CN102150033A

CN102150033A - 改进的线栅衬底结构和用于制造这种衬底的方法

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Publication number: CN102150033A
Application number: CN2009801352151A
Authority: CN
Inventors: N·N·卡亚; D·J·W·克伦德
Original assignee: Koninklijke Philips Electronics NV
Current assignee: Koninklijke Philips NV
Priority date: 2008-09-09
Filing date: 2009-09-08
Publication date: 2011-08-10
Also published as: WO2010029498A1; JP2012502273A; US20110195516A1; RU2011113723A; EP2335051A1

Abstract

本发明涉及一种多层衬底结构，其包括：至少一个载体层（11）；第一层（12），所述载体层和第一层彼此接触；和至少一个第二层（13），其具有不同于第一层的化学成分，所述第一层和第二层彼此接触，第二层形成若干开孔，每个开孔具有至少一个小于衍射极限的面内尺度（W1），该衍射极限由激发光的辐射波长限定。本发明进一步涉及这种衬底结构的用途和制造过程以及一种发光传感器。

Description

改进的线栅衬底结构和用于制造这种衬底的方法

技术领域

本发明涉及用在传感器中的多层衬底结构。而且，本发明涉及使用和制造该多层衬底结构的方法以及包括该多层衬底结构的发光传感器。

背景技术

生物传感器是这样的设备，其能够检测诸如血液、血清、血浆和唾液之类的样本中比如但不限于蛋白质、病毒、细菌、细胞成分、细胞膜、孢子、DNA、RNA等目标分子的存在或者定量地测量所述目标分子。这些目标分子也称为分析物。生物传感器可以使用包括用于捕获分析物的特定识别元件的表面。这种表面可以通过将特定分子附着到它而被改性，所述特定分子适合用于结合样本流体中存在的目标物质。这些分子称为分子配体。这样的分子配体的实例是核苷酸探针、抗体等。将生物传感器的活性表面区域接合到诸如分子配体的生物分子主要依靠特制化学成份以将它们共价附着到该表面，由此促进感兴趣的特定目标的后续结合。

已经提出了微孔或纳米孔衬底（膜）作为生物传感器衬底，这种衬底将大区域与快速结合动力学相结合。这种传感器的实例在EP-06766040-A中示出，其中公开了玻璃衬底上的不同线栅组成。该生物传感器的活性区域由沉积在玻璃上的线栅构成。具体而言，通过使用亚衍射极限导线，入射偏振光的强度仅在表面附近20-30nm层内是显著的并且它在其余范围被抑制，导致检测到局部结合。

特别地，当分析物浓度低（例如低于1nM，或低于1pM）时，扩散动力学在生物传感器化验的总性能中起着重要作用。对于分析物到特定分子配体的最优结合效率，特定的表面区域和短的扩散长度是非常有利的。

发明内容

本发明的目的是最优化传感器（比如发光传感器）中的局部结合效率，从而提高信噪比。

该目的是通过用在将用激发光照射的发光传感器中的多层衬底结构实现的，该多层衬底结构包括：

至少一个载体层（11），

第一层（12），所述载体层和第一层彼此接触，以及

至少一个第二层（13），其具有不同于该第一层的化学成分，所述第一层和第二层彼此接触，该第二层形成若干开孔，每个开孔具有至少一个小于衍射极限的面内尺度（W1），该衍射极限由该激发光的辐射波长限定。

根据本发明的衬底包括形成表面的第一层和形成导线的第二层，该导线被放置为使得形成若干开孔，所述开孔具有至少一个小于激发光的衍射极限的面内尺度（W1）。这两个层具有不同的化学成分，例如由两种不同材料制成。通过使用两种不同化学成分，在所述导线之间形成表面的第一层可以在化学上表现出不同于第二层（即导线）的行为。通过使用这些不同的化学属性，可以仅在所述层中的一个上促进生物分子的结合。

寄生浓度损耗是这样的过程，其中目标分子的结合不被限制于检测到该目标的位置。这将导致检测区域内目标的结合率的减小。最小化目标分子到无活性感测区域的结合（例如到第二层的结合）将导致检测区域内目标的结合率的诱导。

