TWI536018B - 比色免疫檢測方法及其裝置 - Google Patents

Description

比色免疫檢測方法及其裝置

本發明係關於一種樣品檢測方法及裝置，尤指一種利用抗原檢測出抗體或利用抗體檢測出抗原，以供快速檢測之比色免疫檢測方法及裝置。

快速檢測技術在食品、農業、醫藥、環境，乃至生物檢測經常廣獲使用。以生物檢測為例，用於偵測人體或動物體體液內特定物質，如酵素、抗體或致病原的檢測方法不下數千種，然而考量靈敏度、正確性及操作便利性等問題，目前最常採用的生物檢測方法為免疫分析技術。免疫分析技術為利用抗體與抗原結合所產生的免疫專一性反應來定性或定量測定待測物中抗原或抗體的一種技術。

較早被發展的免疫分析法為放射免疫分析法，主要用途在於偵測與定量荷爾蒙、腫瘤標記和藥物等，此種方法的優點在於待測物中一般不會具有干擾放射性標記的物質，因此不會受到雜質的干擾而影響檢測結果，且此種方法的靈敏度高，但使用此方法需要具有操作和處理放射性 物質的執照，且因放射性物質具有衰退性，所以檢驗試劑的櫥窗壽命通常少於六個月。後續發展出利用免疫化學原理做成的快速免疫檢驗試劑，皆具有快速簡易和不具放射性等優點，其中包括酵素免疫分析法、酵素連結免疫吸附分析法、免疫螢光分析法和免疫沉澱法等，但這些方法需要搭配儀器來判讀最終的檢測結果。此外，酵素對於高溫非常敏感，必須儲藏於適當的環境中，免疫檢測試劑具有一定的使用期限。

為達到快速和簡便檢測的目的，後續更發展出可藉由一次性反應得知檢測結果的免疫試紙。目前免疫試紙已有許多商品化的產品，如市面上最常見的是免疫驗孕試劑。前述免疫試紙大多為利用雙抗體三明治法的原理來分析具有數個抗原位置之蛋白質大分子。故習知免疫試紙雖然方便但目前只能用於定性檢測，無法做到定量檢測。

綜合上述，本發明提供一種比色免疫檢測方法及其裝置，使用更簡便快速又靈敏的方法檢測待測物，並能直接以肉眼觀察得知待測物的濃度，不需以儀器判讀檢測結果。

本發明之一實施方式是一種比色免疫檢測方法，用以檢知一待測物。比色免疫檢測方法包含下列步驟：在一基材表面聚合一多孔性薄膜層。使標定物吸附於多孔性薄膜層上。將金奈米粒子與待測物結合成一偶聯物。將偶聯物 導入多孔性薄膜層，使待測物與吸附於多孔性薄膜層之標定物專一性地結合。若偶聯物含有待測物時多孔性薄膜層呈現一預定顏色；若偶聯物不含有待測物時多孔性薄膜層則無顏色變化。最後觀察多孔性薄膜層顏色變化的長度來判讀待測物濃度。

根據本發明之一實施例，其中，標定物為抗原而待測物為抗體。

根據本發明之另一實施例，其中，標定物吸附於多孔性薄膜層後，利用牛血清蛋白或抗蛋白質吸附溶液來覆蓋非特異性結合位。

本發明之另一實施方式是一種比色免疫檢測方法，用以檢知一待測物。比色免疫檢測方法包含下列步驟：在一基材表面聚合一多孔性薄膜層。使標定物吸附於多孔性薄膜層上。將金奈米粒子與二級抗體結合。加入含有一待測物之待測液體，利用二級抗體與待測物的專一性地結合，使金奈米粒子、二級抗體及待測物結合成一檢測組偶聯物。將檢測組偶聯物導入多孔性薄膜層，使待測物與吸附於多孔性薄膜層之標定物專一性地結合。若待測液體含有待測物時多孔性薄膜層呈現一預定顏色；若待測液體不含有待測物時多孔性薄膜層則無顏色變化。最後觀察多孔性薄膜層顏色變化的長度來判讀待測物濃度。

