ES2553027B1 - Un sistema para aplicaciones de biodetección - Google Patents

Abstract

Un sistema para aplicaciones de biodetección.#La presente invención se refiere a un sistema para aplicaciones de biodetección que comprende dos elementos básicos, un sustrato con una superficie funcionalizada y una nanopartícula, siendo el sistema capaz de potenciar el efecto plasmónico de la nanopartícula. La invención también se refiere a un biosensor que incorpora tal sistema, además de al procedimiento para detectar y cuantificar un analito diana seleccionado en una muestra usando tal sistema. Finalmente, la invención se refiere a un dispositivo que puede detectar el efecto optoplasmónico potenciado de las nanopartículas por medio del sistema de la invención o bien combinar la detección de tal efecto optoplasmónico con el análisis de los cambios en las características mecánicas en el sustrato.

Description

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DESCRIPCION

Un sistema para aplicaciones de biodeteccion CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion pertenece al campo de los biosensores. Mas particularmente, la presente invencion se refiere a un sistema para aplicaciones de biodeteccion que comprende dos elementos basicos, un sustrato con una superficie funcionalizada y una nanopartlcula, pudiendo el sistema potenciar el efecto plasmonico de la nanopartlcula. La invencion tambien se refiere a un biosensor que incorpora tal sistema, ademas de al procedimiento para detectar y cuantificar un analito diana seleccionado en una muestra usando tal sistema. Finalmente, la invencion se refiere a un dispositivo que puede detectar el efecto optoplasmonico potenciado de las nanopartlculas por medio del sistema de la invencion o bien combinar la deteccion de tal efecto optoplasmonico con el analisis de los cambios en las caracterlsticas mecanicas en el sustrato.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Biosensores

Un biosensor mide los cambios flsicos que una capa de reconocimiento biologico unida a un transductor solido experimenta cuando interacciona con una muestra que contiene las moleculas elegidas como diana. Asl, emplea la capacidad de algunas biomoleculas (receptores) para unirse especlficamente (reconocer) a biomoleculas complementarias (ligandos). Las interacciones mas tlpicas son hibridacion de acidos nucleicos complementarios y union de anticuerpo/antlgeno. Los biosensores son cada vez mas demandados en estudios biologicos fundamentales, investigacion de ciencias de la salud, descubrimiento de farmacos y diagnostico cllnico1"3. Dependiendo del cambio flsico medido, los biosensores pueden clasificarse en opticos, electricos y mecanicos.

Los biosensores opticos pueden dividirse principalmente en deteccion basada en marcas y deteccion sin marcas. Los biosensores basados en marcas mas comunmente usados se basan en deteccion basada en fluorescencia, las moleculas diana o bien las moleculas de biorreconocimiento se marcan con marcas fluorescentes, tales como colorantes; la intensidad de la senal de fluorescencia indica la cantidad de moleculas elegidas como diana. Mientras que la deteccion basada en fluorescencia es extremadamente sensible, sufre de laboriosos procedimientos de marcado que pueden tambien interferir con la funcion de la biomolecula. A diferencia, en la deteccion sin marcar, las moleculas elegidas como diana no son marcadas o alteradas, y se detectan en sus formas naturales. Una parte significativa de los sensores opticos sin marca mide el cambio del Indice de refraccion proximo a la superficie del sensor excitando un campo evanescente que disminuye exponencialmente en la disolucion a granel con una longitud caracterlstica entre decenas a cientos de nanometros4. El procedimiento de resonancia de plasmones superficiales (SPR) y los procedimientos de resonancia de plasmones superficiales localizados (LSPR) son los mas populares entre los biosensores opticos sin marca.

Entre los biosensores electricos, los dispositivos electroqulmicos han recibido tradicionalmente la mayor parte de la atencion5-7. Estos dispositivos normalmente acoplan enzimas que producen o consumen electrones tras el reconocimiento de sustratos a un transductor de electrodos. Muchas de estas enzimas catalizan especlficamente las reacciones de analitos cllnicamente importantes tales como glucosa, lactato, colesterol, aminoacidos, urato, piruvato, glutamato, alcohol, hidroxibutirato, por nombrar algunos. Los avances en la nanotecnologla tambien estan proporcionando biosensores electricos a escala nanometrica basados en nanoalambres y nanotubos semiconductores, en los que la apertura electroqulmica se produce a partir de un cambio en el potencial superficial local debido a la union a diana8-10.

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Entre los biosensores mecanicos, la microbalanza de cristal de cuarzo se ha convertido en una de las tecnicas mas establecidas11-13. Estos dispositivos se basan en resonadores de cristal de cuarzo (tales como aquellos usados en relojes), que son piezoelectricos y asl permiten la medicion directa de la deformacion del cristal por procedimientos electricos. En estos dispositivos, la frecuencia de resonancia se mide y relaciona con el cambio de masa inducido por la union del analito a la capa de reconocimiento inmovilizada sobre la superficie cristalina. Una subclase de biosensores mecanicos se denomina biosensores nanomecanicos, que sacan el mayor rendimiento del tamano de escala nanometrica de al menos una de sus dimensiones14-20.

Entre los procedimientos existentes, los biosensores mas satisfactorios en el campo biomedico incluyen bioensayos de deteccion del punto final tales como ELISA. Los ELISA son herramientas esenciales en el campo biomedico debido a su buena sensibilidad, simplicidad del ensayo, fiabilidad y alto rendimiento.

Por otra parte, dispositivos como los ensayos de flujo lateral son de sum a importancia en el corto tiempo de analisis necesario y se han miniaturizado satisfactoriamente y simplificado hasta el punto de que incluso es posible la prueba en casa. Sin embargo, la menor concentracion de analito que pueden detectar es comunmente de hasta 0,1 M, que no es suficientemente buena para detectar muchas dianas de importancia biologica. Por comparacion, el ELISA requiere un tiempo de analisis mucho mayor (~1 h), pero ofrece mucha mejor sensibilidad de concentracion (~1 pM).

Todavla esta en investigacion la tecnica de biodeteccion que pueda combinar excelente sensibilidad y especificidad con corto tiempo de analisis, junto con potencial de miniaturizacion. En particular, hay una alta demanda de tecnicas que puedan integrarse en un dispositivo de punto de cuidado que sean dignas de sensibilidad, capacidad de cuantificacion y buen intervalo dinamico. Hasta la fecha no se ha demostrado ninguna tecnica que proporcione esto. La capacidad para ser integrado en un dispositivo de punto de cuidado (POC) significa que los protocolos de deteccion deben ser simples, usar pequenos volumenes de muestra y no deben requerir etapas de preparacion y/o de lavado complicadas o qulmicas complejas para preparar las muestras y/o dispositivos de deteccion. Un bajo coste para los analisis completos y la larga estabilidad en almacen tambien es un requisito para obtener un producto comercialmente viable.

Biosensores basados en nanoparticulas

Hay enfoques en la tecnica anterior que han tenido exito en muchos, aunque no todos, los retos citados para dispositivos de POC. El uso de nanoparticulas (NP) ha tomado su parte en este exito. Particularmente, el oro y otras nanoparticulas de metales nobles se han usado en la deteccion de analitos. La resonancia de plasmones superficiales localizados (LSPR) en NP de oro se desplaza cuando cambia la constante dielectrica de alrededor, de manera que los desplazamientos en el pico espectral de LSPR facilitados por la union de biomoleculas proporcionan un procedimiento para la deteccion de analitos en muestras cllnicas. Diferentes enfoques de deteccion que hacen uso de este fenomeno a escala nanometrica se revisan en la referencia 21.

En un enfoque satisfactorio, llamado ELISA plasmonico, el desplazamiento de la resonancia de plasmones localizados facilitado por la agregacion de nanoparticulas de oro se usa para colorear la marca de deteccion de muy bajas concentraciones de un analito de interes. En la referencia 22, tanto PSA como el antlgeno p24 de la capside del VIH1 se detectan a concentraciones de tan solo 1 x 10-18 g/ml. En este procedimiento, el ciclo biocatalltico de una enzima genera disoluciones de NP coloreadas debido al hecho de que cuando la concentracion de peroxido de hidrogeno disminuye se forman NP agregadas. La union del analito promueve la agregacion de NP que a su vez da un color azul a la disolucion. Este cambio de color se usa como senal de deteccion que puede incluso ser seguida a simple vista y asl proporciona un

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enfoque de deteccion de bajo coste.

En otra metodologia relevante, el marcado de NP con diversas secuencias de ADN proporciona la capacidad de multiplexacion que no tendnan NP metalicas solas, ya que carecen de un intervalo de marcas de color para marcar cada reaccion espedfica. El asi llamado procedimiento de biocodigo de barras no solo se ha usado para la deteccion de ADN, sino que tambien ha tratado satisfactoriamente la deteccion de protefcas. Para despues, el biocodigo de barras se basa en sondas de micropartfculas magneticas con anticuerpos que se unen espedficamente a una diana de interes, por ejemplo, una protema clfcicamente relevante como antigeno prostatico espedfico (PSA) (vease la referencia 23) y sondas de nanopartfculas que estan codificadas con ADN que es unico para la protema diana de interes y anticuerpos que pueden emparedar la diana capturada por las sondas de micropartfculas. La separacion magnetica de las sondas complejadas y diana, seguido de la deshibridacion de los oligonucleotidos sobre la superficie de la sonda de nanopartfculas, permite la determinacion de la presencia de la protema diana que identifica la secuencia de oligonucleotidos liberada de la sonda de nanopartfculas. Debido a que la sonda de nanopartfculas lleva consigo un gran numero de oligonucleotidos para el evento de union a protema, hay una sustancial amplificacion de senales y la protema diana puede detectarse a bajas concentraciones (concentracion 30 atomolar). Alternativamente, una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) en los codigos de barras de oligonucleotidos puede reforzar la sensibilidad a 3 atomolar. Ensayos convencionales clfcicamente aceptados comparables tienen lmites de sensibilidad de 3 picomolar, seis ordenes de magnitud menos sensibles al que se observa con este procedimiento23. Una limitacion de esta tecnica es el tiempo de analisis requerido, hasta 100 minutos, dada la necesidad de separacion de las sondas complejadas y diana de la disolucion de muestra y posterior identificacion de las marcas de ADN. Con este procedimiento tambien es posible la cuantificacion. Un enfoque es realizar una PCR y/o electroforesis en gel, pero estos son procedimientos no adecuados para aplicaciones de punto de cuidado y excluyen el rapido analisis como se trata en la referencia 25.

Un procedimiento de deteccion alternativo se basa en el cam bio espectral en la luz dispersa cuando al menos dos NP se ponen proximas entre si26,27. El cambio de color es debido a un desplazamiento en la resonancia de plasm ones superficiales de las nanopartfculas de Au cuando al menos dos NP se ponen proximas entre si. Esto produce un desplazamiento de color detectable y un cambio en la intensidad de luz recogida que puede medirse opticamente. Los complejos de sonda de NP siempre comprenden dos o mas nanopartfculas unidas a un analito diana espedfico, esto se ha llamado un complejo de dispersion de la luz. Esto tiene la ventaja de que solo se detectan los agregados de NP, que contienen el analito. Las partfculas no agregadas, que incluyen aquellas que no contienen el analito diana, no son detectadas en este procedimiento. Esto permite la deteccion de agregados de NP en presencia de un exceso significativo de partfculas no agregadas. Este procedimiento ha demostrado excelente sensibilidad, mejor que 10 femtomoles de un oligonucleotido. Dentro de este procedimiento, el uso de iluminacion evanescente por medio de una gua de onda de soporte y deteccion colorimetrica basada en la dispersion ha demostrado ser 4 ordenes de magnitud mejor que las pruebas de manchas basadas en absorbancia (documento EP1639370).