通过最小化目标分子到无活性感测区域的结合，将寄生浓度损耗限制在当前衬底结构中。

优选地，载体层和第一层对于激发光是基本可透过的，以便使得能够在衬底下面放置光源和或检测器。基本可透过的意思是透射激发光的至少10%，优选地高于1/e(36.8%)。

更优选地，第一层具有5nm到10nm的厚度。该厚度允许激发光通过该层。对于由金制成的第一层，从虚折射率（来源：Palik）得出，对于200nm与1100nm之间的光的波长，1/e强度衰减长度在11nm与21nm之间。

在优选实施例中，第一层包括惰性金属，优选地选自包括金、钛、铂和钯或其组合的群组。

在优选实施例中，形成导线的第二材料是铝、氧化铝或其组合。

在优选实施例中，第一层被化学改性以促进分子目标固定。高效的目标固定是生物传感器的基本特征之一。在固定之后，可以显现分析物结合的量。为了将生物分子附着到表面，可以例如经由硫或胺类化学成份改性该表面。

在优选实施例中，第一层的表面可以用硫醇基功能化。硫醇经由S原子共价附着在金属表面，S原子提供了用于共价地提供用于生物分子（比如分子配体或探针）的锚的精致且容易的方式。优选地，硫醇分子包括具有10到18个碳原子的长度的酰基链。

优选地，第一层的表面用分子配体功能化，分子配体包括但不限于特定的捕获探针。分子配体可以是核酸，比如DNA、RNA、适体、抗体、Fab片段、Fc尾。它们可以是蛋白质，比如受体、抗体。抗体可以以多克隆和/或单克隆抗体的形式使用。分子配体可以是药物或细胞或其它化学化合物。

在优选实施例中，第二层未被功能化。未被功能化的意思是功能基被特别地定位在第一层上而不是在第二层上。然而，这不排除第二层上存在一些功能基。与第一层上存在的功能基的量相比，第二层上存在的功能基的量优选地低于20%，甚至更优选地低于10%。

本发明进一步涉及一种发光传感器，其包括根据权利要求1的多层衬底结构、用于照射该传感器的激发辐射源（31）和用于检测发光辐射的检测器（32）。优选地，该发光传感器是发光生物传感器。

此外，本发明涉及一种用于制造根据本发明的衬底结构的方法，包括以下步骤：

提供载体层（11），

在载体层的顶部上添加第一层（12）

在第一层的顶部上添加第二层（13）

通过图案化所述第二层限定具有至少一个小于衍射极限的面内尺度（W1）的若干开孔。

本发明还涉及根据本发明的衬底结构以及发光传感器用于检测目标分子的用途。

附图说明

图1：根据本发明的实施例的衬底结构

图2：对衬底结构的化学改性

图3：发光传感器。

具体实施方式

根据本发明的多层衬底结构和发光传感器系统非常适合用于目标成分的定性或定量检测，其中目标成分可以例如是生物学物质，如生物分子、复合体、细胞片段或细胞。术语“目标”将表示具有某种属性（例如，光学密度、磁化率、电荷或发光）的任意粒子（原子、分子、复合体、纳米粒子、微粒子等），其包括可被检测到的可能的标签粒子，从而（间接地）揭示相关的目标成分的存在。“目标”和“标签粒子”可以是相同的。

将生物传感器的活性表面区域接合到生物分子主要依靠特制化学成份以将诸如捕获探针的分子配体共价附着到该表面，并且由此促进感兴趣的特定目标的捕获。

玻璃表面可以容易地利用烷硅醛改性从而暴露醛基，醛基将与生物分子（蛋白质、合成寡核苷酸）中大量存在的伯胺起反应。以相似的方式，可以为了相同的目的使用环氧硅烷，由此向该表面涂覆与伯胺反应的环氧化物基。可替代地，利用氨基硅烷的处理将在玻璃表面上暴露氨基，该氨基与具有或没有氨基的生物分子交联，例如在暴露于UV光时，DNA主链的磷酸基对于稳定且高效的结合是足够的。然而，这些改性策略不仅在玻璃上而且在Al/Al₂O₃上是高效的，Al/Al₂O₃是用于用在光学传感器中的线栅图案的优选材料。

