸穴状となる。

最後に、記録マーク１２０が形成された樹脂基板１０をアルカリ現像溶液に短時間浸して、記録マーク１２０を除去する。すると、図１０の（ｅ）に示すように、記録マーク１２０が除去された部分がピット１２となる。図１０の（ｅ）は、樹脂基板１０をグルーブ１０Ｇの幅方向の中央で周方向に切断した状態を示している。ピット１２の底面は疎水性の樹脂基板１０が露出し、ピット１２以外の部分には無機レジスト膜１１が残っている。

図１０の（ｃ）〜（ｅ）は、抗体固定防止膜である無機レジスト膜１１を部分的に除去して、抗体を固定させる凹状のピットを形成するピット形成工程である。

ピット形成工程は、具体的には、図１０の（ｃ），（ｄ）に示す記録マーク形成工程と、図１０の（ｅ）に示す基板露出工程とよりなる。記録マーク形成工程では、レーザ光によって無機レジスト膜１１を部分的に感光させて記録マーク１２０を形成する。基板露出工程では、記録マーク１２０を形成した樹脂基板１０を溶液に浸して記録マーク１２０を除去し、樹脂基板１０を露出させる。

図１０の（ｅ）は、図１に示す第１実施形態の試料分析用基板１００となる。図１０の（ａ）〜（ｅ）に示す製造方法によって、エクソソーム５０を高精度に検出することができる第１実施形態の試料分析用基板１００を簡易に製造することができる。

ところで、無機レジスト膜１１としては、露光に使用するレーザ光の波長での感光感度が高いタングステン（Ｗ）の酸化物を用いることが好ましい。タングステンの酸化物の１つであるＷＯ_２は室温で安定であり、加熱することによりＷＯ_３となる。

スパッタリング法で形成されたＷＯ_２はアモルファス構造であり、レーザ光を照射することにより加熱されて結晶構造のＷＯ_３となる。ＷＯ_３はアルカリ現像溶液に可溶であるので、上記のように、記録マーク１２０を除去することができる。

＜第２実施形態の試料分析用基板の製造方法＞
図１１を用いて、図７に示す第２実施形態の試料分析用基板２００の製造方法を説明する。図１１の（ａ）〜（ｃ）は、樹脂基板２０を径方向に切断した状態を示している。まず、図１１の（ａ）に示すように、表面に凹凸のない平坦面を有する疎水性の樹脂基板２０を用意する。樹脂基板２０の樹脂材料は、樹脂基板１０の樹脂材料と同様である。

図１１の（ｂ）に示すように、樹脂基板２０の表面に、無機レジスト膜１１を例えば５０ｎｍの厚さとなるように、真空成膜法によって形成する。

図１１の（ｂ）は、樹脂基板２０の表面に、検出対象のエクソソームに存在する抗原と結合する抗体の固定を防止する抗体固定防止膜を形成する抗体固定防止膜形成工程である。

次に、図１１の（ｃ）に示すように、無機レジスト膜１１が形成された樹脂基板２０を可動ステージ３０上に配置する。

無機レジスト膜１１にフォーカスサーボをかけながら変調したレーザ光を照射する。レーザ光を集光レンズ７３によって集光させることによって、無機レジスト膜１１にはレーザ光のスポット７４が形成される。スポット７４によって無機レジスト膜１１が感光すると、図１１の（ｄ）に示す記録マーク２２０が形成される。

図１１の（ｄ）に示すように、樹脂基板２０を矢印方向に回転させることによって、無機レジスト膜１１には周方向に配列した複数の記録マーク２２０が形成される。また、図１１の（ｃ）に示すように、可動ステージ３０を矢印方向に、例えば樹脂基板２０の１回転で３２０ｎｍ移動させることによって、記録マーク２２０は半径方向にも配列して形成される。