根據本發明之一實施例，其中，標定物為一級抗體，而待測物為抗原。

根據本發明之另一實施例，其中，多孔性薄膜層係 以複數個多孔性整體式聚合物以光聚合方式或熱聚合方式原位聚合於基材上所形成。

藉此，本發明利用高分子聚合物以作為固相載體，藉由其高質量傳輸和固定高密度的捕獲抗原或抗體的特性，達到縮小抗體與抗原相互作用所需的擴散距離，使得檢測結果快速並減少藥劑消耗量。此外，利用金奈米粒子為比色免疫檢測的信號來源，能直接以肉眼觀察檢測結果，免除酵素酶、基底顯示劑等化學試劑或是複雜的設備來判斷檢測結果。且相較於免疫試紙法只能判斷有無抗原或抗體的定性分析，本發明可藉由觀察多孔性薄膜層顏色變化的長度達到抗原或抗體的定量測量。

本發明之再一實施方式為一種檢測待測物之比色免疫裝置。比色免疫裝置包含至少一金奈米粒子、一基材和一液體導流層。將金奈米粒子與待測物結合成檢測組偶聯物。基材之表面具有一多孔性薄膜層，可使一標定物吸附於多孔性薄膜層。液體導流層與基材貼合且覆於多孔性薄膜層上方，液體導流層供檢測組偶聯物流動於多孔性薄膜層上，使待測物與標定物專一性結合。其中，若檢測組偶聯物具有待測物，多孔性薄膜層呈現一預定顏色，若檢測組偶聯物不具有待測物，多孔性薄膜層則無顏色變化。並可藉由多孔性薄膜層顏色變化的長度來判讀抗原的濃度。

根據本發明之一實施例，其中，基材可為毛細管或塑膠元件。

藉此，本發明可應用於毛細管或塑膠元件上，以陣列式同時檢測不同抗原或抗體。且不需要特定光學或是電學檢測儀器，具有可攜式檢測抗原或抗體的應用潛力，故本發明檢測組偶聯物之比色免疫裝置為一個快速和簡便的免疫分析平台。

上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

110‧‧‧步驟

120‧‧‧步驟

130‧‧‧步驟

140‧‧‧步驟

150‧‧‧步驟

160‧‧‧步驟

170‧‧‧步驟

200‧‧‧比色免疫裝置

210‧‧‧基材

220‧‧‧多孔性薄膜層

221‧‧‧多孔性整體式聚合物

230‧‧‧液體導流層

310‧‧‧標定物

320‧‧‧牛血清蛋白

330‧‧‧二級抗體

400‧‧‧金奈米粒子

500‧‧‧待測液體

600‧‧‧待測物

700‧‧‧檢測組偶聯物

為讓本發明知上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖繪示本發明另一實施方式之比色免疫檢測方法之流程圖。

第2圖繪示本發明再一實施方式之比色免疫裝置之示意圖。

第3圖的(a)部分係多孔性薄膜層表面的掃描式電子顯微鏡(SEM)圖；(b)部分係金奈米粒子的穿透式電子顯微鏡(TEM)圖。

第4圖繪示多孔性薄膜層化學修飾之示意圖。

第5圖繪示以紫外光/可見光光譜儀檢測金奈米粒子和二級抗體的結合物的吸收波長圖。

第6圖的(a)部分為比色免疫裝置檢測結果呈色之照片圖； (b)部分為抗原濃度和顏色變化關係之散佈圖。

請一併參閱第1圖至第6圖。第1圖繪示比色免疫檢測方法之流程圖。第2圖繪示比色免疫裝置之示意圖。第3圖繪示電子顯微鏡圖。第4圖繪示多孔性薄膜層化學修飾之示意圖。第5圖和第6圖為比色免疫檢測方法的實驗數據圖。本實施方式之比色免疫檢測方法包含下列步驟。