Una forma de eliminar la necesidad de amplificacion por PCR a la vez que se mantiene una buena capacidad de multiplexacion es hibridar los complejos de dispersion de GNP sobre un soporte solido funcionalizado con secuencias conocidas en posiciones definidas, como se hace en las matrices fluorescentes. La posterior deteccion escanometrica de la luz dispersa sirve de senal biosensora y la capacidad de multiplexacion se obtiene por las posiciones predefinidas de las secuencias inmovilizadas conocidas. Normalmente, se necesita una forma de amplificar esta senal optica. Un procedimiento para la ampliacion de la senal de luz dispersa de las marcas de NP es la reduccion de plata promovida por nanopartfculas28 o respuesta colorimetrica por catalisis enzimatica sobre sustratos de silicio opticamente recubiertos29. Este procedimiento se usa para amplificar la senal optica y tambien permite cuantificar la cantidad

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de analito en la muestra30.

Biosensores basados en resonadores nanomecanicos

Los resonadores nanomecanicos han demostrado llmites de deteccion sin precedentes en la deteccion de masas de atomos y moleculas a vaclo. Los llmites de deteccion de masa se han empujado recientemente al intervalo de yoctogramos, es decir, puede medirse la masa de un unico proton. Dos componentes son esenciales para lograr la sensibilidad de la masa: dispositivos con dimensiones de escala nanometrica y altos factores de calidad (1000-100000) que implican mediciones a vaclo. Sin embargo, la deteccion de biomoleculas debe llevarse a cabo idealmente en disoluciones acuosas, el entorno natural en el que se producen los procesos biologicos. Los resonadores nanomecanicos en llquidos presentan un factor de calidad muy bajo (1-10) como consecuencia del amortiguamiento viscoso. Ademas, el llquido es arrastrado junto con el resonador nanomecanico, aumenta su masa eficaz y as! reduce la sensibilidad. La miniaturizacion de los dispositivos a la escala nanometrica no mejora estas limitaciones. Y, lo que es mas importante, la deteccion biologica requiere muchas mediciones repetitivas que solo pueden lograrse con dispositivos desechables y rentables que puedan ser tanto facilmente manipulados como medidos. Estos requisitos se satisfacen por matrices de micropalanca que estan comercialmente disponibles, pero no por los resonadores mecanicos de escala nanometrica del estado de la materia que todavla se fabrican a baja velocidad por tecnicas de nanofabricacion y son altamente irreproducibles en las dimensiones y respuesta mecanica. Ademas, la medicion de la frecuencia resonante de estos dispositivos en llquido es cientlfica y tecnicamente exigente. Estas limitaciones han limitado el exito de los resonadores nanomecanicos como sensores biologicos.

Resonadores nanomecanicos con marcas de masa.

Los resonadores nanomecanicos han hecho uso de NP para amplificar la senal, aqul, la union a masa mayor proporcionada por las marcas aumenta la respuesta mecanica del sensor. Aqul, una reduccion en la frecuencia de resonancia esta relacionada con masa anadida del complejo analito-NP que se une al resonador. A pesar de que los sensores nanomecanicos dinamicos han demostrado un buen rendimiento sin marcas; el marcado mejora ampliamente la especificidad y puede reducir el llmite de deteccion. Se ha demostrado que el marcado de muestras para la deteccion nanomecanica es ventajoso en los ensayos de punto final. Craighead y colaboradores demostraron en la referencia 31 que el marcado de un anticuerpo monoclonal con nanopart Iculas en un inmunoensayo tipo sandwich pudo mejorar el llmite de deteccion en tres ordenes de magnitud para alcanzar 2 ng/ml en la deteccion de protelnas prionicas y detectar incluso la presencia de 50 fg/ml de PSA enriquecido en un ruido de fondo de suero bovino fetal. La tecnica tambien es cuantitativa, ya que los autores encontraron una clara dependencia lineal de la respuesta de frecuencia sobre la concentracion de PSA. La capacidad para detectar concentraciones fM de una protelna diana en un ruido de fondo realista coloca a los sensores de palanca resonantes marcados en una excelente posicion para competir con todas las tecnicas innovadoras citadas, ademas de las tecnologlas mas establecidas. Todavla, los resonadores nanomecanicos todavla no se usan ampliamente en la cllnica. Esto es debido a que carecen de la robustez necesaria en la respuesta. Los pocos estudios que muestran un numero estadlsticamente significativo de pruebas muestran que el numero de positivos y negativos falsos es todavla demasiado alto. El desplazamiento de la frecuencia comunmente usado como senal de deteccion en estos sensores depende en gran medida de la adsorcion no especlfica sobre la superficie del dispositivo.

Una limitacion clave de los resonadores nanomecanicos es la adsorcion no especlfica. Los llmites de deteccion definitivos predichos por los enfoques teoricos pueden estar lejos de los llmites de deteccion reales cuando biosensores nanomecanicos funcionalizados con biorreceptores se sumergen en disoluciones complejas, tales como suero, para detectar la presencia de biomarcadores en tiempo real o ex-situ. En esta situacion, otras moleculas a

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concentracion mucho mayor, incluso billones de veces mayor, estan presentes en la disolucion. Aunque estas moleculas tienen mucha menor afinidad por los receptores injertados con sensores, su alta concentracion impone el llmite de deteccion real. Por ejemplo, los biomarcadores del cancer estan en plasma sangulneo a una concentracion en el intervalo de 1 ng/ml, mientras que la concentracion de protelnas no deseadas es de aproximadamente 70 mg/ml. La sensibilidad para lograr la deteccion de biomarcadores del cancer se satisface por la mayorla de los biosensores nanomecanicos. Sin embargo, la selectividad que determina la tasa de positivos falsos y negativos falsos ha recibido poca atencion. La deteccion de biomarcadores de cancer en medios complejos tales como suero requiere selectividad superior a 1 parte por millon.

Predicciones teoricas indican que la selectividad requerida para la deteccion de biomarcadores en medios complejos puede lograrse funcionalizando los sensores con una alta densidad superficial de receptores32. Esta prediccion esta de acuerdo con los hallazgos en biosensores nanomecanicos basados en tension superficial, en los que los mejores resultados se obtienen a altas densidades de empaquetamiento de receptores. Una segunda prediccion teorica es que la etapa de pasivacion superficial intermedia adicional por pequenas moleculas inertes despues de la incubacion del receptor podrla reducir significativamente la bioincrustacion y ayuda a lograr mejor selectividad. De forma interesante, el tamano y geometrla de la molecula bloqueante usada para volver a llenar los vaclos en la superficie del sensor desempena una funcion crltica. Esto esta de acuerdo con los resultados de recientes analisis estadlsticos del efecto de inmunorreacciones sobre la respuesta de biosensores nanomecanicos en el modo estatico33. El estudio comprendio 1012 palancas con diferentes densidades superficiales de anticuerpo, dos estrategias de bloqueo basadas en polietilenglicol (PEG) y albumina de suero bovino (BSA), controles rigurosos con anticuerpos no especlficos y protelnas pequenas tales como lisozimas. El estudio revelo que el rendimiento del ensayo depende crlticamente de tanto la densidad superficial de anticuerpos como las estrategias de bloqueo. Encontraron que las condiciones optimas implican densidades superficiales de anticuerpos proximas, pero inferiores, a la saturacion y bloqueo con PEG.

Ademas, se han propuesto otros enfoques practicos para minimizar la adsorcion no especlfica y potenciar la selectividad. El uso de matrices de elementos nanomecanicos con una referencia interna ayuda a rechazar fuentes de ruido comunes, que incluyen adsorcion no especlfica. Otro enfoque es la implementacion de los ensayos de sandwich tradicionalmente usados en ELISA. En este ensayo, el sistema nanomecanico se funcionaliza con un receptor molecular especlfico para el biomarcador de interes. Despues de la exposicion del sistema nanomecanico a la muestra, el dispositivo se incuba con receptores secundarios unidos a una molecula o un material que actua de amplificador de senales, tal como una nanopartlcula para aumentar el efecto de la masa. El uso de dos receptores diferentes potencia ampliamente la sensibilidad y especificidad. Este enfoque se aplico para detectar protelnas prionicas con resonador nanomecanico, que en formas conformacionalmente alteradas se sabe que producen enfermedades neurodegenerativas en animales, ademas de seres humanos34. La frecuencia de resonancia se detecto ex-situ en alto vaclo. Para la incubacion directa de los resonadores nanomecanicos funcionalizados con un anticuerpo primario contra la protelna prionica, el llmite de deteccion fue aproximadamente 20 gg/ml. Cuando los resonadores se sometieron a una etapa de incubacion posterior con anticuerpos secundarios que se unen, el llmite de deteccion se potencio 3 ordenes de magnitud, siendo aproximadamente 2 ng/ml.

Una segunda estrategia prometedora que mantiene la caracterlstica sin marca natural de los biosensores nanomecanicos es implementar microfluldica para la purificacion y preconcentracion de muestras. El potencial de este enfoque se ha demostrado con nanosensores de nanoalambre sin marca. En este trabajo, un chip de purificacion microfluldica captura simultaneamente multiples biomarcadores de muestras de sangre y los libera, despues de lavar, en tampon purificado para la deteccion por los nanosensores8. Este enfoque de dos etapas alsla el detector del entorno complejo de sangre completa, y reduce su sensibilidad

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requerida minima pre-concentrando eficazmente los biomarcadores. Los autores demostraron deteccion cuantitativa y especlfica de dos antlgenos del cancer modelo de una muestra de 10 ml de sangre completa en menos de 20 min.

A pesar de que la nanotecnologla haya proporcionado biosensores con niveles impredecibles de sensibilidad sin necesidad de marcado, los nanosensores tambien han mostrado dificultades significativas en cuestiones referentes a la especificidad y reproducibilidad, y de ahl que todavla no esten listos para la seleccion de biomarcadores en sangre. Esto surge de la dificultad extrema de ‘encontrar’ biomarcadores de protein a de baja abundancia en un ‘pajar’ de protelnas plasmaticas, algunas de ellas a concentraciones al menos siete ordenes de magnitud superiores (albumina 40 mg/ml aprox). Asl, la situacion es que el alto ruido biologico fijado por las interacciones no especlficas supera ampliamente el ruido intrlnseco de la mayorla de los nanosensores existentes. En pocas palabras, el problema no es la sensibilidad, sino:

• Especificidad; para discriminar trazas de biomarcadores en la compleja mezcla de protelnas de la sangre.

• Fiabilidad, para minimizar los dolorosos positivos falsos y negativos falsos en el diagnostico de pacientes.