最後に、記録マーク２２０が形成された樹脂基板２０をアルカリ現像溶液に短時間浸して、記録マーク２２０を除去する。すると、図１１の（ｅ）に示すように、記録マーク２２０が除去された部分がピット２２となる。図１１の（ｅ）は、樹脂基板２０をピット２２の幅方向の中央で周方向に切断した状態を示している。ピット２２の底面は、疎水性の樹脂基板２０が露出し、ピット２２以外の部分には無機レジスト膜１１が残っている。

図１１の（ｃ）〜（ｅ）は、抗体固定防止膜である無機レジスト膜１１を部分的に除去して、抗体を固定させる凹状のピットを形成するピット形成工程である。

ピット形成工程は、具体的には、図１１の（ｃ），（ｄ）に示す記録マーク形成工程と、図１１の（ｅ）に示す基板露出工程とよりなる。記録マーク形成工程では、レーザ光によって無機レジスト膜１１を部分的に感光させて記録マーク２２０を形成する。基板露出工程では、記録マーク２２０を形成した樹脂基板２０を溶液に浸して記録マーク２２０を除去し、樹脂基板１０を露出させる。

図１１の（ｅ）は、図７に示す第２実施形態の試料分析用基板２００となる。図１１の（ａ）〜（ｅ）に示す製造方法によって、エクソソーム５０を高精度に検出することができる第２実施形態の試料分析用基板２００を簡易に製造することができる。

＜基板分析装置＞
次に、試料分析用基板１００，２００を用いてエクソソームを検出する一実施形態の基板分析装置を説明する。

図１２に示すように、一実施形態の基板分析装置３００は、概略的に、光ディスクドライブ制御装置３１０と、光ディスクドライブ３２０とより構成される。光ディスクドライブ制御装置３１０は、パーソナルコンピュータによって構成することができる。光ディスクドライブ３２０は、ブルーレイディスク再生装置によって構成することができる。

光ディスクドライブ制御装置３１０は、光ディスクドライブ３２０を制御する。光ディスクドライブ制御装置３１０は、光ディスクドライブ３２０が試料分析用基板１００，２００を再生することによって生成される再生信号に基づいて、エクソソームの存在を検出する検出装置としても機能する。

光ディスクドライブ制御装置３１０は、制御部３１１，入力部３１２，記憶部３１３，表示部３１４，Ａ／Ｄ変換器３１５を有する。制御部３１１は、機能的な内部構成として、カウンタ３１６と積算部３１７を有する。カウンタ３１６と積算部３１７を制御部３１１の外部に設けてもよい。Ａ／Ｄ変換器３１５を制御部３１１の内部に設けてもよい。

光ディスクドライブ３２０は、スピンドルモータ３２１，光ピックアップ（光ＰＵ）３２２，ＲＦ再生信号生成部３２３，フォーカス・トラッキング信号生成部３２４を有する。光ディスクドライブ３２０は、光ピックアップ３２２を径方向に移動させるトラバース機構（図示せず）を有する。

光ディスクドライブ３２０には、試料分析用基板１００，２００がピット１２，２２側を下面にした状態で装着される。スピンドルモータ３２１は、試料分析用基板１００，２００を回転させる。光ピックアップ３２２は、試料分析用基板１００，２００に対してレーザ光を照射し、試料分析用基板１００，２００からの反射光を受光する。

ＲＦ再生信号生成部３２３は、反射光の受光信号に基づいてＲＦ再生信号を生成する。受光信号の総和信号をＲＦ再生信号とすることができる。フォーカス・トラッキング信号生成部３２４は、反射光の受光信号に基づき、公知の方法によりフォーカス信号及びトラッキング信号を生成する。

光ピックアップ３２２は、フォーカス信号に応じて、試料分析用基板１００，２００に対する距離が調整される。これによって、レーザ光は試料分析用基板１００，２００上にフォーカスされる。

光ピックアップ３２２は、トラッキング信号に応じて径方向の位置が調整される。これによって、レーザ光は試料分析用基板１００，２００のトラックにトラッキングされる。

図１３及び図１４を用いて、試料分析用基板１００，２００にエクソソーム５０を固定させ、基板分析装置３００によって試料分析用基板１００，２００を分析する前の準備の工程を説明する。