步驟110，在一基材210表面聚合一多孔性薄膜層220。

依照本發明之一實施方式，其中多孔性薄膜層220係以複數個多孔性整體式聚合物221以光聚合方式原位聚合於基材210上所形成。多孔性整體式聚合物221以下述方式製備。基材210採用熔融矽毛細管，使用24%甲基丙烯酸縮水甘油酯(glycidyl methacrylate,GMA)為單體、16%乙二醇二甲基丙烯酯(ethylene glycol dimethacrylate,EDMA)為交聯劑、30%甲醇和30%乙醇為成孔劑，繼而以1%苯基二甲氧基苯乙酮(2,2-dimethoxy-2-phenylaceto phenone,DMPA)為光起始劑，將此混合溶液填入熔融矽毛細管中。密封隔板的兩端後，以UV光強度為20.0mW/cm²的氙弧燈通過光罩照射8分鐘，進行光聚合反應形成具多孔性之矽毛細管。再將矽毛細管以乙腈和奈米用水清洗。

依照本發明之另一實施方式，其中多孔性薄膜層220係以複數個多孔性整體式聚合物221以熱聚合方式原 位聚合於基材210上所形成。多孔性整體式聚合物221以下述方式製備。基材210採用熔融矽毛細管，使用40%甲基丙烯酸縮水甘油酯和乙二醇二甲基丙烯酯為單體、60%正十二醇(1-dodecanol)和環己醇(cyclohexanol)為成孔劑，繼而以1%偶氮二異丁腈(2,2'-Azobis(2-methylpropionitile))為自由基引發劑。混合溶液以超音波震盪10分鐘混合均勻，再用氮氣除氣10分鐘後，將此混合溶液填滿熔融矽毛細管中，將出口密封住後，於60℃反應20小時，進行熱聚合反應形成具多孔性之矽毛細管。再將矽毛細管以流動相(含0.4mol/L醋酸和4mmol/L三乙胺，比例為80：20的乙腈/甲醇)清洗未反應的單體。

請參照第3圖(a)部分之掃描式電子顯微鏡圖，以掃描式電子顯微鏡確認經聚合製程後，可形成均勻之多孔性整體式聚合物221，多孔性整體式聚合物221的直徑約為1μm成球形群聚。多孔性整體式聚合物221由高分子聚合物組成，其低阻力特性有利標定物310的流動，且具有高表面積可接上高密度標定物310。此外，多孔性整體式聚合物221多重表面修飾性，可藉由共聚功能性單體或化學修飾法，嫁接不同的化學官能團於多孔性整體式聚合物221表面上。因此以在矽毛細管內形成多孔性整體式聚合物221作為固像載體，其高質量傳輸和高密度標定物310分佈的特性，可縮小標定物310與待測物600相互作用所需的擴散距離，使得檢測試結果快速靈敏並減少藥劑消耗量。更省去以往免疫檢測中離心或是使用磁珠等步驟，簡化整體 免疫檢測的流程。

步驟120，使標定物310吸附於多孔性薄膜層220上。為了增加多孔性薄膜層220對標定物310的吸附速率，多孔性薄膜層220以下述方式進行化學修飾。將調配好2.5M半胱胺(cysteamine)溶液，以1μl/min之流速通過多孔性薄膜層220於室溫下1小時。再用奈米用水以3μl/min之流速清洗多孔性薄膜層220，直到洗脫液呈現中性為止。將4μg/ml標定物310以5μl/min之流速通過多孔性薄膜層22010分鐘後，於室溫下培養10分鐘。用磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)以5μl/min之流速清洗通過多孔性薄膜層22030分鐘以去除未結合之標定物310。

如第4圖所示，多孔性薄膜層220鍵結轉換係利用親核之半胱胺溶液，可打開多孔性整體式聚合物221表面之環氧乙烷部分，提高多孔性薄膜層220硫醇基團含量，硫醇基團與標定物310以雙硫鍵鍵結使標定物310吸附於多孔性薄膜層220上。為了降低後續檢測步驟中其他蛋白質經由靜電力和疏水性的非特異性結合，用含1%牛血清蛋白320和0.1% TWEEN 20的PBS或是抗蛋白質吸附溶液以5μl/min之流速清洗通過多孔性薄膜層220和矽毛細管側邊30分鐘，並培養10分鐘以覆蓋非特異性結合位置。最後用PBS以5μl/min之流速清洗通過多孔性薄膜層220和矽毛細管側邊30分鐘以去除未結合之牛血清蛋白320。