Ahora, los autores de la presente invencion han encontrado un sistema para aplicaciones de biodeteccion que permite llmites de deteccion ultrabajos ya que discrimina concentraciones al borde de 10 ag/ml. Ademas, el sistema permite la deteccion de analitos diana en ruidos de fondo biologicos complejos como, por ejemplo, muestras de sangre, sin la necesidad de ninguna etapa de purificacion. La invencion se basa en un ensayo optico tipo sandwich que se aprovecha del sorprendente e inesperado potenciamiento del efecto plasmonico causado en las nanopartlculas por la combinacion de la naturaleza y diseno particulares del sustrato usado en el biosensor y la naturaleza y dimensiones particulares de la nano part (cula. Este sistema puede adaptarse en un dispositivo nanomecanico con el fin de analizar tanto senales optoplasmonicas como mecanicas de manera que mejore la fiabilidad de la deteccion. La robustez de este biosensor dual conduce a una tasa de positivo falso y negativos falsos extremadamente baja, «2 x 10-4 a una concentracion ultrabaja de 100 ag/ml, proporcionando asl una excelente solucion para ser integrada en un dispositivo de POC.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

Esta previsto que las siguientes definiciones ayuden en el entendimiento e interpretacion de la presente invencion:

Biosensor: Dispositivo analltico que comprende un elemento de reconocimiento biologico (por ejemplo, enzima, receptor, ADN, anticuerpo, o microorganismo) en contacto Intimo con un transductor de senales electroqulmicas, mecanicas, opticas, termicas, acusticas u otras senales flsicas que juntos permiten el analisis de propiedades qulmicas o deteccion o cuantificacion de analitos diana.

Material dielectrico: Un material dielectrico es un aislante electrico que puede polarizarse por un campo electrico aplicado.

Superficie funcionalizada o funcionalizacion superficial: Un procedimiento o tecnica para introducir grupos funcionales qulmicos en una superficie. Esta se usa en biosensores para inmovilizar un elemento de reconocimiento en una superficie, en la presente invencion sobre la superficie del sustrato.

Elemento de reconocimiento: Es el elemento del sistema inmovilizado y que funcionaliza la superficie del sustrato que puede reconocer y unirse especlficamente al analito diana. El elemento de reconocimiento puede seleccionarse de, pero no se limita a, un anticuerpo, un receptor, un peptido, una protelna, un hidrato de carbono, un acido nucleico, una celula, un

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microorganismo o una parte de los mismos.

Elemento de deteccion: Es el elemento del sistema unido a la nanopartlcula y que puede reconocer y unirse especlficamente al analito diana. El elemento de deteccion conjuntamente con la nanopartlcula permiten la deteccion del analito diana cuando esta presente en la muestra.

Analito diana: Es el elemento buscado para la deteccion y/o cuantificacion. Puede ser de cualquier naturaleza tal como moleculas organicas o inorganicas (farmacos, hormonas, colesterol, etc.), moleculas biologicas (peptidos o protelnas, moleculas de acidos nucleicos, factores de crecimiento, biomarcadores etc.), celulas (celulas protozoicas, celulas bacterianas, celula fungica, celulas eucariotas) o fragmentos celulares (paredes bacterianas, organulos celulares como mitocondrias, veslculas celulares, etc.) o virus.

Coeficiente de extincion: El coeficiente de extincion es la parte imaginaria del Indice complejo de refraccion.

Indice de refraccion: El Indice de refraccion de una sustancia (medio optico) es un numero adimensional que describe como la luz, o cualquier otra radiacion, se propaga a traves de ese medio.

Material circundante: Es el material subyacente a ambas superficies del sustrato en el sistema de la invencion. El Indice de refraccion del material circundante es de relevancia en el logro del efecto plasmonico potenciado.

Efecto plasmonico: Es el fenomeno producido en las nanopartlculas que tienen propiedades plasmonicas cuando se irradian con una radiacion electromagnetica apropiada. El efecto plasmonico se produce por las oscilaciones de electrones libres inducidas en un metal por una onda electromagnetica.

Anticuerpo: Una protelna en forma de Y (inmunoglobulina) sobre la superficie de linfocitos B que es secretada en la sangre o linfa en respuesta a un estlmulo antigenico, tal como una bacteria, virus, parasito u organo trasplantado, y que neutraliza el antlgeno uniendose especlficamente a el. La deteccion de la formacion de pares anticuerpo-antlgeno puede seguirse por varios procedimientos y es la base de muchos biosensores.

Receptor: Es una estructura biologica que puede detectar estlmulos qulmicos de su entorno. Los receptores normalmente estan presentes sobre la superficie de celulas y estan adaptados para detectar un tipo particular de molecula que es responsable de inducir una respuesta en la celula una vez en contacto con el receptor.

Peptido: Cadenas cortas de monomeros de aminoacidos unidos por enlaces peptldicos.

Hidrato de carbono: Se refiere en el contexto de la invencion a moleculas de oligosacaridos o polisacaridos complejas que tienen capacidad de unirse a dianas especlficas. Como un ejemplo puede citarse lipopolisacarido.

Acido nucleico: Cualquier molecula polimerica u oligomerica que tiene un esqueleto que contiene una secuencia de bases nitrogenosas -adenina (A), timina (T), citosina (C) y guanina (G). En el contexto de la presente invencion, las moleculas de acidos nucleicos incluyen, entre otras, moleculas de ADN, moleculas de ARN, aptameros o moleculas de PNA.

Nanopartlcula de metamaterial plasmonico: Es una nanopartlcula hecha de un material artificial manipulado para manifestar propiedades plasmonicas.

Transmitancia: La transmitancia es la fraccion de luz incidente (radiacion electromagnetica) a una longitud de onda especificada que pasa a traves de una muestra.

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Reflectancia: La reflectividad o reflectancia es la fraccion de potencia electromagnetica incidente que es reflejada de una superficie de separacion.

Deteccion: Es la accion de identificar la presencia o ausencia del analito diana en la muestra.

Cuantificacion: Es la accion de determinar la concentracion de un analito diana dentro de la muestra.

Muestra: Una preparacion de un fluido biologico que va a analizarse normalmente en forma llquida aunque tambien es posible como una forma solida que va a resolverse en forma llquida o reconstituible.

Radiacion electromagnetica: La radiacion electromagnetica es un fenomeno fundamental del electromagnetismo, comportandose como ondas que se propagan a traves del espacio y que llevan energla radiante. Una onda electromagnetica tiene tanto componentes de campo electrico como magnetico, que oscilan en un relacion fija entre si, perpendiculares entre si y perpendiculares a la direccion de propagacion de energla y ondas.

Dispersion de la luz: La dispersion de la luz es un tipo de interaccion entre la materia y una onda electromagnetica. Cuando una onda que se propaga es incidente sobre una superficie, la onda reflejada se concentra normalmente en la direccion especular como se ha determinado por las muy conocidas leyes de la reflexion. Ademas de la reflexion especular tambien hay un componente difuso que es irradiado sobre un amplio intervalo de angulos centrados sobre el haz especular que comunmente se conoce como dispersion de la luz. Los procedimientos de dispersion pueden producirse a partir de la rugosidad no cero de la superficie o por la presencia de pequenas partlculas depositadas sobre la misma.

Absorcion: La absorcion de radiacion electromagnetica es la forma en la que la energla de una radiacion electromagnetica es recogida por la materia, normalmente los electrones de un atomo. Asl, la energla electromagnetica se transforma en energla interna del absorbedor, por ejemplo, energla termica.

Senal de extincion: El termino “extincion” significa la perdida de luz en un haz optico transmitido cuando pasa a traves de un medio u objeto. Dos mecanismos diferentes contribuyen a la extincion: absorcion y dispersion.

Un primer objetivo de la invencion es un sistema para aplicaciones de biodeteccion que comprende:

a. un sustrato de material dielectrico que tiene al menos una superficie funcionalizada con un elemento de reconocimiento que puede unirse especlficamente a un analito diana y

b. al menos una nanopartlcula con propiedades plasmonicas que comprende al menos un elemento de deteccion unido a ella y que puede unirse especlficamente al analito diana en una disposicion tipo sandwich,

caracterizado porque:

- el sustrato de material dielectrico tiene un espesor entre 0,1 pm y 5 pm y un coeficiente de extincion inferior a 0,3,

- la nanopartlcula tiene al menos una de sus dimensiones con un tamano de 2 nm a 300 nm y

- porque la relacion entre el Indice de refraccion del material dielectrico y el material circundante es superior a 1,1.

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El sistema de la invencion esta adaptado para procedimientos de deteccion y cuantificacion tipo sandwich (vease, por ejemplo, la Figura 1). El uso de un elemento de reconocimiento y un elemento de deteccion es un primer aspecto que mejora ampliamente la sensibilidad y especificidad del sistema. Sin embargo, el aspecto mas sorprendente y ventajoso del sistema de la invencion se deriva del potenciado efecto plasmonico que puede lograrse en detecciones optoplasmonicas. Este efecto particular permite llmites de deteccion ultrabajos. El efecto es un modo plasmonico hlbrido que resulta de la combinacion de la naturaleza y diseno particulares de elementos que forman el sistema, concretamente el sustrato y la nanopartlcula.

El sustrato tiene que ser un material dielectrico de manera que pueda tener lugar el fenomeno de resonancia de plasmones superficiales. Cualquier material dielectrico en el intervalo espectral electromagnetico de interes es adecuado en el sistema de la invencion. La unica condicion es que su coeficiente de extincion deba ser inferior a 0,3. En una realizacion particular, el material dielectrico es cuarzo, silicio, nitruro de silicio, carburo de silicio, grafeno, pollmeros tales como fotorresistentes, por ejemplo SU8, e hidrogeles tales como mezclas de PEG y PLA o de DEXTRANO y PEG. Los materiales dielectricos mas preferidos son silicio o nitruro de silicio.

Otro aspecto importante del sistema de la invencion es el diseno del sustrato. Hay dos puntos clave en el diseno del sustrato que tienen que cumplirse con el fin de lograr el efecto plasmonico potenciado en el sitio de la nanopartlcula.

Lo primero es que el espesor del sustrato deba estar entre 0,1 pm y 5 pm, mas preferentemente entre 0,25 pm y 2 pm. Para espesores mayores, la radiacion electromagnetica incidente es refractada y no puede producir un efecto multirreflector dentro de la cavidad del sustrato que es el fenomeno flsico que al final contribuye a producir la potenciacion del efecto plasmonico (vease la Figura 2a). En la practica, la potenciacion del efecto plasmonico es un modo hlbrido que resulta del acoplamiento del modo de plasmones superficiales localizados sobre las nanopartlculas y el modo de cavidad optica. Cuando la nanopartlcula esta sobre el sustrato, ademas de la dispersion hacia atras, multiples rutas ayudan a potenciar la dispersion por una unica nanopartlcula. Una ruta implica la amplificacion de la dispersion directa por la nanopartlcula por multiples reflexiones. En este mecanismo, el acoplamiento entre la resonancia de plasmones dipolares de la nanopartlcula y las resonancias de las cavidades del sustrato optico crea un modo hlbrido que refuerza la senal de dispersion en el sitio de nanopartlculas. En una segunda ruta, la luz no dispersa experimenta multiples reflexiones en la cavidad optica del sustrato, produciendo una cascada de interacciones de dispersion en los sitios de nanopartlculas vecinos que conducen a una densidad aparente mayor de nanopartlculas en, por ejemplo, una imagen de campo oscuro.

