JP2020027032A - 被検物質の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
前記指標が所定の範囲内の粒子を、被検物質が結合した粒子と判定する、
処理部を備える、被検物質の検出装置。
本発明は、その一態様において、被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体とを含む複合体が基盤上に形成された状態で、前記粒子の挙動に関する指標に基づいて前記被検物質を検出する、被検物質の検出方法(本明細書において、「本発明の検出方法」と示すこともある。)に関する。以下に、これについて説明する。
被検試料は、被検物質を含み得る限り、特に制限されない。被検試料としては、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、細胞又は組織の可溶化液などの生体試料、尿や糞便などの排泄物、河川水、海水、土壌などの環境サンプルなどが挙げられる。
被検物質は、本発明の検出方法の検出対象の物質であり、被検物質に対する結合親和性を有する物質(本明細書において、「結合性物質」と示すこともある)が存在するか、又は結合性物質を製造できる限り、特に限定されない。結合性物質が抗体である場合は、抗原性を有する物質であれば、いかなる物質であっても被検物質となり得る。被検物質の具体例としては、例えば抗体、タンパク質、核酸、生理活性物質、ベシクル、細菌、ウイルス、ポリペプチド、ハプテン、治療薬剤、治療薬剤の代謝物などが挙げられる。
粒子は、被検物質に対する結合性を有し、液体中で運動可能であり、且つそれ自身又は他の物質と反応することにより可視化可能な粒子である限り特に制限されない。粒子は、好ましくは液体中でブラウン運動可能な粒子である。また、粒子は、被検物質に対する特異的な結合性を有することが好ましい。
捕捉体は、被検物質に対する結合性を有し且つ基盤に固定されているものである限り特に制限されず、単一の分子からなるものであってもよいし、複数の分子からなる複合体であってもよい。捕捉体は、被検物質に対する特異的な結合性を有することが好ましい。
基盤は、その一部又は全部に捕捉体を固定可能なもの(固相等)である限り特に制限されない。基盤としては、例えばポリスチレン等のプラスチック、ガラス、ニトロセルロースなどを主成分として含む基盤が挙げられる。基盤は、その一態様において、土台となる層と、該層上の一部又は全部に配置される他の層とを含む。基盤の形状は、被検物質、粒子、及び捕捉体が相互に接触する場(たとえば、液相)を保持できる形態である限り特に制限されない。基盤の形状としては、例えば板状等の平面のみからなる形状、半球状、管状等の曲面のみからなる形状、これらの形状が組み合わされてなる形状等が挙げられる。
複合体は、被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体とを含む。より具体的には、複合体は、基盤側から、捕捉体、被検物質、粒子の順に配置されてなる。
被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体と、基盤とを接触することにより複合体を基盤上に形成する工程。
被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子とを、いくつかの前記粒子は被検物質と結合して被検物質結合粒子を形成し且つ統計的に有意な少なくとも1つの前記粒子は被検物質と結合しないような様式で接触させる、粒子接触工程、及び
前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体が固定された基盤に、前記粒子接触工程を経た試料を接触させ、前記被検物質結合粒子と前記基盤上の前記捕捉体との複合体を形成する、複合体形成工程。
被検物質の検出は、粒子の挙動に関する指標に基づいて行うことができる。挙動は、好ましくは粒子のブラウン運動による挙動である。
本発明は、その一態様において、
被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体とを含む複合体が基盤上に形成された状態で、前記粒子の挙動を示す画像から、該挙動に関する指標を算出し、
前記指標が所定の範囲内の粒子を、被検物質が結合した粒子と判定する、
処理部を備える、被検物質の検出装置(本明細書において、「本発明の検出装置」と示すこともある。)