試料分析用基板１００，２００は、例えば直径８ｃｍの円形であり、中心部に光ディスクと同様の貫通孔を有するとする。以下、試料分析用基板１００を用いる場合について説明する。

図１３は、試料分析用基板１００にエクソソーム５０を固定させるために用いるジグ４００を示している。ベース４０１の中央部には円柱状の突出部が形成されている。突出部には、雌ねじが形成された円柱状の凹部が形成されている。ベース４０１の突出部に試料分析用基板１００の貫通孔を通すことによって、試料分析用基板１００はベース４０１上に位置決めされている。

円形のウェル形成カバー４０２も、中心部に貫通孔を有する。ベース４０１の突出部にウェル形成カバー４０２の貫通孔を通すことによって、ウェル形成カバー４０２は試料分析用基板１００上に位置決めされている。ウェル形成カバー４０２上には、座金４０４が配置されている。

ウェル形成カバー４０２の径方向の端部近傍には、周方向に配列されたウェル402Wが形成されている。図１３に示す例では、ウェル402Wは１６個形成されている。ウェル402Wは、円柱状の貫通孔である。ウェル402Wの数は任意である。ウェル形成カバー４０２の内周側にさらにウェル402Wを形成してもよい。

ウェル形成カバー４０２の裏面、即ち、試料分析用基板１００と対向させる側の面には、ウェル402Wの開口を囲むように弾性体よりなるリング状のパッキング４０３が装着されている。パッキング４０３は、一例として、シリコーンゴムにより形成されている。

ウェル形成カバー４０２の裏面に環状の突起を設け、パッキング４０３に環状の溝を設けて、突起を溝に嵌め込んでもよい。ウェル形成カバー４０２の裏面に環状の溝を設け、パッキング４０３に環状の突起を設けて、突起を溝に嵌め込んでもよい。

ウェル形成カバー４０２には、周方向の位置を判別するための一対の突出部4021が形成されている。突出部4021は、ウェル402Wの位置を特定するマーカとして機能する。例えば、突出部4021が形成された位置のウェル402Wを番号１として、時計方向に順に番号１６まで番号付けすることができる。

ベース４０１，試料分析用基板１００，ウェル形成カバー４０２，座金４０４が重ねられた状態で、突出部に形成された凹部に蝶ボルト４０５が締め込まれている。パッキング４０３は圧力によって変形し、ウェル形成カバー４０２は試料分析用基板１００に密着している。

図１４において、試料分析を行うオペレータは、ステップＳ１にて、図１３に示すように、ベース４０１に、試料分析用基板１００とウェル形成カバー４０２とを装着して固定する。オペレータは、ステップＳ２にて、抗体６０を含む液６０Ｆをウェル402Wに分注する。これによって、ピット１２に抗体６０が固着される。液６０Ｆは緩衝溶液であるのがよい。

ステップＳ２にて用いる抗体６０としては、抗原である膜たんぱく質５２と反応する抗体を用いる。

オペレータは、ステップＳ３にて、液６０Ｆを排出して、ウェル402Wを洗浄する。オペレータは、ステップＳ４にて、試料分析用基板１００の表面を、スキムミルクを含む緩衝溶液を用いてブロッキング処理する。

スキムミルクはエクソソーム５０に付着しないたんぱく質を含むので、ブロッキング処理に好適である。同様の効果を奏するものであれば、ブロッキング処理に用いる物質はスキムミルクに限定されない。

オペレータは、ステップＳ５にて、スキムミルクを含む緩衝溶液を排出して、ウェル402Wを洗浄する。オペレータは、ステップＳ６にて、検出対象のエクソソーム５０を含む試料液をウェル402Wに分注する。これによって、ピット１２にエクソソーム５０が固定される。オペレータは、ステップＳ７にて、試料液を排出して、ウェル402Wを洗浄する。