在常规线栅衬底中，铝线栅以间距W1（导线之间的开放间隔）沉积到玻璃衬底上，该间距小于填充导线之间间隔的介质中的衍射极限。导线之间间隔的优选值是70nm，对于1/1的开放/闭合比，这导致140nm的周期。这里，填充导线之间间隔的介质中的衍射极限被定义为0.5倍的波长（在真空中）与填充导线之间间隔的介质的折射率的实部之间的比。在周期性结构的情况下（这是优选的，因为这导致产生第一层的可用于结合的最大区域），优选的是，具有小于衍射极限的周期性间距以避免寄生衍射效应。将这些因素考虑在内，优选的是对于小于700nm的激发波长，导线之间间隔的值小于140nm，优选地小于100nm。有效测量体积被减小到玻璃表面之上的仅20nm到30nm（依赖于导线的间距）的薄层；激发光具有20-30nm的衰减长度。Al导线的表面在周围环境条件下被氧化（Al₂O₃）。将捕获探针共价附着到这种纳米结构化表面的常规策略包括玻璃的硅烷化以及由此还有Al导线的硅烷化。作为其结果，分子目标不仅可以附着到导线之间的玻璃表面，而且可以附着到导线本身上，从而降低由于寄生浓度损耗引起的传感器的灵敏度。这意味着感兴趣的目标可以在导线之间或导线上的每个地方结合，而活性感测区域被限于导线之间的玻璃表面。寄生浓度损耗可以通过最小化目标分子到无活性感测区域的结合而被减小；目标分子到活性感测区域的结合也导致浓度损耗，但是这是可接受的，因为这也导致测量的信号增加。分子配体到导线之间的层的特定靶向对于提高检测灵敏度是有利的。

优选的是，在导线之间提供与导线本身相比具有不同化学成分的衬底，因此可以实现目标的选择性结合。图1示出这种衬底的示意性轮廓。载体层11被第一材料的第一层12覆盖。在该第一层顶部上放置第二层13，该第二层形成线栅的导线，该线栅形成若干开孔，每个开孔具有至少一个小于衍射极限的面内尺度（W1）,该衍射极限是由激发光的辐射波长限定的。

优选地，第一层基本上由惰性金属形成。惰性金属的化学特性不同于纯Al和/或Al氧化物的化学特性，从而使得特定的化学处理将影响惰性金属而不影响导线，且反之亦然。为了仅在导线之间的表面上固定分子目标，在第一实例中，第一层被化学改性以促进分子目标固定。可以设想若干种改性，其为促进对于目标是特定的探针或配体的稍后结合的改性。第二，设想这样的改性，其中第一层被改性为包括用于目标结合的分子配体。第三选项可以是对第一层的改性，该改性促进目标的立即结合而无需特定的分子配体。

第一层的可能的化学改性的实例可以是基本由惰性金属形成的第一层与硫醇的反应，该硫醇经由S原子共价附着在金属表面上。图2A中示意性表示了这一点。依赖于所使用的硫醇，它们可以在表面上重新取向，由此形成分子堆叠，所谓的自组装单层23（SAM）。优选地，硫醇分子包括具有10到18个碳原子长度的酰基链。如果硫醇包括特定的功能基（R）（例如羧酸盐、硫醇、胺），则这些基团将被暴露到表面上并且充当共价固定分子目标的锚（图2中的21）。通过采用该策略，生物分子将特定地结合到导线之间的活性传感器区域上，由此提高传感器灵敏度。图2B示出生物分子或分子或者分子配体经由来自图1A的硫醇分子的共价附着。作为实例，抗体22链接到传感器表面12。此外，可以通过常规阻挡试剂（例如BSA）防止线栅上的非特定分子附着。

根据本发明的衬底结构可以用在发光传感器系统中以便促进目标结合测量。根据图3示意性表示的方面，该发光传感器系统优选地包括下列组件。

a）衬底，其包括载体层、第一层和第二层。在透射型设置中，该载体优选地对于给定光谱范围的光，特别是由将在下文限定的光源所发射的光具有高透明度。衬底的载体可以例如由玻璃或某种透明塑料生产。该载体可以是可透过的；它为设于载体上的开孔限定结构提供承载功能，所述开孔限定结构具有比衍射极限小的最小面内开孔尺度（W1）。