La relevancia del espesor en la senal de dispersion se demuestra claramente por una realizacion particular de la invencion en la que el sustrato esta en forma de una palanca con un diseno de espesor entre 0,1 pm y 5 pm. Puede observarse una clara diferencia en la intensidad de la senal de dispersion entre la region de chip en la que el espesor es superior a 5 pm y la region de palanca en la que el espesor esta entre 0,1 pm y 5 pm (vease la Figura 6a).

El segundo punto clave a tener en cuenta en el diseno del sistema es que la relacion entre el Indice de refraccion del material dielectrico (sustrato) y el material circundante debe ser superior a 1,1. Este aspecto tambien es esencial en el logro del efecto multirreflector en la cavidad del sustrato. La presencia de materiales circundantes al sustrato que tienen un Indice de refraccion diferente en la relacion particular superior a 1,1, hace que las superficies opuestas del sustrato sean como espejos, que permite la multirreflexion dentro de la cavidad. El material circundante puede estar tanto en la propia disolucion en la que el sustrato se sumerge para la deteccion como cualquier fluido o gases de alrededor, o un material solido particular circundante con la unica condicion de que el Indice de refraccion del material circundante se diferencie del Indice de refraccion del sustrato.

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El sistema de la invencion puede en principio usarse en cualquier tipo de conform acion de biosensor o de resonadores mecanicos. En particular, en el sistema de la invencion, el sustrato puede tener la forma de una micropalanca, un micropilar, una cuerda, un trampolln, una palanca rectangular, una palanca triangular, una palanca piramidal, una palanca de pala, una membrana, una placa, un puente, un tubo hueco o un nanoalambre (vease, por ejemplo, la Figura 11).

El analito diana es el elemento que va a detectarse de la muestra, especialmente de muestras biologicas. El analito diana puede ser de cualquier naturaleza tal como moleculas organicas o inorganicas (farmacos, hormonas, colesterol, etc.), moleculas biologicas (peptidos o protelnas, moleculas de acidos nucleicos, factores de crecimiento, biomarcadores etc.), celulas (celulas protozoicas, celulas bacterianas, celula fungica, celulas eucariotas) o fragmentos de celulas (paredes bacterianas, organulos celulares como mitocondrias, veslculas celulares, etc.) o virus.

Una ventaja del sistema de la invencion es que permite detectar y cuantificar analitos dentro de muestras complejas, tales como, por ejemplo, sangre o muestras de orina, sin la necesidad de ninguna etapa de purificacion o etapa de separacion. Esto hace la manipulacion mas simple y reduce el tiempo para la deteccion, lo que hace que el presente sistema sea muy adecuado para su implementacion en dispositivos de POC.

El elemento de reconocimiento que funcionaliza la superficie del sustrato puede ser cualquier elemento que pueda reconocer y unirse especlficamente a un analito diana. En este sentido, el elemento de reconocimiento puede ser un anticuerpo (un anticuerpo policlonal o monoclonal), un receptor (un receptor de la superficie celular tal como un receptor de opioides), un peptido (tal como un peptido de opiodes), una protelna (tal como lectinas), un hidrato de carbono (tal como el antlgeno O de lipopolisacarido), un acido nucleico (una secuencia de ADN o ARN), una celula (celulas protozoicas, celulas bacterianas, celula fungica, celulas eucariotas), un microorganism o o una parte del mismo (tal como paredes bacterianas, organulos celulares como mitocondrias, veslculas celulares etc.). En una realizacion preferida de la invencion, el elemento de reconocimiento es un anticuerpo, mas preferentemente un anticuerpo monoclonal.

La otra caracterlstica esencial del sistema, aparte del sustrato funcionalizado, es la nanopartlcula. Por supuesto, la nanopartlcula debe tener propiedades plasmonicas. En principio puede usarse cualquier tipo de nanopartlcula con propiedades plasmonicas. Asl, la nanopartlcula puede ser, por ejemplo, una nanopartlcula de oro, plata o de metamaterial plasmonico tal como, pero no se limita a, nitruro de titanio y oxidos no estequiometricos tales como vanadio, titanio y aluminio.

Ademas, la nanopartlcula puede adoptar multitud de formas o estructuras tales como, por ejemplo, nanoesferas, nanovarillas, nanovarillas afiladas, nanovainas, nanojaulas/marcos, nanoesferas huecas, tetraedros, octaedros, cubos, icosaedros, dodecaedros rombicos, nanocubos concavos, tetrahexaedros, bipiramides triangulares obtusas, trisohectaedros y nanoprismas (vease la Figura 12), pero es esencial que al menos una de sus dimensiones tenga un tamano de 2 nm a 300 nm, preferentemente 5 nm a 150 nm, debido a que el pico de resonancia plasmonica es altamente dependiente del tamano de la nanopartlcula.

La nanopartlcula comprende al menos un elemento de deteccion unido a ella que puede unirse especlficamente al analito diana. El elemento de deteccion puede ser cualquier tipo de elemento que pueda unirse al analito diana, asl, en principio su naturaleza puede ser la misma o similar a la del elemento de reconocimiento. Sin embargo, en una realizacion preferida, el elemento de deteccion tanto se selecciona de un anticuerpo como de una molecula de acido nucleico. El elemento de deteccion tiene la funcion de detectar la presencia del analito diana capturado por el elemento de reconocimiento inmovilizado sobre la superficie del sustrato. Asl, la nanopartlcula solo se unira al sustrato mediante el elemento de deteccion unido a ella si el

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analito diana esta presente en la muestra analizada. En tal caso, el elemento de reconocimiento puede unirse al analito diana que despues se detecta por el elemento de deteccion en una disposicion tipo sandwich. La ausencia del analito diana en la muestra tiene la consecuencia de que el elemento de reconocimiento no se unira al analito diana y asl no se producira deteccion por el elemento de deteccion.

En resumen, si el analito diana esta presente en la muestra, incluso a concentraciones ultrabajas, puede detectarse y cuantificarse basandose en la intensidad de dispersion o intensidad de extincion (dependiendo de los parametros medidos) producidos por las nanopartlculas. Si el analito diana no esta presente en la muestra, no tendra lugar efecto plasmonico detectable sobre el sustrato ya que no estaran presentes nanopartlculas.

La deteccion y cuantificacion pueden hacerse midiendo la intensidad de dispersion producida por las nanopartlculas cuando el sistema se irradia con una radiacion electromagnetica. Un efecto plasmonico detectable tendra lugar por irradiacion a cualquier longitud de onda del espectro de la luz blanca gracias a la amplificacion de la senal proporcionada por el sustrato que cumple los parametros de diseno.

Si el tipo de senal medida es la senal de dispersion, la medicion se hace en reflectancia y, en tal caso, el Indice de reflectancia del sustrato comprende entre 0,01 y 1.

Alternativamente, la deteccion y cuantificacion pueden llevarse a cabo midiendo la senal de extincion de las nanopartlculas irradiadas con la radiacion electromagnetica. Si la senal de extincion se mide, la medicion se hace en transmitancia y, en tal caso, el Indice de transmitancia del sustrato comprende entre 0,01 y 1.

La visualizacion de las nanopartlculas en el sistema de la invencion puede realizarse por medios opticos tales como un microscopio de campo oscuro o un microscopio de polarizacion cruzada.

Un aspecto adicional de la invencion es un biosensor que comprende un sistema segun la invencion. El sistema de la invencion es en principio aplicable a cualquier tipo de biosensor sobre el que pueda disponerse el sistema.

En una realizacion particularmente preferida, el sistema esta dispuesto en un biosensor micro o nanomecanico de manera que senales optomecanoplasmonicas puedan detectarse y analizarse. Este tipo particular de biosensor dual permite una fiabilidad superior, ya que la respuesta del biosensor solo se considera positiva cuando tanto las senales plasmonicas como mecanicas dan un resultado positivo. Aunque el biosensor dual no mejora el llmite de deteccion del sistema optoplasmonico de la invencion solo, claramente mejora la especificidad del ensayo, mejorando asl su fiabilidad.

Por ejemplo, en una realizacion particular, de un biosensor de senal dual basado en un sustrato en forma de una micropalanca, en la que se midieron tanto las senales plasmonicas como mecanicas, se observo que la tasa de error para las concentraciones menores era mas pequena en la transduccion optoplasmonica. Para concentraciones superiores a 1 fg/ml, la tasa de error de tanto transduccion mecanica como optoplasmonica se volvio comparable, pero positivamente, la combinacion de senales mecanicas y optoplasmonicas (senal optomecanoplasmonica) potencio significativamente la confianza del ensayo que conduce a una tasa de positivos falsos y negativos falsos extremadamente baja, de aproximadamente 2 x 10-4 a una concentracion ultrabaja de 100 ag/ml del analito diana (Figura 10).

En una realizacion particular, el biosensor esta dispuesto en forma de una matriz que comprende multiples sistemas segun la invencion, comprendiendo cada sistema un sustrato disenado para detectar un analito diana diferente o diferentes concentraciones del mismo analito.

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Otro aspecto de la invencion es un procedimiento para detectar y/o cuantificar un analito diana seleccionado en una muestra que comprende:

a) poner en contacto una muestra con un sustrato de material dielectrico que tiene una superficie funcionalizada con un elemento de reconocimiento que puede unirse especlficamente al analito diana, teniendo el sustrato de material dielectrico un espesor entre 0,1 pm y 5 pm y un coeficiente de extincion inferior a 0,3 y siendo la relacion entre el Indice de refraccion del material dielectrico y el material circundante superior a 1,1

b) anadir al sustrato resultante de a) al menos una nanopartlcula con propiedades plasmonicas y que tiene al menos una de sus dimensiones con un tamano de 2 nm a 300 nm, que comprende al menos un elemento de deteccion unido a ella y que puede unirse especlficamente al analito diana, con el fin de detectar la presencia del analito diana unido al elemento de reconocimiento

c) irradiar el sustrato resultante de b) con una radiacion electromagnetica en la que la presencia del analito diana en la muestra produce un efecto plasmonico en las nanopartlculas amplificadas por la presencia del sustrato que puede detectarse por medios opticos,

d) medir la dispersion de la luz o intensidad de la senal de extincion de manera que detecte la presencia o ausencia del analito diana en la muestra y para la cuantificacion de la misma.

El procedimiento de la invencion se basa en el uso del sistema de deteccion tipo sandwich de la invencion como se ha explicado anteriormente.

La etapa a) es la etapa de reconocimiento, en la que la muestra se pone en contacto con la superficie funcionalizada del sustrato. La superficie del sustrato se disena para detectar un tipo particular de analito diana. Asl, despues de un tiempo de incubacion adecuado de manera que pueda tener lugar la reaccion si el analito diana esta presente en la muestra, se unira al elemento de reconocimiento y asl se inmovilizara sobre la superficie.

Como se ha explicado anteriormente, el material dielectrico usado en el procedimiento puede ser cualquier material dielectrico en tanto que tenga un coeficiente de extincion inferior a 0,3. En una realizacion particular, el material dielectrico es cuarzo, silicio, nitruro de silicio, carburo de silicio, grafeno, pollmeros tales como fotorresistentes como SU8 e hidrogeles tales como mezclas de PEG y PLA o de DEXTRANO y PEG. Los materiales dielectricos mas preferidos son silicio o nitruro de silicio.