図１４に示す例では、エクソソーム５０の検出を容易とするために、エクソソーム５０を修飾するためのビーズ７０（図１５に図示）を用いる。ビーズ７０は、例えば合成樹脂によって略球形に形成されている。ビーズ７０の直径Ｄは例えば２００ｎｍである。ビーズ７０には予め表面に抗体８０（図１５に図示）が固定されている。

オペレータは、ステップＳ８にて、ビーズ７０を含む液をウェル402Wに分注する。ビーズ７０を含む液は緩衝溶液であるのがよい。

ビーズ７０の内部に、フェライト等の磁性物質を包含させてもよい。磁性物質を包含したビーズ７０とすると、ステップＳ８で、ベース４０１の下面に磁石を配置することによってビーズ７０をピット１２の方向へと効率よく向かわせることができる。

オペレータは、ステップＳ９にて、ビーズ７０を含む液を排出して、ウェル402Wを洗浄する。オペレータは、ステップＳ１０にて、ベース４０１よりウェル形成カバー４０２を外し、試料分析用基板１００を洗浄して乾燥させる。

以上の工程によって、図１５に示すように、ピット１２にエクソソーム５０が固定され、エクソソーム５０がビーズ７０によって修飾された試料分析用基板１００を得ることができる。

オペレータは、ステップＳ１１にて、試料分析用基板１００を基板分析装置３００に装着し、基板分析装置３００による試料分析用基板１００の分析処理を実行させる。

図１４は、試料分析用基板１００のピット１２に抗体６０を固着させ、抗体６０にエクソソーム５０を固定させ、さらに、エクソソーム５０をビーズ７０で修飾する工程を簡略化して示している。

ウェル402Wに液が分注された状態の試料分析用基板１００を保管して所定時間経過させたり、所定時間振盪させたりすることがあってもよい。試料分析用基板１００を冷却して保管することがあってもよい。また、ウェル402Wや試料分析用基板１００の洗浄を複数回行うことがあってもよい。図１４では洗浄すると説明していない工程で洗浄を行うことがあってもよい。

図１４で説明した準備の工程によって、試料分析用基板１００には、図１６に示すように、ウェル402Wと対応した位置に、複数のピット１２にエクソソーム５０が固定された円形のエクソソーム固定領域Arexが形成される。

なお、１６個全てのウェル402Wを用いて試料分析用基板１００上にエクソソーム５０を固定させた場合には、エクソソーム固定領域Arexは図１６に示すように１６箇所となる。１６個のウェル402Wのうちの一部のウェル402Wを用いて試料分析用基板１００上にエクソソーム５０を固定させてもよい。この場合、エクソソーム固定領域Arexの数は、使用したウェル402Wの数に対応した数となる。

試料分析用基板１００には、試料分析用基板１００の周方向の位置を特定するためのマーカを設けるのがよい。図１６において、切り欠きＣｏは試料分析用基板１００の周方向の位置を特定するためのマーカとなっている。切り欠きＣｏを基準として、エクソソーム固定領域Arexの周方向の位置を特定することができる。

例えば、ウェル形成カバー４０２の突出部4021と切り欠きＣｏとの位置を合わせた状態で、試料分析用基板１００とウェル形成カバー４０２とを固定する。すると、図１６において、切り欠きＣｏの右側に位置するエクソソーム固定領域Arexを番号１（＃１）として、時計方向に順に番号１６（＃１６）まで番号付けすることができる。

突出部4021と切り欠きＣｏとの周方向の位置関係を規定することにより、ウェル形成カバー４０２のウェル402Wと、試料分析用基板１００のエクソソーム固定領域Arexとを対応付けることができる。

光ディスクドライブ３２０に、試料分析用基板１００の上面側と下面側との一方に発光部を設け、他方に受光部を設ける。試料分析用基板１００が回転して、発光部と受光部との間に切り欠きＣｏが位置するタイミングでは、受光部は発光部より発せられた光を受光する。これによって、エクソソーム固定領域Arexの周方向の位置を特定することができる。