步驟130，將金奈米粒子400與二級抗體330結合。金奈米粒子400以下述方式製備。將250ml的1.0mM HAuCl₄攪拌並煮沸，加入25ml的38.8mM檸檬酸三鈉回流15分鐘。當溶液的顏色由黃色變為深紅色時，將溶液冷卻至室溫。此時HAuCl₄經氧化還原反應為球形金奈米粒子400。請參照第3圖(b)部分之穿透式電子顯微鏡圖，金奈米粒子400之實際尺寸經由穿透式電子顯微鏡成像加以驗證，其大小為2至100奈米。

將金奈米粒子400膠體以tris-borate-EDTA(TBE)緩衝溶液將pH值調整至7.4，加入二級抗體330培養20分鐘。金奈米粒子400和二級抗體330的混合比例為1：1至1：50。再加入100μl以奈米用水配製的1mg/ml牛血清蛋白320溶液培養20分鐘。將混合溶液以14,000rpm離心20分鐘後，去除上清液，以500μl含10%蔗糖的2mM TBE緩衝溶液懸浮金奈米粒子400。金奈米粒子400和二級抗體330的結合物以紫外光/可見光光譜儀來檢測。如第5圖(I)所示，金奈米粒子400的吸收波長約為520nm。如第5圖(II)所示，當金奈米粒子400膠體加入50mM氯化鈉溶液後，金奈米粒子400會聚集，使吸收波長位移至625nm。如第5圖(III)所示，將二級抗體330加入金奈米粒子400膠體中，當足夠量的二級抗體330靜電附著在金奈米粒子400表面上時，因創造空間上的距離和具有相同的表面電荷，可避免加入電解質溶液時金奈米粒子400的大量聚集，使金奈米粒子400的吸收波長大約為550nm。

步驟140，加入具有一待測物600之待測液體500，利用二級抗體330與待測物600的專一性地結合，使金奈 米粒子400、二級抗體330及待測物600結合成一檢測組偶聯物700。為了評估本發明的靈敏度，製備濃度由0.1ng/ml至1mg/ml的待測物600於PBS中，不同濃度的待測物600分別以1：1與金奈米粒子400和二級抗體330的結合物混合30分鐘以形成檢測組偶聯物700。

步驟150，將檢測組偶聯物700以5μl/min之流速導入多孔性薄膜層220 10分鐘，使待測物600與吸附於多孔性薄膜層220之標定物310專一性地結合。經過10分鐘的培養後，用含0.05% TWEEN20的PBS以10μl/min之流速清洗多孔性薄膜層220約10分鐘，以清除未結合之檢測組偶聯物700。

步驟160，觀察多孔性薄膜層220的顏色變化。若待測液體500含有待測物600時多孔性薄膜層220呈現一預定顏色；若待測液體500不含有待測物600時多孔性薄膜層220則無顏色變化。如第6圖(a)所示，(I)為未加入檢測組偶聯物700的多孔性薄膜層220呈現白色。(II)和(III)為分別加入待測物600濃度為0.1ng/ml和1mg/ml的檢測組偶聯物700的多孔性薄膜層220，多孔性薄膜層220的顏色由白色轉為一預定顏色。

步驟170，觀察多孔性薄膜層220的顏色變化長度來判讀待測物600濃度。當待測物600濃度越高時，多孔性薄膜層200轉變為預定顏色的長度越長。請參閱第6圖(b)，為加入不具有待測物600的對照組和不同濃度待測物600之檢測組偶聯物700的多孔性薄膜層220由白色轉變為 預定顏色的長度變化。縱軸為變異數指數(I)定義為：I=(L _i -L ₀ )/L ₀ ，其中，L ₀ 代表加入對照組多孔性薄膜層220由白色轉變為預定顏色的長度，L _i 代表加入不同濃度待測物600之檢測組偶聯物700後多孔性薄膜層220由白色轉變為預定顏色的長度。如第6圖(b)所示，長度變化的程度和待測物600濃度成正比。由實驗數據可知本發明具有高靈敏度，偵測極限可達0.1ng/ml。而本發明的最佳檢測範圍為0.1ng/ml至10μg/ml(R²=0.98)，具有超過5個數量級的線性範圍。且單一檢測可以在1小時內完成。藉此，本發明為具有高靈敏度、寬廣的動態線性範圍、專一性好、快速、簡便且能定量分析的比色免疫檢測方法。