Tambien como se ha explicado anteriormente, el elemento de reconocimiento usado en el procedimiento de la invencion puede ser cualquier elemento que pueda reconocer y unirse especlficamente a un analito diana deseado. En este sentido, en una realizacion particular, el elemento de reconocimiento puede ser un anticuerpo (un anticuerpo policlonal o monoclonal), un receptor (un receptor de la superficie celular tal como un receptor de opioides), un peptido (tal como un peptido de opiodes), una protelna (tal como lectinas), un hidrato de carbono (tal como el antlgeno O de lipopolisacarido), un acido nucleico (una secuencia de ADN o ARN), una celula (celulas protozoicas, celulas bacterianas, celula fungica, celulas eucariotas), un microorganism o o una parte del mismo (tal como paredes bacterianas, organulos celulares como mitocondrias, veslculas celulares, etc.). En una realizacion preferida de la invencion, el elemento de reconocimiento es un anticuerpo, mas preferentemente un anticuerpo monoclonal.

La etapa b) del procedimiento de la invencion comprende la etapa de deteccion. La nanopartlcula que actua de marca para la deteccion y cuantificacion esta unida a un elemento de deteccion que puede unirse especlficamente al analito diana en una posicion o area

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diferente del elemento de reconocimiento. Si el analito diana esta presente en la muestra, la estructura resultante de la etapa a) se detectara por el elemento de deteccion despues de un tiempo de incubacion adecuado. Una vez ha tenido lugar la reaccion de deteccion, las nanopartlculas se inmovilizan sobre la superficie del sustrato y estan en condicion de ser detectadas y/o cuantificadas basandose en sus propiedades plasmonicas.

El elemento de deteccion unido a la nanopartlcula usada en el contexto del procedimiento puede ser cualquier tipo de elemento que pueda unirse al analito diana, asl, en principio su naturaleza puede ser la misma o similar a la del elemento de reconocimiento. Sin embargo, en una realizacion preferida, el elemento de deteccion tanto se selecciona de un anticuerpo como de una molecula de acido nucleico.

Tambien como se explica antes, el tipo de nanopartlcula usada en el procedimiento de la invencion puede ser cualquier nanopartlcula que presente propiedades plasmonicas. En este sentido, la nanopartlcula puede ser una nanopartlcula de oro, plata o de metamaterial plasmonico. Con respecto a la forma, la nanopartlcula puede adoptar cualquier estructura tal como nanoesferas, nanovarillas, nanovarillas afiladas, nanovainas, nanojaulas/marcos, nanoesferas huecas, tetraedros, octaedros, cubos, icosaedros, dodecaedros rombicos, nanocubos concavos, tetrahexaedros, bipiramides triangulares obtusas, trisohectaedros y nanoprismas en tanto que una de sus dimensiones tenga un tamano de 2 nm a 300 nm.

La etapa c) comprende la irradiacion de la superficie del sustrato con una radiacion electromagnetica de manera que revele la presencia o no de la nanopartlcula en el sustrato. La radiacion electromagnetica incidente en el sustrato resultante de la etapa b) revelara si la muestra contiene o no el analito diana. Si el analito diana esta presente en la muestra, la radiacion electromagnetica incidente producira un efecto plasmonico en la nanopartlcula que se potenciara enormemente por los fenomenos particulares que tienen lugar dentro de la cavidad del sustrato debido a su diseno particular. Como se ha explicado anteriormente, el efecto plasmonico potenciado producido cuando las nanopartlculas estan presentes en el sustrato es un modo hlbrido que resulta del acoplamiento del modo de plasmones superficiales localizados sobre las nanopartlculas y el modo de cavidad optica.

La ultima etapa del procedimiento de la invencion, etapa d), comprende medir la dispersion de la luz o intensidad de la senal de extincion de manera que se detecte la presencia o ausencia del analito diana en la muestra y para la cuantificacion de la misma. Las mediciones pueden hacerse por dispositivos o medios opticos adaptados para tal tarea tal como microscopio de campo oscuro o un microscopio de polarizacion cruzada.

La cuantificacion puede hacerse basandose en la intensidad de la senal de la dispersion de la luz o la intensidad de la senal de la extincion de la luz. La intensidad de la senal medida puede relacionarse con una concentracion de analito desconocida por comparacion con una curva de calibracion obtenida de muestras con concentraciones previamente conocidas de un analito.

El procedimiento de la invencion puede disenarse para medir el efecto plasmonico potenciado sobre las nanopartlculas en reflectancia o transmitancia.

Si la medicion se hace en reflectancia, entonces la intensidad de la senal de dispersion se mide y asl el sustrato de material dielectrico debe tener Indice de reflectancia comprendido entre 0,01 y 1.

Alternativamente, si la medicion se hace en transmitancia, entonces la intensidad de la senal de extincion se mide y asl el sustrato de material dielectrico debe tener Indice de transmitancia comprendido entre 0,01 y 1.

El procedimiento de la presente invencion permite llmites de deteccion ultrabajos ya que discrimina concentraciones al borde de 10 ag/ml y tiene la ventaja de que permite la deteccion

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de analitos diana en muestras complejas biologicas tales como muestras de sangre o de orina sin la necesidad de ninguna preparacion o purificacion previa de la muestra.

En una realizacion particularmente preferida, el procedimiento de la invencion se realiza en un sistema micromecanico por el cual el sustrato de material dielectrico esta dispuesto como un elemento mecanico que puede sufrir un cam bio en al menos una caracterlstica mecanica cuando el analito diana esta presente en la muestra, y cuando se realizan las siguientes etapas adicionales:

e) medir la al menos una caracterlstica mecanica en el elemento mecanico de manera que detecte la presencia o ausencia del analito diana en la muestra,

f) combinar los datos opticos obtenidos en la etapa d) con datos mecanicos de la etapa e) con el fin de mejorar la fiabilidad del procedimiento de deteccion.

Los inventores han encontrado que en esta realizacion particularmente preferida, el procedimiento de la invencion, aunque no mejora el llmite de deteccion espectacularmente, mejora la fiabilidad del procedimiento cuando se compara con el procedimiento solo basado en el efecto optoplasmonico. El procedimiento de la invencion en esta realizacion particularmente preferida conduce a una tasa muy baja de positivos falsos y negativos falsos. La superior fiabilidad se explica debido a que el resultado del procedimiento solo se considera cuando tanto las senales plasmonicas como las mecanicas dan un resultado positivo.

En esta realizacion particular, el sustrato de material dielectrico que es esencial en la presente invencion debido a sus propiedades opticas esta dispuesto para tambien actuar de elemento mecanico que puede sufrir un cambio en al menos una caracterlstica mecanica cuando el analito diana esta presente en la muestra. Este cambio en una caracterlstica mecanica puede medirse de manera que se obtenga una senal mecanica, ademas de la senal optoplasmonica. La presencia de la nanopartlcula cuando el analito diana esta presente en la muestra tambien produce una senal mecanica amplificada debido a la mayor masa proporcionada por la nanopartlcula.

El elemento mecanico puede estar en forma de una micropalanca, un micropilar, un resonador de cuerda, un resonador de trampolln, una palanca rectangular, una palanca triangular, una palanca piramidal, una palanca de pala, un resonador de membrana, un resonador de placa, un puente, una palanca hueca o un nanoalambre. En una realizacion particularmente preferida, el sustrato esta dispuesto para actuar de elemento mecanico en forma de una micropalanca.

Ademas, un cambio de cualquier caracterlstica mecanica del elemento mecanico puede medirse con el fin de detectar la presencia del analito diana en la muestra. El cambio de la caracterlstica mecanica detectado puede seleccionarse, aunque no limitarse a, la posicion de una porcion del elemento mecanico, la caracterlstica de vibracion del elemento mecanico, tal como la fase de la vibracion del elemento mecanico, la frecuencia de la vibracion del elemento mecanico, la amplitud de la vibracion del elemento mecanico o la tension superficial sobre una porcion del elemento mecanico o los cambios de disipacion del elemento mecanico.

La combinacion de los datos opticos obtenidos en la etapa d) con los datos mecanicos de la etapa e) del presente procedimiento proporciona una fiabilidad mejorada del procedimiento.

Finalmente, otro objetivo de la invencion es un dispositivo que puede detectar el efecto optoplasmonico potenciado de las nanoparticulas por medio del sistema de la invencion o bien combinar la deteccion de tal efecto optoplasmonico con el analisis de los cambios en las caracteristicas mecanicas en el sustrato.

Mas precisamente, el dispositivo para la inspeccion superficial dispuesto para detectar el efecto

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optoplasmonico en al menos una nanopartfcula de un sistema segun las etapas c) y d) del procedimiento de la invencion comprende:

- una fuente de radiacion electromagnetica dispuesta para generar al menos un haz de radiacion electromagnetica;

- un primer detector sensible tal como un microscopio de campo oscuro o un microscopio de polarizacion cruzada dispuesto para recibir la radiacion electromagnetica cuando se refleja o transmite a traves del sustrato para producir al menos una prim era serial de salida en respuesta a la dispersion y/o la extincion de dicha radiacion electromagnetica;

- un sistema de control electronico;

Adicionalmente, con el fin de realizar las etapas e) y f) del procedimiento de la invencion, en las que se miden cambios en las caracterfsticas mecanicas cuando el analito diana esta presente en la muestra, el dispositivo tambien comprende:

- un subsistema para detectar un cambio en una caractenstica mecanica en el sustrato, comprendiendo dicho subsistema un segundo detector sensible dispuesto para detectar un cambio mecanico en el sustrato para producir al menos una segunda serial en respuesta a dicho cambio mecanico, concretamente:

o una luz de iluminacion o rayo laser y un fotodetector sensible a la posicion lineal (PSD) para registrar el cambio en la caractenstica mecanica sobre el sustrato

o un sistema de control electronico;

o medios de barrido para el desplazamiento relativo de dicha luz o rayo laser con respecto al sustrato de manera que se barra el sustrato con el haz de luz siguiendo instrucciones del sistema de control electronico.

y

- medios para producir una serial de salida final basada en la combinacion de la primera y segunda senales de salida del primer y segundo detectores sensibles.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1: Representacion esquematica del ensayo de sandwich sobre el sustrato en forma de una palanca. (a) La palanca esta funcionalizada con anticuerpos de captura. La funcionalizacion comprende silanizacion, union de anticuerpo sobre la superficie superior de la palanca y bloqueo con polietilenglicol para minimizar interacciones no especificas sobre la superficie inferior de la palanca y huecos entre los anticuerpos. (b) La palanca se sumerge entonces en la muestra de suero para unir la protefna de biomarcador, si esta presente, por inmunorreaccion con los anticuerpos de captura (elemento de reconocimiento). (c) Finalmente, las inmunorreacciones se revelan exponiendo la palanca a un anticuerpo primario (elemento de deteccion) que esta unido a una nanopartfcula de oro de 100 nm de diametro que reconoce una region libre especffica del biomarcador capturado.

Figura 2: Deteccion plasmonica del biomarcador de protefna CEA sobre la microcavidad optica de la palanca. (a) Esquemas que ilustran las diferentes rutas para la generacion de la serial optica en la palanca mediante multiples reflexiones internas. (b) Espectros de dispersion del ensayo de sandwich en las regiones de chip y de palanca para el ensayo de deteccion de CEA. La dispersion se normaliza a la del chip de silicio. El acoplamiento entre los modos plasmonicos dipolares y los modos individuales de la microcavidad de la palanca conduce a un efecto doble, primero la dispersion asistida por plasmones se potencia por la cavidad de la palanca optica por casi un orden de magnitud, y segundo, el espectro de plasmones de nanopartfculas se discretiza por los modos de cavidad optica de la palanca.