図１２に戻り、光ディスクドライブ３２０は、図１６に示す試料分析用基板１００を再生する。ここでの再生とは、通常の光ディスクと同様に、試料分析用基板１００に対してレーザ光を照射し、試料分析用基板１００からの反射光に基づいて、ＲＦ再生信号を得ることである。

図１７を用いて、図１４のステップＳ１１の具体的な工程を説明する。図１７において、オペレータは、ステップS111にて、入力部３１２によって制御部３１１に試料分析用基板１００の測定条件を設定する。測定条件とは、番号１〜番号１６の１６個のエクソソーム固定領域Arexのうちのどれを測定対象とするかということである。

制御部３１１は、設定された測定条件に従って、光ディスクドライブ３２０を制御する。制御部３１１は、ステップS112にて、測定箇所に光ピックアップ３２２を移動させる。

図１８は、試料分析用基板１００上に形成されているエクソソーム固定領域Arexの状態を概念的に示している。ここでは理解を容易にするため、ランド１０Ｌ及びグルーブ１０Ｇの幅を拡大して示している。よって、エクソソーム固定領域Arexの大きさとランド１０Ｌ及びグルーブ１０Ｇの幅とのサイズ的な関係は実際の両者のサイズ的な関係を表していない。

図１８に示すように、１つのエクソソーム固定領域Arex内には、グルーブ１０Ｇよりなる複数のトラックが存在している。制御部３１１は、光ピックアップ３２２を、例えばエクソソーム固定領域Arex内の最内周側のトラックに移動させればよい。

光ディスクドライブ３２０は、ステップS113にて、フォーカス及びトラッキング制御しながら、試料分析用基板１００を再生する。光ディスクドライブ３２０は、制御部３１１による制御に基づき、エクソソーム固定領域Arex内のそれぞれのトラックを再生する。

Ａ／Ｄ変換器３１５は、ステップS114にて、ＲＦ再生信号生成部３２３によって生成されたＲＦ再生信号を２値化処理する。

図１９の（ａ）は、１トラックを再生したときの、それぞれのエクソソーム固定領域ArexからのＲＦ再生信号を２値化処理した信号波形の例を示している。図１９の（ａ）では、番号１〜番号３のエクソソーム固定領域Arexの信号波形が示されている。

図１９の（ｂ）は、番号１のエクソソーム固定領域Arexの信号波形を拡大した拡大図である。図１９の（ｂ）の信号波形をさらに拡大したものが図６に示す信号波形である。

カウンタ３１６は、ステップS115にて、図１９の（ｂ）における閾値ＴＨを越えた信号波形をカウントする。このとき、カウンタ３１６は、図１９の（ｂ）に示すように、エクソソーム固定領域Arexからの信号波形のみをカウントするように、ゲート信号Sgateによって信号波形をゲートするのがよい。

ゲート信号Sgateの時間長さは、図１８に示すエクソソーム固定領域Arexの直径Darexに対応した長さである。

カウンタ３１６によるそれぞれのトラックのカウント値は、順次、積算部３１７に入力される。積算部３１７は、ステップS116にて、１つのエクソソーム固定領域Arexの全てのトラックで得られたカウント値を積算する。制御部３１１は、ステップS117にて、積算値を記憶部３１３に記憶させる。

制御部３１１は、ステップS117にて積算値を表示部３１４に表示させてもよい。また、制御部３１１は、ステップS117にて積算値を記憶部３１３に記憶させた後、積算値を表示させる指示があったとき、記憶部３１３より積算値を読み出して表示部３１４に表示させてもよい。

制御部３１１は、ステップS118にて、他のエクソソーム固定領域Arexがあるか否かを判定する。他のエクソソーム固定領域Arexがあれば（YES）、制御部３１１は処理をステップS112に戻し、ステップS112以降の処理を繰り返す。

他のエクソソーム固定領域Arexがなければ（NO）、制御部３１１は処理を終了させる。

図６に示す波形Ｗｆ１の幅は、トラック上にビーズ７０が単独で存在しているか、複数のビーズ７０が連結した状態で存在しているかによって異なる。図１８は、トラック上にビーズ７０が単独で存在している状態を示している。２つまたはそれ以上のビーズ７０が連結する場合がある。