に関する。以下に、本発明の検出装置について添付の図面を参照しながら説明するが、本発明の検出装置は、かかる実施形態のみに限定されるものではない。なお、本発明の検出装置において、本発明の検出方法について既に説明されている用語については、説明を省略するが、本発明の検出方法における各用語についての説明は、本発明の検出装置にも援用される。
本発明の検出装置は、上記処理部を含む限り特に制限されない。好ましい態様において、本発明の検出装置は、反応部及び撮像部を備える。図3に、該好ましい態様における本発明の検出装置の一実施形態の構成の概略図を示す。
被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体とを含む複合体が基盤上に形成された状態で、前記粒子の挙動を示す画像から、該挙動に関する指標を算出し、
前記指標が所定の範囲内の粒子を、被検物質が結合した粒子と判定する。
次に図5を用いて、本発明の検出装置の動作を説明する。本発明の検出装置の動作は、コンピュータシステム3の処理部(CPU)30が制御する。
実施例1-1.抗体リンカー修飾fLチャンバアレイフローセルの作製
作製方法の概要を図6に示す。また、作製したフローセルの模式図を図7に示す。具体的には以下のようにして作製した。
(1)カバーガラス(松浪硝子)を8 N KOHに浸漬し、15分間超音波洗浄した。
(2)流水で洗浄し、ブロアした。
(3)カバーガラスをスピンコーターにセットし、CYTOP(CTL-809M, 旭硝子)を滴下した。以下のプログラムでスピンコートした。CYTOPは、作製後のチャンバーの深さが0.8μmとなるようにコートした。
実施例1-1-2.フォトリソグラフィ
(1)CYTOPを塗布したガラスをスピンコーターにセットし、レジスト(AZ4903, Merck)を適量滴下した。以下のプログラムでスピンコートした。
(3)110 ℃に加熱したホットプレートで5分間加熱した。
(4)露光装置(Ba100it、山永電機)にCrマスクをセットし、レジストを塗布したカバーガラスをセットした。Crマスクにおいては、作製後のチャンバーの幅(直径)が2.5 μmとなるように円形にCrが除去された領域が複数形成されている。
(5)256 Wで7秒間露光した。
(6)現像液(AZ300MIF Developer, Merck) に5分間浸し、現像した。
(7)脱イオン水で洗浄し、ブロアした。
(1)エッチング装置(RIE-10NR, Samco)に洗浄後のカバーガラスをセットし、以下のプログラムでエッチングした。
(1)SHオルガノシラン(KBM-803、Shinetsu)溶液に前処理したカバーガラスを2時間浸漬し、シラン化した。
(2)1 mg/mL ビオチン結合PEG(PG2-BNML-10k, Nanocos)/25mM MES溶液を作製し、前処理したカバーガラス上に添加した。氷上で脱気後、室温で1時間静置した。
(3)静置後のカバーガラスをアセトンに浸漬し、5分間超音波洗浄してレジストを取り除いた。
(4)エタノールに浸漬し、5分間超音波洗浄した。
(5)純水に浸漬し、5分間超音波洗浄し、ブロアした。
(1)24*32*5 mmのガラスに直径1.2 mmの穴を複数開けたガラスを準備した。
(2)CYTOP(CTL-809M, 旭硝子)を滴下し、1000 rpm/30秒間スピンコートした。
(3)180 ℃に加熱したホットプレートで1時間加熱した。
(1)PEGリンカー修飾基板に3*20mmの型抜きをした両面テープ(7602#25, 寺岡製作所)を貼り、上面ガラスを押し当て、フローセルを作製した。
(2)PBST/20 uLを注入した。
(3)10 ug/mL ストレプトアビジン(Thermofisher)/PBST溶液/20 uLを注入した。室温で30分間静置した。
(4)PBST/100 uLを注入した。
(5)1 ug/mL/ビオチン化抗体/1%BSA/PBST/20 uLを注入した。室温で1時間静置した。
抗体:バイオスペシフィック社製 抗PSAモノクローナル抗体(製品No.A45170)
ビオチン化:DOJINDO社製 ビオチンラベリングキットSH
(6)PBST/100 uLを注入した。
抗体結合磁性ナノ粒子を作製した。作製した該粒子の模式図を図8に示す。
(1)直径約550nmのCOOH磁性ナノ粒子溶液(JSR)をボルテックスで十分に攪拌後、80 uLを分注し、BF分離した。
(2)DMF/300 uLを添加し、ボルテックスで十分に攪拌し、5分間超音波処理した。
(3)集磁後、再度上記(2)を行った。このサイクルを計3回行った。