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Figura 3: Esquemas del procedimiento de deflexion del rayo optico para medir la vibracion de la palanca. Un rayo laser se enfoca sobre la region del extremo libre de la palanca. La deflexion del haz reflectado debido a la vibracion de la palanca se mide por un fotodetector sensible a la posicion lineal (PSD). Un generador de frecuencia barre la frecuencia excitando un actuador piezoelectrico localizado debajo de la base de la matrz de la palanca. La amplitud de vibracion frente a la frecuencia se ajusta al modelo de oscilador armonico para derivar la frecuencia de resonancia y el factor de calidad de la palanca.

Figura 4: Imagenes del microscopio electronico de barrido (SEM) de una region de la palanca que cumple el diseno que conduce al efecto plasmonico potenciado (superficie de la micropalanca) y chip que tiene dimensiones que no conducen al efecto plasmonico potenciado, tanto despues del ensayo de sandwich en un experimento de control como en un ensayo de deteccion de 1 pg/ml de CEA en suero. La superficie de la palanca y la superficie del chip muestran la misma cantidad promedio de nanopartlculas.

Figura 5: Densidad de nanopartlculas sobre las micropalancas y chip en tampon medido con un microscopio electronico de barrido y usando un algoritmo basado en contraste de senales implementado en el software Matlab.

Figura 6: Deteccion plasmonica del biomarcador de protelnas CEA. (a) Imagenes opticas de campo oscuro de la palanca despues de la etapa de reconocimiento con los anticuerpos unidos a las nanopartlculas para un experimento de control riguroso y para el ensayo de deteccion de CEA con una muestra de 1 pg/ml en solucion salina tamponada con fosfato. La senal de dispersion es insignificante en el experimento de control, mientras que es significativamente mayor en la region de micropalanca en el ensayo de deteccion. La micropalanca actua de cavidad optica mientras que la dispersion en la region de prepinzamiento del chip es baja, y no puede usarse para discriminar la presencia de CEA en la muestra. (b) Senal de dispersion media en la micropalanca y el chip frente a la concentracion de CEA en tampon y suero. La senal se obtiene de una rapida inspeccion de las palancas con un simple microscopio optico comercial y objetivo de campo oscuro con bajo aumento. Los datos de la palanca se comparan con los datos del chip para evaluar el efecto de la cavidad de la palanca optica. La dispersion para los experimentos de control en las regiones de palanca y de chip se representan como regiones discontinuas que representan la desviacion estandar de los datos.

Figura 7: (a) Espectros de dispersion del efecto de las nanopartlculas que se unen sobre el chip que tiene dimensiones que no conducen al efecto plasmonico potenciado, y regiones de palanca que cumplen el diseno que conduce al efecto plasmonico potenciado. La dispersion se normaliza a la de un chip de silicio en bruto. El recuadro ilustra las diferentes rutas para la generacion de la senal dispersada en la palanca mediante multiples reflexiones internas (tambien representadas en la Figura 2.) (b) Esquemas del efecto de la carga de masa de nanopartlculas sobre la frecuencia de resonancia de la palanca. La reduccion resultante de la frecuencia de resonancia es proporcional al aumento de masa.

Figura 8: Resonancia de plasmones de nanopartlculas y cavidad de la palanca optica. (a) Las nanopartlculas de oro usadas en el ensayo de sandwich caracterizan resonancias de plasmones asociadas a oscilaciones de electrones colectivas en la nanopartlcula. Estas resonancias dan lugar a dispersion y absorcion potenciadas proximas a la frecuencia de resonancia optica. (b) Imagen optica de campo oscuro de una unica nanopartlcula de 100 nm de diametro despues de realizar un ensayo de sandwich sobre un sustrato de silicio. La nanopartlcula de oro presenta el muy conocido patron de Airy debido a la difraccion de la luz.

(c) Espectros de dispersion recogidos de un area de 20 x 20 pm2 con una unica nanopartlcula.

(d) Imagen de microscopia electronica de barrido que muestra la frontera entre el chip, 6 pm de espesor, y la palanca, 1 pm de espesor. El espesor de la palanca hace que la luz pueda rebotar eficazmente multiples veces entre los lados de la palanca opuestos que dan lugar a un potenciamiento de la reflectividad optica a longitudes de onda en las que se producen

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interferencia constructiva y, en cambio, a supresion de la reflectividad para longitudes de onda en las se produce interferencia destructiva. (e) Imagenes de campo brillante de las regiones de palanca y chip que muestran la modulacion de la reflectividad de la palanca con la longitud de onda de iluminacion en la region del espectro visible. La modulacion de la reflectividad del chip es insignificante. (f) Reflectividad relativa en la palanca con respecto al chip.

Figura 9: Biomarcador de la protelna CEA de deteccion mecanica. (a) Frecuencia de resonancia mecanica de una palanca de silicio antes y despues de la etapa de reconocimiento con los anticuerpos unidos a nanopartlculas para un experimento de control y para un ensayo de deteccion de CEA (1 pg/ml en PBS). Las mediciones se llevaron a cabo en aire a temperatura ambiente. La frecuencia de resonancia fundamental y los factores de calidad de las palancas sin recubrir fueron 4,8 ± 0,5 kHz y 5,5 ± 0,5, respectivamente. (b) Desplazamiento relativo de la frecuencia de resonancia del modo de vibracion fundamental frente a la concentracion de biomarcador en tampon y muestras de suero (slmbolos rojos). Las llneas son una gula para los ojos. Los desplazamientos de la frecuencia medidos en disolucion de tampon se comparan con el desplazamiento de la frecuencia teorica predicho de la distribucion de nanopartlculas sobre la palanca obtenida por microscopia electronica de barrido. La buena concordancia confirma que el desplazamiento de la frecuencia se produce a partir de la carga de masa de nanopartlculas. El desplazamiento de la frecuencia para los experimentos de control se representa como una region discontinua que representa la desviacion estandar de los datos.

Figura 10: (a) Curvas de DET para una concentracion de 10 fg/m l usando las senales nanomecanicas y plasmonicas y una combination lineal optima de ellas. (b) Tasa de negativos falsos frente a la tasa de positivos falsos para cada mecanismo de transduction y para un procedimiento hlbrido que usa una combinacion lineal optima de las senales de desplazamiento de frecuencia de resonancia de dispersion y mecanicas. Los colores indican la concentracion diana.

Figura 11: Ejemplos de diferentes formas para el sustrato del sistema (a) micropalancas comerciales, (b) resonadores de micropilar, (c) resonador de cuerda, (d) resonadores de trampolln, (e) palancas rectangulares, triangulares y de pala, (f) resonadores de membrana, (g) resonadores de placa, (h) imagen de SEM de una palanca hueca y representation esquematica, (i) nanoalambre.

Figura 12: Nanopartlculas de oro de diverso tamano y forma utiles en el sistema de la invention. Nanoesferas pequenas (a) y grandes (b), (c) nanovarillas, (d) nanovarillas afiladas,

(e) nanovainas, (f) nanojaulas/marcos, (g) nanoesferas huecas, (h) tetraedros/octaedros/cubos/icosaedros, (i) dodecaedros rombicos, (j) octaedros, (k) nanocubos concavos, (l) tetrahexaedros, (m) dodecaedros rombicos, (n) bipiramides triangulares obtusas, (o) trisoctaedros y (p) nanoprismas.

DESCRIPCION DE UNA REALIZACION PREFERIDA DE LA INVENCION

Como experimento de prueba de concepto para soportar la invencion se realizo un inmunoensayo de sandwich para la deteccion de un biomarcador de cancer. La deteccion del antlgeno carcinoembrionario (CEA) se eligio como modelo. Primero, se aplico un procedimiento de biofuncionalizacion a palancas con eficiencia de reconocimiento optima y capacidad de incrustation ultrabaja33 (vease la Figura 1a). Las palancas de silicio tuvieron 500 pm de longitud, 100 pm de anchura y 1 pm de espesor. Esta biofuncionalizacion se produce para inmovilizar la capa de receptor que reconoce y atrapa el biomarcador de cancer. Despues de eso, la palanca biofuncionalizada se sumergio en la muestra de llquido durante un periodo de tiempo determinado y temperatura fija para permitir la union del biomarcador elegido como diana a los anticuerpos de captura inmovilizados sobre la superficie de la palanca (vease la Figura 1b). Despues del aclarado riguroso, la palanca se expuso a una disolucion que contenla el anticuerpo de deteccion unido a la nanopartlcula que reconocio y se unio a una region

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especlfica del biomarcador capturado de superficie (vease la Figura 1c); aquf tambien se determ ino el tiempo y temperatura ideales para el segundo reconocimiento. Basicamente, se llevo a cabo un ensayo de sandwich que implica dos etapas de reconocimiento para potenciar la selectividad y amplificar la respuesta del sensor. El anticuerpo de deteccion se unio a una nanopart(cula de oro de 100 nm de diametro que convirtio y amplifico el producto de biorreconocimiento en dos senales ffsicas detectables: (i) un aumento de masa y (ii) un aumento de dispersion de la luz debido a las propiedades plasmonicas de la nanopartlcula (veanse la Figura 7a y 7 b).

Para estos experimentos, el protocolo detallado para la inmovilizacion del anticuerpo de captura, deteccion del biomarcador y el ensayo de sandwich se aplico como se describe a continuacion.

Conjugacion de anticuerpo con nanoparticulas de oro esfericas de polimero de carboxilo

El anticuerpo primario, monoclonal de raton anti-antlgeno carcinoembrionario 3C1 (MAb3C1), se inmovilizo sobre la superficie de las nanoparticulas de oro esfericas de polimero de carboxilo de 100 nm de diametro siguiendo el procedimiento proporcionado por Nanopartz™. La muestra se almaceno en el frigorlfico a 4 °C hasta su uso.

Funcionalizacion de la palanca y activacion de los grupos carboxilo sobre la superficie

Antes de la funcionalizacion de la superficie, las matrices de palancas se limpiaron con disolucion pirana (3H2SO4:1 H2O2) (cuidado: la disolucion pirana es extremadamente corrosiva, reactiva y potencialmente explosiva) durante 15 minutos a temperatura ambiente (TA). Las palancas se aclararon tres veces con agua Milli-Q y se secaron bajo una corriente de nitrogeno. Las palancas se sumergieron en una disolucion al 0,2 % de (3-glicidiloxipropil)trimetoxisilano en tolueno seco durante la noche a temperatura ambiente. Despues de eso, las muestras se lavaron con tolueno, agua Milli-Q y se secaron bajo N2. Se preparo una disolucion de NTA 100 mM en tampon carbonato 50 mM a pH 9,5 y las palancas se incubaron durante la noche a 25 °C bajo agitacion suave. Entonces, las palancas se aclararon con tampon carbonato 50 mM a pH 9,5, agua Milli-Q y se secaron bajo N2. Los grupos carboxilo en la superficie de la palanca se activaron por inmersion en una disolucion mixta de EDC 100 mM y sulfo-NHS 150 mM, ambos disueltos en MES 10 mM a pH 5,5. Las palancas se incubaron durante 45 minutos a 37 °C bajo agitacion suave. Las muestras se aclararon ampliamente con MES 10 mM.