そこで、カウンタ３１６は閾値ＴＨを越えた信号波形の半値幅を複数に分類してカウントし、積算部３１７は半値幅ごとに積算値を求めるのがよい。

ところで、ブルーレイ規格では、Ｔをクロックの１周期として、２Ｔ〜８Ｔと称されるストラテジが用いられる。光ディスクドライブ３２０をブルーレイディスク再生装置で構成した場合、光ディスクドライブ３２０より出力されるＲＦ再生信号の信号波形をストラテジと同様の幅ごとに分類するのが都合がよい。

図２０は、信号波形を幅ごとに分類した積算値の例を示している。図２０では、ブルーレイ規格では用いられない１Ｔの幅の積算値も示している。５Ｔ以上の幅の信号波形は極めて少ないため、図２０では５Ｔまでを示している。

記憶部３１３には、測定対象とされた全てのエクソソーム固定領域Arexで得られた、図２０に示すような積算値のデータが記憶される。オペレータは、それぞれのエクソソーム固定領域Arexの積算値のデータを確認することによって、エクソソーム５０の数やエクソソーム５０が試料分析用基板１００上にどのように存在しているかを知ることができる。

以上のようにして、本実施形態の基板分析装置３００によれば、エクソソーム５０を高精度に検出することができる。

図１２に示す本実施形態の基板分析装置３００では、光ディスクドライブ制御装置３１０が、光ディスクドライブ３２０を制御する制御装置と、試料分析用基板１００，２００におけるエクソソーム５０の存在を検出する検出装置とを兼用している。

光ディスクドライブ３２０を制御する制御装置とエクソソーム５０の存在を検出する検出装置とを別々の構成としてもよい。

本発明は、以上説明した各実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変更可能である。図１７では、エクソソーム５０をビーズ７０で修飾した試料分析用基板１００，２００の分析工程を示しているが、エクソソーム５０をビーズ７０で修飾せず、エクソソーム５０の存在を直接的に検出する場合でも同様である。また、各実施形態を、適宜、組み合わせてもよい。

１０，２０樹脂基板（基板）
１０Ｇグルーブ
１０Ｌランド
１１無機レジスト膜（抗体固定防止面，抗体固定防止膜）
１２，２２ピット
５０エクソソーム
６０抗体
１００，２００試料分析用基板
１２０，２２０記録マーク
３００基板分析装置
３１０光ディスクドライブ制御装置（検出装置）
３２０光ディスクドライブ

Claims

円形の基板と、
前記基板の表面に周方向に配列されて形成され、検出対象のエクソソームに存在する抗原と結合する抗体を固定させる凹状のピットと、
前記表面の前記ピット以外の部分に形成され、前記抗体の固定を防止する抗体固定防止面と、
を備え、
前記ピットの前記基板の半径方向における幅は、前記エクソソームの平均粒径の４倍よりも小さい
ことを特徴とする試料分析用基板。
前記基板は疎水性を有する樹脂材料によって形成され、
前記ピットは前記基板が露出しており、
前記抗体固定防止面は無機レジスト膜により形成されている
ことを特徴とする請求項１に記載の試料分析用基板。
前記表面には凸状のランド及び凹状のグルーブからなる連続溝が形成され、
前記ピットは前記グルーブの底面に形成されている
ことを特徴とする請求項１または２に記載の試料分析用基板。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の試料分析用基板であり、前記ピットには前記抗体が固定され、前記抗体には前記エクソソームが結合している試料分析用基板を再生する光ディスクドライブと、
前記光ディスクドライブが前記試料分析用基板を再生することによって生成される再生信号に基づいて、前記エクソソームの存在を検出する検出装置と、
を備えることを特徴とする基板分析装置。
前記エクソソームはビーズによって修飾され、
前記検出装置は、前記ビーズの存在を検出することによって間接的に前記エクソソームの存在を検出する
ことを特徴とする請求項４に記載の基板分析装置。