(4)集磁後、DMF/160 uLを添加し、5分間超音波処理した。
(1)以下の組成で1M NHSを作製した。また、EDCを秤量した。
・NHS / 11.5 mg+ DMF / 100 uL
・EDC / 7.7 mg
(2)1M NHS/40 uLをビーズ溶液(実施例1-2-1)に添加した。
(3)NHS-ビーズ溶液/200 uLを秤量したEDCに添加した。
(4)5分間超音波処理した。
(5)撹拌器/出力80%で、室温で2時間攪拌した。
(6)BF分離した。
(7)DMF/300 uL添加して、5分間超音波処理した。
(8)上記(6)及び(7)のサイクルを計5回行った。
(9)新しいチューブに移した。
(10)メタノール/300 uLを添加し、5分間超音波処理した。
(11)BF分離した。
(1)25 mM MES/50 uLを添加し、5分間超音波処理した。
(2)抗体溶液/43 uLを添加した。攪拌器/出力80%で、4℃で一晩攪拌した。
抗体:バイオスペシフィック社製 抗PSAモノクローナル抗体(製品No.A45160)
Fab化:ペプシン消化、分画
(3)BF分離した。
(4)50 mM Tris/300 uLを添加した。攪拌器/出力80%で、室温で15分間攪拌した。
(5)BF分離した。
(6)HISCL, R3(緩衝液)(Sysmex)/200 uLを添加し、ボルテックスした。
(7)BF分離した。
(8)上記(6)及び(7)のサイクルを計3回行った。
(9)HISCL, R3(緩衝液)(Sysmex)/1 mLを添加した。
実施例1-3-1.試料
PBS中に各濃度のPSAを含む純系試料、および血漿中に各濃度のPSAを含む夾雑系試料を以下の要領で調製した。
・PSA : HISCL, PSA, C2 calibrator(Sysmex)20ng/ml
・PBS : リン酸緩衝液
・血漿 : PSAフリー人血漿(株式会社サンフコ)。
純系試料のPSA濃度 :0,0.08,0.4,2.0,10 pg/mL
夾雑系試料のPSA濃度:0,2.0,10,50 pg/mL。
使用した顕微鏡、レンズ及びカメラの情報は以下の通りである。
顕微鏡:オリンパス 倒立蛍光顕微鏡IX71
レンズ:UPlanApo, 40×, NA1.00(Olympus)
カメラ:DMK23UX174(Imagingsource)。
(1)抗体結合磁性ナノ粒子溶液/40 uLとサンプル溶液/20 uLを混合した。抗体結合磁性ナノ粒子溶液/40 uLには、106個の粒子を含まれている。この場合、混合後の粒子上の平均PSAは以下表のとおりとなる。
(3)磁石上に抗体リンカー修飾fLチャンバアレイフローセルをセットし、上記混合溶液を全量添加した。
(4)その後オイル(フロリナートFC-40, 3M)/20 uLを流し、チャンバーアレイをオイルで封入した。
(5)封入後すぐに顕微鏡に上記フローセルをセットし、暗視野画像を既報(T. Masaike et al, Nature structural & Molecular Biology, 15, 2008, 1326-1333)に準じて取得した(50 fpsで1sec、20視野撮影)。混合物の添加(上記(3))から画像取得までの時間は約3分であった。本工程の概要を図9に示す。
(1)取得した画像をFiji(NIH)で開いた。顕微鏡画像の一部を図10に示す。抗体リンカー修飾fLチャンバアレイフローセル内にナノ粒子が封入されている様子が確認できる。
(2)Subtract backgroundを実施し、ノイズを除去した。
(3)Track mateを起動し、各粒子の座標の時間変化を取得した。本工程の概要を図11に示す。
上記の方法に従い、PSAの各濃度の試料から得られたデータから2ndピークに相当するtethered beadsを計数した。純系試料におけるデータを図14に、また夾雑系試料におけるデータを図15に示す。なお、このときには粒子挙動を表す指標として以下の式3から求まるVelocity(V)を用いた。
Claims (25)
- 被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体とを含む複合体が基盤上に形成された状態で、前記粒子の挙動に関する指標に基づいて前記被検物質を検出する、被検物質の検出方法。
- 前記被検試料中の被検物質と、前記粒子と、前記捕捉体と、基盤とを接触することにより前記複合体を基盤上に形成する工程と、前記基盤上の前記粒子の挙動に関する指標に基づいて前記被検物質を検出する工程、