所述衬底包括第一结合表面层，目标成分可以聚集在该层处。术语“结合表面”在这里主要被选择作为对材料的第一层的表面的唯一引用。在结合表面上提供第二层，以用于响应于在结合表面处入射的辐射在检测体积中提供渐逝辐射，该检测体积是由结合表面约束的且在衰减长度上远离结合表面延伸到样本室中。注意，给定介质中的“渐逝辐射”这一术语是指空间频率大于给定介质的波数（即，真空中的波数乘以介质的折射率）的非传播波。根据本发明，渐逝波是通过全内反射或通过在亚衍射极限的开孔（为根据本发明的第二层）上入射而生成的。具体而言，渐逝波场将依赖于照明光典型地以10-500nm的1/e衰减长度而衰减。此外注意，所述光学结构优选地属于这样的种类：渐逝场基本上不通过光学结构传播，这意味着开孔限定结构的面外尺度显著地大于所述1/e衰减长度。

b）源31，其用于发射辐射束34（下文中称为“入射光束”）进入前述载体，使得该辐射束至少在载体的结合表面处的研究区域中被反射。该源可以例如是激光器或发光二极管（LED），其可选地设有用于成形和引导入射光束的某种光学器件。所述研究区域可以是结合表面的子区域或者包括完整的结合表面；它将典型地具有被入射光束照射的基本上圆形斑点的形状。

c）检测器32，其用于响应于从源发射的入射辐射，检测来自检测体积36中存在的目标成分的辐射35，该检测器可能连接到记录模块33。注意，术语“来自目标成分的辐射”包括适合用于检测目标成分（可能地包括任何标签粒子）的存在的任何辐射。不受限制地，所述辐射可以是散射、反射或发光类型。所述检测器可以包括可以由其检测给定光谱的光的任何合适的一个或多个传感器，例如光电二极管、光敏电阻器、光电池或光电倍增管。在本说明书中使用术语光或辐射的地方，其意思是包含所用类型的电磁辐射，具体而言依赖于上下文，可见的以及不可见的电磁辐射。

根据本发明的传感器设备允许灵敏地且精确地定性或定量检测结合表面处的研究区域中的目标成分。所描述的光学检测过程的一个优点包括其精确性，因为渐逝波仅探查典型地从邻近载体的开孔的端部延伸10-30nm至该开孔中的小体积，从而避免干扰，比如来自该体积后面的体材料的散射、反射、发光。

所述发光传感器系统可以用于目标成分的定性检测，从而例如产生关于具体目标分子的简单的二元响应，即存在或不存在。然而，所述发光传感器系统可以包括评估模块，其用于从所检测到的反射光定量地确定研究区域中的目标成分的量。这可以例如基于以下事实：在渐逝光波中被目标成分吸收或散射的光的量与研究区域中这些目标成分的浓度成比例。根据相关结合过程的动力学，该研究区域中目标成分的量进而可以指示在与开孔连通的样本流体中这些成分的浓度。

本发明上下文中的样本可以源自生物学来源。其包含生物流体，比如淋巴液、尿液、脑脊液、野马杠杆流体（BAL）、血液、唾液、血清、粪便或精液。其还包含组织，比如上皮组织、结缔组织、骨骼、肌肉组织（比如脏肌或平滑肌和骨骼肌）、神经组织、骨髓、软骨、皮肤、粘膜或毛发。本发明上下文中的样本也可以是源自环境源的样本，比如植物样本、水样本、土壤样本，或者可以源自家庭或工业源或者也可以是食物或饮料样本。本发明上下文中的样本也可以是源自生物化学或化学反应的样本或者源自制药、化学或生物化学成分的样本。在适当情况下，例如在固体样本或粘性悬浮液的情况下，样本在本发明中使用之前可能需要利用溶剂溶解、均匀化或萃取以便获得液体样本。因此，液体样本可以是溶液或悬浮液。在本发明中使用之前，液体样本可以经受一种或多种预处理。这样的预处理包括但不限于稀释、过滤、离心分离、预浓缩、沉淀、渗析、溶化、洗脱、萃取。预处理也可以包括将化学或生物化学物质加到溶液中，所述化学或生物化学物质比如为酸、碱、缓冲剂、盐、溶剂、活性染料、清洁剂、乳化剂、螯合剂、酶、离液剂。