Inmovilizacion covalente y orientada de los anticuerpos de captura y control sobre la palanca

Justamente despues de la etapa de activacion superficial, la inmovilizacion del anticuerpo se realizo solo sobre el lado superior de las palancas. Se preparo una disolucion de 50 gg /ml del anticuerpo de captura, monoclonal de raton anti-antlgeno carcinoembrionario 3C6 (MAb3C6), en MES 10 mM a pH 5,5. Las palancas se incubaron durante 2 horas a 37 °C. Despues de eso, las muestras se lavaron con MES 10 mM a pH 5,5 y se incubaron durante 45 minutos a 37 °C con tampon fosfato de sodio 10 mM a pH 8,0 con NaCl 0,3 M para desorber anticuerpos que no estaban covalentemente unidos a la superficie. Para los experimentos de control, anticuerpo anti-peroxidasa producido en conejo (anti-HRP) se inmovilizo sobre el lado superior de la superficie de la palanca en lugar de MAb3C6. Para las muestras de control se usaron la misma concentracion de anticuerpo y procedimiento aplicados a la inmovilizacion covalente y orientada de MAb3C6. Antes de la inmovilizacion del anticuerpo de control sobre las palancas, 1 ml de una disolucion de 4 mg/ml de anti-HRP en agua Milli-Q se dializo durante la noche a 4 °C. La concentracion de la disolucion de anticuerpo despues de la dialisis se determino usando el ensayo de Bradford [M. M. Bradford, M. M. Analytical Biochemistry, 1976, 72, 248-254]. Se hizo una curva de calibracion usando albumina bovina de suero (BSA) como patron de protelna. El intervalo de linealidad del ensayo fue de 5 gg/ml a 2500 gg/ml.

Despues de la inmovilizacion de anticuerpos de captura (MAb3C6) y control (anti-HRP) en un

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modo covalente y orientado y desorcion de los anticuerpos que no se unen covalentemente a la superficie, la superficie de la palanca se bloqueo para prevenir adsorciones no espedficas. Las palancas se sumergieron en 1 mg/ml de (aminoetil)polietilenglicol (PEG), durante la noche a 4 °C. Despues de eso, las muestras se lavaron con MES a pH 5,5 con 0,05 % de Tween® 20 (pH 5,5).

Reconocimiento de biomarcadores y ensayo de sandwich

Las palancas se incubaron durante 1 hora a 37 °C en disoluciones de CEA con concentraciones que oscilan de 1 pg/ml a 1 ag/ml en disolucion de PBS con 0,05 % de Tween® 20 a pH 7,4 (PBST). Con el fin de tener experimentos de control rigurosos, la concentracion de CEA en disolucion usada para estas muestras fue de 1 pg/ml. Para simular una muestra real se prepararon disoluciones de CEA con concentracion que oscila de 100 fg/ml a 10 ag/ml en SBF y para los rigurosos experimentos de control en SBF la concentracion de CEA se mantuvo a 1 pg/ml. Justo despues, las palancas se lavaron dos veces con PBST y una vez con PBS a pH 7,4. Despues de eso, las muestras se aclararon con agua Milli-Q y se secaron bajo una corriente de N2.

Para el ensayo de sandwich, las palancas se sumergieron en 1 pg/ml de disolucion de nanopartfculas de oro esfericas funcionalizadas con el anticuerpo de deteccion (GNPs- MAb3C1) preparado en MES 10 mM con 0,05 % de Tween® 20 pH 5,5. Las muestras se incubaron a 37 °C durante 1 hora bajo agitacion suave, se lavaron tres veces con MES con Tween, dos veces con MES, se aclararon ampliamente con agua Milli-Q y se secaron bajo una corriente de N2.

La eficiencia del reconocimiento de biomarcador puede afectarse por la capa de biorreceptor inmovilizada sobre la palanca y tambien por las condiciones experimentales a las que la reaccion de reconocimiento tiene lugar tales como temperatura, pH y tiempo. Las estrategias para inmovilizar la capa de biorreceptor deben optimizarse para cada caso; pueden incluir la orientacion y densidad de los receptores sobre la superficie, y las estrategias de bloqueo para evitar interacciones no espedficas. Por ejemplo, si el biomarcador de deteccion es una protefca pequena, la estrategia para inmovilizar los anticuerpos sobre la superficie de la micropalanca, como su densidad y orientacion, y la molecula de bloqueo elegida no seran las mismas si ahora el biosensor se revela para la deteccion de una celula bacteriana, que es mayor. Incluso cuando se trabaja solo con anticuerpos las condiciones pueden cambiar; debenan determ inarse y optimizarse condiciones ideales como concentracion, pH, tiempo y temperatura que va a usarse. La inmovilizacion y condiciones experimentales para el reconocimiento de analitos tienen que personalizarse cada caso; pero el principio del procedimiento presentado aqm, basado en la deteccion dual, sigue siendo el mismo.

Las mediciones opticas se realizaron usando un microscopio optico comercial en modo reflectivo de campo oscuro (Axioskop 2 MAT equipado con AxioCam MRc 5 y objetivos de campo brillante/campo oscuro EC Epiplan Neofluor® de Zeiss 50x de Zeiss - Oberkochen, Alemania). Las superficies del chip y la palanca se observaron despues de la etapa de reconocimiento de CEA sobre la palanca y despues del ensayo de sandwich (union de las nanopartfculas funcionalizadas con el anticuerpo de deteccion).

La frecuencia de resonancia se obtuvo de la vibracion accionada de la palanca que se detecta opticamente por medio del simple procedimiento de palanca optica35 (vease la Figura 3). La frecuencia de resonancia del modo de vibracion fundamental de la palanca se mide en aire antes y despues de la exposicion de la palanca a las nanopartfculas de oro funcionalizadas con el anticuerpo primario.

Las muestras usadas en los experimentos para la prueba de concepto se analizaron por microscopia electronica de barrido (SEM) como se ilustra en la Figura 4. Al menos 100 imagenes sobre la palanca y el chip se tomaron para cada concentracion de CEA detectada y

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ambas superficies presentaron la misma densidad de nanopartlcuias (Figura 5). La informacion obtenida de las imagenes de SEM se usara para soportar los resultados encontrados de las mediciones opticas y mecanicas.

La Figura 6a muestra las imagenes de campo oscuro de la region de chip para un experimento de control y para un experimento de deteccion con 1 pg/ml de CEA en PBS. La senal de dispersion es despreciable en el experimento de control. En el caso del ensayo de deteccion de CEA, un aumento despreciable de la dispersion se observa en la region de chip, la region de chip tiene dimensiones fuera de las reglas del diseno para el sustrato en la invencion, no conduciendo asl al efecto plasmonico potenciado, mientras que las nanopartlculas unidas hacen que el area de la palanca brille, ya que la palanca cumple con el diseno que conduce al efecto plasmonico potenciado.

La senal de dispersion media obtenida de las imagenes de campo oscuro se representa en la Figura 6b en funcion de la concentracion de CEA en tampon o suero. El llmite de deteccion encontrado para los experimentos realizados en medio tampon es 0,1 fg/ml. La senal de dispersion en la palanca es aproximadamente 6 veces la senal en el chip, mostrando los aumentos de la senal optica por el sustrato disenado. El potenciamiento resonante de la senal de dispersion desempena una funcion de determinacion en la deteccion de CEA a concentraciones ultrabajas en suero. Asl, la senal de dispersion en el chip se basa en la region obtenida en los experimentos de control para concentraciones de CEA de 0,1 fg/ml a 100 fg/ml. Impresionantemente, el potenciamiento inducido por la cavidad de la palanca de la senal de dispersion permite la discrimination de concentraciones de tan solo 0,1 fg/ml.

El aspecto brillante de la palanca esta relacionado con su efecto como cavidad optica, como se bosqueja en la Figura 7a. Si la luz interacciona con una nanopartlcula sobre el chip de la palanca (un soporte que no cumple las reglas de diseno del objetivo de la invencion), la luz dispersa recogida se da solo por la dispersion hacia atras de la dispersion procedente de la superficie de separation entre el medio medioambiental y el sustrato en bruto. Si la nanopartlcula esta sobre la palanca, ademas de la dispersion hacia atras observada en el chip de soporte en bruto, multiples rutas ayudan a potenciar la dispersion por una unica nanopartlcula que potencia espectacularmente la senal de dispersion hacia atras medida. Una ruta implica la amplification de la luz dispersada por la nanopartlcula hacia la palanca por multiples reflexiones, produciendo procedimientos de dispersion multiple. Una segunda ruta encierra los procedimientos en los que la luz que golpea en las regiones de la palanca entre nanopartlculas experimentan multiples reflexiones en la cavidad de la palanca optica, produciendo una cascada de interacciones de dispersion en el sitio de nanopartlculas.

Con el fin de determinar el acoplamiento entre la cavidad optica y la respuesta de plasmones se analizo la respuesta espectral de la dispersion en la palanca y el chip de soporte. Los espectros mostraron el potenciamiento resonante de la dispersion asistida por plasmones de la cavidad de la palanca optica por casi un orden de magnitud. Los procedimientos de multiple reflexion en la cavidad de la palanca dan lugar a la modulation de la senal de dispersion con la longitud de onda, reminiscente de la modulacion de reflectividad mostrada en la Figura 8.

La Figura 9 muestra la respuesta de frecuencia mecanica de la palanca debido a la masa anadida dada por nanopartlculas recubiertas de anticuerpo que se unen. La resonancia mecanica se midio por un instrumento con un procedimiento de deflexion de rayo laser como se representa en la Figura 3 para la lectura. La Figura 9a muestra el pico de frecuencia de resonancia mecanica antes y despues de la etapa de reconocimiento de nanopartlculas en medios tampon para el experimento de control y durante 1 pg/ml de CEA. Los picos de resonancia mecanica antes y despues de la exposition de la palanca de control a la disolucion que contiene los biomarcadores de CEA presentan diferencias despreciables. En el ensayo de deteccion de CEA se observa un desplazamiento significativo del pico de resonancia mecanica a frecuencias menores. Los desplazamientos de la frecuencia de resonancia mecanica frente a

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la concentracion de CEA se representan en la Figura 9b para tampon purificado (izquierda) y disoluciones en suero (derecha). Los desplazamiento de resonancia mecanica en disolucion de tampon se muestran en la Figura 9b (izquierda) junto con el ruido base biologico determinado en los ensayos de control. Los datos experimentales muestran una coincidencia excelente con la prediccion teorica basandose en la masa de las nanopartlculas unidas a la palanca que los presentes inventores han evaluado por SEM. El llmite de deteccion en estas curvas de calibracion es 0,1 fg/ml. El llmite de deteccion aumenta un orden de magnitud cuando los ensayos se realizan en suero debido a la enorme cantidad de interacciones no especlficas de competicion entre las biomoleculas de plasma y la superficie de la palanca.

El hecho de que la tecnica optica alcance un mayor llmite de deteccion al obtenido con la medicion mecanica no indica que sea un mejor biosensor. Un analisis estadlstico de la fiabilidad de los sensores opticos y mecanicos puros indica que ambos biosensores tienen rendimientos similares, pero la combinacion de los dos mecanismos de transduccion condujo a un biosensor dual con rendimiento mejorado como puede observarse en la Figura 10.