を含む、請求項1に記載の検出方法。 - 被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子とを、いくつかの前記粒子は被検物質と結合して被検物質結合粒子を形成し且つ統計的に有意な少なくとも1つの前記粒子は被検物質と結合しないような様式で接触させる、粒子接触工程、
前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体が固定された基盤に、前記粒子接触工程を経た試料を接触させ、前記被検物質結合粒子と前記基盤上の前記捕捉体との複合体を形成する、複合体形成工程、
前記複合体形成工程後、前記粒子の挙動に関する指標に基づいて前記被検物質を検出する、検出工程、
を含む、請求項1又は2に記載の検出方法。 - 前記挙動が前記粒子のブラウン運動による挙動である、請求項1〜3のいずれかに記載の検出方法。
- 前記指標が所定時間における各粒子の運動量の指標である、請求項1〜4のいずれかに記載の検出方法。
- 前記粒子の挙動について静止画を取得し、または前記粒子の挙動の動画を撮像し、前記静止画または動画に基づいて粒子の挙動に関する指標が求められる、請求項1〜5のいずれかに記載の検出方法。
- 前記静止画または動画から判別された挙動パターンと、予め設定された被検物質を含む複合体の挙動パターンとを比較し、前記挙動パターンが被検物質を含む複合体の挙動パターンと合致するか否かを判定することにより、前記被検物質を検出する、請求項6に記載の検出方法。
- 前記指標が、平均二乗変位、拡散係数(D)、及び平均速度(V)からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1〜7のいずれかに記載の検出方法。
- 前記検出工程が、前記粒子の挙動に関する指標が所定の範囲内の粒子を、被検物質が結合した粒子と判定する工程を含む、請求項1〜8のいずれかに記載の検出方法。
- 前記検出工程が、前記粒子の挙動に関する指標が上限の閾値以下である粒子、或いは該指標が上限の閾値以下であり且つ下限の閾値以上である粒子を、被検物質が結合した粒子と判定する工程を含む、請求項1〜9のいずれかに記載の検出方法。
- 前記検出工程が、被検物質が結合した粒子を計数し、計数結果に基づいて前記被検物質を定量する工程を含む、請求項1〜10のいずれかに記載の検出方法。
- 前記捕捉体がリンカーを含む、請求項1〜11のいずれかに記載の検出方法。
- 前記リンカーが核酸、高分子物質、及び脂質からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項12に記載の検出方法。
- 前記リンカーの長さが1nm以上である、請求項12又は13に記載の検出方法。
- 前記粒子が液体中でブラウン運動可能な粒子である、請求項1〜14のいずれかに記載の検出方法。
- 前記粒子が磁性粒子である、請求項1〜15のいずれかに記載の検出方法。
- 前記粒子の粒子径が1μm以下である、請求項1〜16のいずれかに記載の検出方法。
- 前記基盤上に、側面および底面で構成されるチャンバーが形成されている、請求項1〜17のいずれかに記載の検出方法。
- 前記チャンバーの底面に捕捉体が固定され、前記チャンバーの底面上に前記複合体が形成される、請求項18に記載の検出方法。
- 前記チャンバーの深さが前記粒子の粒子径の5倍以下である、請求項18又は19に記載の検出方法。
- 前記チャンバーの深さが10μm以下である、請求項18〜20のいずれかに記載の検出方法。
- 前記基盤が、板状部材である、請求項1〜21のいずれかに記載の検出方法。
- 前記複合体を形成する際に、前記粒子を基盤方向に向かわせる外力を付与する、請求項1〜22のいずれかに記載の検出方法。
- 被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体とを含む複合体が基盤上に形成された状態で、前記粒子の挙動を示す画像から、該挙動に関する指標を算出し、
前記指標が所定の範囲内の粒子を、被検物質が結合した粒子と判定する、
処理部を備える、被検物質の検出装置。 - さらに、
被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体とを含む複合体を基盤上に形成するための反応部、及び
前記反応部における前記粒子の挙動を撮像する撮像部、
を備える、請求項24に記載の検出装置。
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