在此处描述的本发明上下文中，如“该”、“一”或“一个”的表达和等价表达不理解为是指单个实体，而是指多个相同实体，除非另外指定。为了方便读者，本文使用了单数。

提供术语或定义完全是为了辅助理解本发明。除非特别指示，这些定义不应当被解释为具有比本领域普通技术人员所理解的范围小的范围。本领域技术人员在实践要求保护的本发明时通过研究附图、公开内容和所附权利要求能够理解并实现对所公开实施例的其它变型。

实例1

根据本发明的衬底结构的制造

在透明玻璃衬底上蒸发形成5-10nm厚的Au层，接着蒸发形成160nm厚的铝层。在铝层顶部上，通过溶胶凝胶压印限定溶胶凝胶掩模（参考文献：M. Verschuuren, and H. van Sprang, “3D Photonic Structures by Sol-Gel Imprint Lithography,” MRS 2007 Spring Meeting (San Francisco) (Vol. 1008, 2007)）。导线是通过蚀刻到铝层中下至金层限定的。

实例2

衬底结构的自组装单层（SAM）涂覆

- 将具有惰性金属的第一层的衬底放置在玻璃瓶中，该玻璃瓶含有：溶解在乙醇中的巯基十一酸＝HS-C₁₀H₂₀-COOH（SAM溶液）。

- 在黑暗中在室温培养3小时。

- 取出衬底并用乙醇清洗。

- 用氮气枪使衬底干燥。

- 称量76.6mg的1-乙基-3-[3-二甲氨基]碳化二亚胺盐酸盐（EDC）每毫升H₂O。

- 称量12.5mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）每毫升H₂O。

- 就在使用之前以1:1比率混合EDC和NHS并且在衬底上放置一滴。

- 在潮湿气氛中培养7分钟。

- 利用虹吸管用水冲洗衬底1秒钟。

- 用氮气枪使衬底干燥。

- 在芯片上放置一滴抗体/捕获探针（1mg/ml）。在黑暗中在潮湿气氛中培养30分钟。

- 用虹吸管用1×磷酸盐缓冲盐水冲洗衬底1秒钟。

- 使用氮气枪使衬底干燥。

- 衬底准备就绪。

Claims

1. 一种用在将用激发光照射的传感器中的多层衬底结构，包括：

至少一个载体层（11），

第一层（12），所述载体层和第一层彼此接触，以及

2. 根据权利要求1的衬底结构，其中该载体层和该第一层对于该激发光是基本可透过的。

3. 根据权利要求1和2中任一项的衬底结构，其中该第一层具有5nm到10nm的厚度。

4. 根据权利要求1至3中任一项的衬底结构，其中该第一层包括惰性金属。

5. 根据权利要求1至4中任一项的衬底结构，其中该第二层基本上由铝、氧化铝或其组合形成。

6. 根据权利要求1至5中任一项的衬底结构，其中该第一层被化学改性以促进分子目标固定。

7. 根据权利要求6的衬底结构，其中该第一层的表面用硫醇基功能化。

8. 根据权利要求1至7中任一项的衬底结构，其中该第一层的表面用分子配体功能化。

9. 根据权利要求7或8中任一项的衬底结构，其中该第二层未被功能化。

10. 一种发光传感器，其包括根据权利要求1的多层衬底结构、用于照射该传感器的激发辐射源（31）和用于检测发光辐射的检测器（32）。

11. 一种用于制造根据权利要求1至9中任一项的衬底结构的方法，包括以下步骤：

提供载体层（11），

在该载体层的顶部上添加第一层（12），

在该第一层的顶部上添加第二层（13）

12. 根据权利要求11的方法，其中该第一层和或第二层经由蒸发被添加。

13. 根据权利要求11和12中任一项的方法，其中该第一层被化学改性以促进捕获探针结合。

14. 根据权利要求1至9中任一项的衬底结构或者根据权利要求10的发光传感器用于检测目标分子的用途。