本發明之另一實施方式為一種檢測待測物600之比色免疫裝置200。比色免疫裝置200包含至少一金奈米粒子400、一基材210和一液體導流層230。將金奈米粒子400與待測物600結合成一檢測組偶聯物700。基材210之表面具有一多孔性薄膜層220，可使標定物310吸附於多孔性薄膜層220。液體導流層230與基材210貼合且覆於多孔性薄膜層220上方，液體導流層230供檢測組偶聯物700流動於多孔性薄膜層220上，使待測物600與標定物310專一性結合。其中，若檢測組偶聯物700具有待測物600，多孔性薄膜層220呈現一預定顏色，若檢測組偶聯物700不具有待測物600，多孔性薄膜層220則無顏色變化，當該待測物600濃度越高時該多孔性薄膜層220顏色變化長度越長。檢測結果除了可以肉眼觀察多孔性薄膜層220顏色變 化的長度外，還可搭配掃描機(未圖示)、有照相功能手機(未圖示)或紫外光機(未圖式)記錄顏色變化的長度，並結合雲端功能記錄及計算分析結果。藉此，本發明利用多孔性薄膜層220為固相載體，因具高表面積可接上高密度的標定物310以提高靈敏度，且多孔性薄膜層220可應用於毛細管或塑膠元件上，以陣列式同時檢測不同待測物600。本發明另外利用金奈米粒子400，可直接以肉眼觀測檢測結果，不需要由特定光學或是電學檢測儀器判讀，為一種可攜式且兼具快速、簡便、使用者介面友善和靈敏度高之比色免疫裝置。

然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

200‧‧‧比色免疫裝置

210‧‧‧基材

220‧‧‧多孔性薄膜層

230‧‧‧液體導流層

310‧‧‧標定物

320‧‧‧牛血清蛋白

330‧‧‧二級抗體

400‧‧‧金奈米粒子

500‧‧‧待測液體

600‧‧‧待測物

700‧‧‧檢測組偶聯物

Claims (20)