Estudio estadlstico de la fiabilidad del sensor optomecanoplasmonico (senal hlbrida)

La sensibilidad y especificidad de una prueba de diagnostica son funcion de un valor umbral elegido. El cambiar el valor umbral de manera que aumente la sensibilidad disminuira la especificidad, y viceversa. La curva de la caracterfstica operativa del receptor (ROC) es una grafica de todos los pares de sensibilidad/especificidad resultantes de variar continuamente el umbral de decision con respecto al intervalo complejo de resultados observados. Este es un grafico de la tasa de positivos verdaderos (o sensibilidad) en el eje y y la tasa de negativos verdaderos (especificidad 1) en el eje x. La tasa de positivos verdaderos (TPR) es la probabilidad de que un caso de enfermedad se clasifique correctamente y la tasa de negativos verdaderos (TNR) es la probabilidad de que un caso normal verdadero se clasifique correctamente. La curva de ROC tambien puede usarse para comparar el rendimiento de dos o mas pruebas de diagnostico7,8. Una alternativa a la curva de ROC es la grafica de la compensacion del error de deteccion (DET), que representa la tasa de negativos falsos (detecciones perdidas) frente a la tasa de positivos falsos (alarmas falsas) en eje x e y logarltmicos. Esta alternativa gasta mas area de grafica en la region de interes, es decir, la region con tasa de falsos minima. La grafica de DET se realiza suponiendo una distribucion normal determinada por el valor medio y desviacion estandar experimentalmente obtenidos. La Figura 10a muestra las curvas de DET para una concentracion de 10 fg/ml por los procedimientos de transduccion plasmonica y nanomecanica. La llnea de rayas-puntos se corresponde con un parametro aleatorio. Ambos procedimientos de transduccion proporcionan curvas de DET muy por debajo de esta curva de no discriminacion. El valor optimo de la senal umbral es aquel que da un mlnimo en la distancia entre la curva de DET y el origen. Ahora se considera el caso en el que la senal de los presentes inventores sea una combinacion de la intensidad de dispersion y el desplazamiento de la frecuencia de resonancia mecanica7. La combinacion lineal se optimiza minimizando la distancia minima entre la curva de DET y el origen. De esta forma, gracias a la senal dual, la tasa de falsos de la deteccion de los presentes inventores siempre se potencia como se muestra en la Figura 10a. La potenciacion en la fiabilidad es modesta para las menores concentraciones como puede apreciarse en la Figura 10b, en la que la transduccion plasmonica es claramente superior a la transduccion nanomecanica. Sin embargo, a medida que aumenta la concentracion, la fiabilidad de ambos procedimientos de transduccion se vuelve comparable, y la optimizacion por combinacion lineal de ambas senales es claramente ventajosa (veanse los slmbolos de esferas en la Figura 10b).

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   REIVINDICACIONES

   1. Un sistema para aplicaciones de biodeteccion que comprende:

   a. un sustrato de material dielectrico que tiene al menos una superficie funcionalizada con un elemento de reconocimiento que puede unirse especlficamente a un analito diana y

   b. al menos una nanopartlcula con propiedades plasmonicas que comprende al menos un elemento de deteccion unido a ella y que puede unirse especlficamente al analito diana en una disposicion tipo sandwich,

   caracterizado porque:

   - el sustrato de material dielectrico tiene un espesor entre 0,1 pm y 5 pm y un coeficiente de extincion inferior a 0,3,

   - la nanopartlcula tiene al menos una de sus dimensiones con un tamano de 2 nm a 300 nm y

   - porque la relacion entre el Indice de refraccion del material dielectrico y el material circundante es superior a 1,1.
2. 2. Un sistema segun la reivindicacion 1, en el que el material dielectrico esta seleccionado de cuarzo, silicio, nitruro de silicio, carburo de silicio, grafeno, pollmeros e hidrogeles.
3. 3. Un sistema segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el sustrato tiene la forma de una micropalanca, un micropilar, un resonador de cuerda, un resonador de trampolln, una palanca rectangular, una palanca triangular, una palanca piramidal, una palanca de pala, un resonador de membrana, un resonador de placa, un puente, una palanca hueca o un nanoalambre.
4. 4. Un sistema segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el sustrato esta funcionalizado con un elemento de reconocimiento seleccionado de un anticuerpo, un receptor, un peptido, una protelna un hidrato de carbono, un acido nucleico, una celula, un microorganismo o una parte del mismo.
5. 5. Un sistema segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el elemento de deteccion esta seleccionado de un anticuerpo o una molecula de acido nucleico.
6. 6. Un sistema segun la reivindicacion 1 a 5, en el que la nanopartlcula es una nanopartlcula de oro, plata o de metamaterial plasmonico.
7. 7. Un sistema segun la reivindicacion 1 a 5, en el que la nanopartlcula tiene una estructura seleccionada del grupo de nanoesferas, nanovarillas, nanovarillas afiladas, nanovainas, nanojaulas/marcos, nanoesferas huecas, tetraedros, octaedros, cubos, icosaedros, dodecaedros rombicos, nanocubos concavos, tetrahexaedros, bipiramides triangulares obtusas, trisohectaedros y nanoprismas.
8. 8. Un sistema segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el sustrato tiene un Indice de transmitancia comprendido entre 0,01 y 1 y/o un Indice de reflectancia comprendido entre 0,01 y 1.
9. 9. Un biosensor que comprende un sistema segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. 10. Un biosensor dispuesto en forma de una matriz que comprende multiples sistemas segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo cada sistema un sustrato disenado para detectar un analito diana diferente o concentraciones diferentes del mismo analito.

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11. 11. Un procedimiento para detectar y/o cuantificar un analito diana seleccionado en una muestra que comprende:

    a) poner en contacto una muestra con un sustrato de material dielectrico que tiene una superficie funcionalizada con un elemento de reconocimiento que puede unirse especlficamente al analito diana, teniendo el sustrato de material dielectrico un espesor entre 0,1 pm y 5 pm y un coeficiente de extincion inferior a 0,3 y siendo la relacion entre el Indice de refraccion del material dielectrico y el material circundante superior a 1,1

    b) anadir al sustrato resultante de a) al menos una nanopartlcula con propiedades plasmonicas y que tiene al menos una de sus dimensiones con un tamano de 2 nm a 300 nm, que comprende al menos un elemento de deteccion unido a ella y que puede unirse especlficamente al analito diana, con el fin de detectar la presencia del analito diana unido al elemento de reconocimiento

    c) irradiar el sustrato resultante de b) con una radiacion electromagnetica en la que la presencia del analito diana en la muestra produce un efecto plasmonico en las nanopartlculas amplificadas por la presencia del sustrato que puede detectarse por medios opticos,

    d) medir la dispersion de la luz o intensidad de la senal de extincion de manera que detecte la presencia o ausencia del analito diana en la muestra y para la cuantificacion de la misma.
12. 12. Un procedimiento segun la reivindicacion 11, en el que el material dielectrico esta seleccionado de cuarzo, silicio, nitruro de silicio, carburo de silicio, pollmeros, hidrogeles o grafeno.
13. 13. Un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en el que el elemento de reconocimiento esta seleccionado de un anticuerpo, un receptor, un peptido, un hidrato de carbono, un acido nucleico, una celula y un microorganismo o una parte del mismo.
14. 14. Un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que el elemento de deteccion esta seleccionado de un anticuerpo o una molecula de acido nucleico.
15. 15. Un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que la nanopartlcula es una nanopartlcula de oro, plata o un metamaterial plasmonico.
16. 16. Un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que la nanopartlcula tiene una estructura seleccionada del grupo de nanoesferas, nanovarillas, nanovarillas afiladas, nanovainas, nanojaulas/marcos, nanoesferas huecas, tetraedros, octaedros, cubos, icosaedros, dodecaedros rombicos, nanocubos concavos, tetrahexaedros, bipiramides triangulares obtusas, trisohectaedros y nanoprismas.
17. 17. Un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en el que el medio optico comprende microscopio de campo oscuro o un microscopio de polarizacion cruzada.
18. 18. Un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, en el que:

    • el sustrato de material dielectrico tiene un Indice de reflectancia comprendido entre 0,01 y 1 cuando la senal de intensidad de dispersion se mide o

    • el sustrato de material dielectrico tiene un Indice de transmitancia comprendido entre 0,01 y 1 cuando la senal de intensidad de extincion se mide.
19. 19. Un procedimiento segun cualquiera de la reivindicacion 11 a 18, en el que el procedimiento se realiza en un sistema microelectromecanico por el cual el sustrato de material dielectrico esta dispuesto como elemento mecanico que puede sufrir un cambio en al menos una

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    caracteristica mecanica cuando el analito diana esta presente en la muestra, y, en el que se realizan las siguientes etapas adicionales:

    e) medir al menos una caracteristica mecanica en el elemento mecanico de manera que detecte la presencia o ausencia del analito diana en la muestra,

    f) combinar los datos opticos obtenidos en la etapa d) con datos mecanicos de la etapa e) con el fin de mejorar la fiabilidad del procedimiento de deteccion.
20. 20. Un procedimiento segun la reivindicacion 19, en el que el elemento mecanico puede estar en forma de una micropalanca, un micropilar, un resonador de cuerda, un resonador de trampolfn, una palanca rectangular, una palanca triangular, una palanca piramidal, una palanca de pala, un resonador de membrana, un resonador de placa, un puente, una palanca hueca o un nanoalambre.
21. 21. Un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 19-20, en el que la al menos una caracteristica mecanica puede seleccionarse de: la posicion de una porcion del elemento mecanico, la caracteristica de vibracion del elemento mecanico, tal como la fase de la vibracion del elemento mecanico, la frecuencia de la vibracion del elemento mecanico, la amplitud de la vibracion del elemento mecanico o la tension superficial sobre una porcion del elemento mecanico o los cambios de disipacion del elemento mecanico.
22. 22. Dispositivo para la inspeccion superficial dispuesto para detectar un efecto optoplasmonico en al menos una nanopartlcula de un sistema segun la reivindicacion 1, comprendiendo dicho dispositivo:

    - una fuente de radiacion electromagnetica dispuesta para generar al menos un haz de radiacion electromagnetica;

    - un primer detector sensible dispuesto para recibir la radiacion electromagnetica cuando se refleja o transmite a traves del sustrato para producir al menos una primera senal de salida en respuesta a la dispersion y/o la extincion de dicha radiacion electromagnetica;

    - un sistema de control electronico;
23. 23. Un dispositivo segun la reivindicacion 22, en el que el dispositivo comprende ademas:

    - un subsistema para detectar un cambio en una caracteristica mecanica en el sustrato, comprendiendo dicho subsistema un segundo detector sensible dispuesto para detectar un cambio mecanico en el sustrato para producir al menos una segunda senal en respuesta a dicho cambio mecanico; y

    - medios para producir una senal de salida final basada en la combinacion de primera y segunda senales de salida del primer y segundo detectores sensibles.
24. 24. Un dispositivo segun la reivindicacion 23, en el que dicho subsistema de deteccion comprende:

    - una luz de iluminacion o rayo laser y un fotodetector sensible de posicion lineal para registrar el cambio en la caracteristica mecanica sobre el sustrato

    - un sistema de control electronico;

    - medios de barrido para el desplazamiento relativo de dicha luz o rayo laser con respecto al sustrato de manera que barran el sustrato con el rayo de luz siguiendo instrucciones del sistema de control electronico.