1. 一種比色免疫檢測方法，用以檢知一待測物，該比色免疫檢測方法包含下列步驟：在一基材表面以複數個多孔性整體式聚合物聚合形成一多孔性薄膜層，其中該些多孔性整體式聚合物係以甲基丙烯酸縮水甘油酯(glycidyl methacrylate,GMA)為單體、乙二醇二甲基丙烯酯(ethylene glycol dimethacrylate,EDMA)為交聯劑以及甲醇和乙醇為成孔劑，以光聚合方式原位聚合於該基材上；使一標定物吸附於該多孔性薄膜層；將一金奈米粒子與該待測物結合成一偶聯物；將該偶聯物導入該多孔性薄膜層，使該待測物與該標定物專一性地結合，若該偶聯物含有該待測物時該多孔性薄膜層呈現一預定顏色，若該偶聯物不含有該待測物時該多孔性薄膜層則無顏色變化；以及觀察該多孔性薄膜層顏色變化的長度來判讀該待測物濃度。
2. 如請求項1所述之比色免疫檢測方法，其中，該些多孔性整體式聚合物係以重量百分比24之甲基丙烯酸縮水甘油酯為單體、重量百分比16之乙二醇二甲基丙烯酯為交聯劑以及重量百分比30之甲醇和重量百分比30之乙醇為成孔劑，再加入重量百分比1之苯基二甲氧基苯乙酮(2,2-dimethoxy-2-phenylaceto phenone,DMPA)為光起始 劑，以光聚合方式原位聚合於該基材上。
3. 如請求項1所述之比色免疫檢測方法，其中，該標定物吸附於該多孔性薄膜層後，利用一牛血清蛋白或一抗蛋白質吸附溶液來覆蓋非特異性結合位。
4. 如請求項1所述之比色免疫檢測方法，其中，該金奈米粒子的直徑大小為2至100奈米。
5. 如請求項1所述之比色免疫檢測方法，其中，該標定物為一抗原。
6. 如請求項5所述之比色免疫檢測方法，其中，該抗原包含一蛋白質、一多醣類、一醣蛋白和一脂蛋白。
7. 如請求項1所述之比色免疫檢測方法，其中，該待測物為一抗體。
8. 一種比色免疫檢測方法，用以檢知一待測物，該比色免疫檢測方法包含下列步驟：在一基材表面以複數個多孔性整體式聚合物聚合形成一多孔性薄膜層，其中該些多孔性整體式聚合物係以甲基丙烯酸縮水甘油酯為單體、乙二醇二甲基丙烯酯為交聯劑以及甲醇和乙醇為成孔劑，以光聚合方式原位聚合於該基材上； 使一標定物吸附於該多孔性薄膜層；將一金奈米粒子與一二級抗體結合；加入一待測液體，該待測液體具有該待測物，利用該二級抗體與該待測物的專一性地結合，使該金奈米粒子、該二級抗體及該待測物結合成一檢測組偶聯物；將該檢測組偶聯物導入該多孔性薄膜層，使該待測物與該標定物專一性地結合，若該待測液體含有該待測物時該多孔性薄膜層呈現一預定顏色，若該待測液體不含有該待測物時該多孔性薄膜層則無顏色變化；以及觀察該多孔性薄膜層顏色變化的長度來判讀該待測物濃度。
9. 如請求項8所述之比色免疫檢測方法，其中，該些多孔性整體式聚合物係以重量百分比24之甲基丙烯酸縮水甘油酯為單體、重量百分比16之乙二醇二甲基丙烯酯為交聯劑以及重量百分比30之甲醇和重量百分比30之乙醇為成孔劑，再加入重量百分比1之苯基二甲氧基苯乙酮為光起始劑，以光聚合方式原位聚合於該基材上。
10. 如請求項8所述之比色免疫檢測方法，其中，該標定物吸附於該多孔性薄膜層後，利用牛血清蛋白或抗蛋白質吸附溶液來覆蓋非特異性結合位。
11. 如請求項8所述之比色免疫檢測方法，其中，該 金奈米粒子的直徑大小為2至100奈米。
12. 如請求項8所述之比色免疫檢測方法，其中，該標定物為一一級抗體。
13. 如請求項8所述之比色免疫檢測方法，其中，該金奈米粒子與該二級抗體以1：1至1：50之比例混合。
14. 如請求項8所述之比色免疫檢測方法，其中，該待測液體包含一體液和一滲出液。
15. 如請求項8所述之比色免疫檢測方法，其中，該待測物包含一蛋白質、一多醣類、一醣蛋白和一脂蛋白。
16. 一種比色免疫裝置，用以檢測一待測物，該比色免疫裝置包含：至少一金奈米粒子，與該待測物結合成一檢測組偶聯物；一基材，該基材之表面具有一多孔性薄膜層，該多孔性薄膜層係以複數個多孔性整體式聚合物聚合所形成，可使一標定物吸附於該多孔性薄膜層，該標定物可與該待測物專一性地結合，其中該些多孔性整體式聚合物係以甲基丙烯酸縮水甘油酯為單體、乙二醇二甲基丙烯酯為交聯劑以及甲醇和乙醇為成孔劑，以光聚合方式原位聚合於該基 材上；以及一液體導流層，其與該基材貼合且覆於該多孔性薄膜層上方，該液體導流層供該檢測組偶聯物流動於該多孔性薄膜層上，其中，若該檢測組偶聯物具有該待測物，該多孔性薄膜層呈現一預定顏色，若該檢測組偶聯物不具有該待測物，該多孔性薄膜層則無顏色變化，當該待測物濃度越高時該多孔性薄膜層顏色變化的長度越長。
17. 如請求項16所述之比色免疫裝置，其中，該基材可為一毛細管或一塑膠元件。
18. 如請求項16所述之比色免疫裝置，其中，該金奈米粒子的直徑大小為2至100奈米。
19. 如請求項16所述之比色免疫裝置，其中，更包含一掃描機、一有照相功能手機或或一紫外光機用以記錄顏色變化。
20. 如請求項19所述之比色免疫裝置，其中，更包含結合雲端功能記錄以及計算分析結果。