KR101597413B1 - 효소 모방 무기 나노입자를 이용한 고감도 측면유동 면역 발색칩 및 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

효소 모방 무기 나노입자를 이용한 고감도 측면유동 면역 발색칩 및 이를 이용한 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 무기 나노입자의 단백질 효소 유사 촉매활성을 이용하여 측면유동 면역발색칩을 제조하는 방법, 더욱 자세하게는 철산화물 (Fe3O4)과 백금 (Pt, Platinum)의 나노입자에 분석물을 감지할 수 있는 항체를 고정하고, 이를 효소-기질 반응에 적용시켜 발색 시그널을 증폭시키는 방법, 및 이것으로 제조된 측면유동 면역발색칩에 관한 것으로서, 상기 칩을 사용하여 고감도로 성분물질을 검출해 낼 수 있는 바이오칩 제작에 응용될 수 있다.
본 발명에 따른 측면 유동 면역 발색칩은 접합부에 검출 항체가 표지된 효소 모방무기 나노입자가 존재하는 것을 특징으로 한다.

Description

효소 모방 무기 나노입자를 이용한 고감도 측면유동 면역 발색칩 및 이를 이용한 검출 방법{High-sensitive lateral flow immunoassay chip using enzyme-mimetic nanoparticles and Methods sensing using thereof}
본 발명은 무기 나노입자의 단백질 효소 유사 촉매활성을 이용하여 측면유동 면역발색칩을 제조하는 방법, 더욱 자세하게는 철산화물 (Fe3O4)과 백금 (Pt, Platinum), graphene oxide, V2O5 등의 무기 나노입자에 분석물을 감지할 수 있는 항체를 고정하고, 이를 효소-기질 반응에 적용시켜 발색 시그널을 증폭시키는 방법, 및 이것으로 제조된 측면유동 면역발색칩에 관한 것으로서, 상기 칩을 사용하여 고감도로 성분물질을 검출해 낼 수 있는 바이오칩 제작에 응용될 수 있다.
유동 면역발색칩 (Lateral flow immunoassay chip)을 이용한 바이오 에세이는 체액으로부터 간편하고 빠르게 분석물을 검출해낼 수 있는 기술로써 오랜 기간 진단 검사 시장에서 주요한 부분을 차지해 왔다. 발색 물질로 금 나노입자를 표지하는 방법이 가장 널리 쓰이고 있으며, 이는 고유의 플라즈몬 현상에의해 붉은색으로 발색되는 금 나노입자 특성을 이용하여 현장에서 간편하게 육안으로 진단할 수 있게 한 것이다. 하지만 상기 방법의 검출 시스템이 가진 가장 큰 문제점은 분석 감도가 떨어져 주로 체액에 과량 존재하는 분석물에 적용되고 있는 점이다. 소량 검출 영역이 제한되는 단점이 질병의 초기 대응 수단으로써 현 검출 시스템의 응용영역의 확장을 방해하고 있다.
이에 따라, 대한 민국 특허 공개 제 2013-0090174호에서는 표적물질에 결합할 수 있는 반응물질과 흡광물질이 결합된 제1 융합물질이 존재하는 반응부, 표적물질 또는 표적물질과 결합된 반응물질과 결합할 수 있는 검출물질과 형광물질이 결합된 제2 융합물질이 지지체 위에 고정되어 존재하는 측정부를 포함하는 바이오 센서를 공개하고 있다.
또한, 대한민국 특허 공개 제2010-118550호에서는 분석물(analyte)의 제1 에피토프 또는 제1 결합부위(리간드)에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항체 또는 제1 특이적 결합물질이 금 나노입자에 결합되어 있는 접합체와 분석물을 결합하는 단계;
상기 접합체가 결합된 분석물과 상기 분석물의 제2 에피토프 또는 제2 결합부위 (리간드)에 특이적으로 결합하는 고정화된 제2 항체 또는 제2 특이적 결합물질을 결합하는 단계; 및 금 이온 및 환원제를 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 측방유동 (Lateral flow) 분석에서의 신호 증폭 방법을 개시하고 있다.
그러나 이러한 방식은 금 나노입자의 낮은 분석 특성을 향상시키기 위해서 별도의 형광물질이나 시그널 검출용으로 특화된 측정 기기가 필요하다는 단점이 있다.
본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 새로운 무기 나노입자를 이용한 고감도의 측면 유동 면역 발색칩을 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 다른 과제는 신호를 증폭할 수 있는 새로운 고감도의 측면 유동 면역 발색칩을 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 또 다른 과제는 측면 유동 면역 발색칩의 접합부에서 표적물질과 결합하여 반응부로 이동하여 고정되어 검출 신호를 나타내고, 반응부에서 발색기질과 반응하여 신호가 증폭되는 새로운 입자를 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해서, 본 발명에 따른 측면 유동 면역 발색칩은 접합부에 검출 항체를 포함하는 효소 모방 무기 나노입자가 존재하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 일 측면에서, 본 발명에 따른 측면 유동 면역 발색칩은 접합부에 검출 항체가 표지된 효소 모방 무기 나노입자가 존재하고, 상기 단백질 효소 무기 나노입자는 표적물질과 결합하여 반응부에서 고정된 후, 발색기질과 반응하여 검출 신호를 증폭시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 다른 일 측면에서, 본 발명에 따른 효소 모방 무기 나노입자는 표면에 표적물질과 결합할 수 있는 검출항체가 표지되어 있으며, 발색 기질의 산화반응을 촉매하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또 다른 일 측면에서, 접합부에 검출 항체가 표지된 효소 모방 무기 나노입자가 존재하는 측면 유동 면역 발색칩을 이용해서 표적물질을 검출하는 단계;와 효소 모방 무기 나노입자에 의해서 발색 기질을 이용하여 검출 신호를 증폭시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이론적으로 한정된 것은 아니지만, 상기 효소 모방 무기 나노입자들은 접합부에서 표지된 검출항체가 액상 시료에 포함된 표적 물질과 결합하고, 액상시료와 함께 반응부로 이동하여, 반응부의 특정 위치에 고정된 검출물질이 표적물질과 결합함으로서 반응부의 특정 위치에 고정되어 검출 신호를 나타내게 되며, 반응부에 고정된 효소 모방 무기나노입자들이 발색기질을 산화시켜 검출 신호를 증폭시키게 된다. 효소 모방 무기 나노입자들은 기존의 면역분석에서 시그널 증폭법으로 사용되는 효소-기질 반응에서, 기질과 반응할 수 있는 장소가 대부분 가려져 있는 단백질 효소와는 달리 반응 표면이 전체적으로 노출돼 있기 때문에 반응 효율을 훨씬 높아 발색 특성이 현저하게 향상된다. 또한 단백질 효소는 단백질 특성에 의해 주변 환경 (온도, pH 등)에 영향을 많이 받지만 무기 나노입자는 상대적으로 매우 안정적으로 활성을 유지하고 오랜 기간 보존될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 측면 유동 면역 발색칩은 표적 물질을 포함하는 액상 시료가 다공성 매질을 통해 이동하면서 고정된 검출물질과 반응하여 육안으로 식별할 수 있도록 검출시 발색 신호를 나타내는 키트를 의미한다.
본 발명의 실시에 있어서, 상기 측면 유동 면역 발색 칩은 표적물질을 포함하는 시료가 투입되는 샘플부, 검출 항체가 표지된 단분산성 효소 모방 무기 나노입자가 존재하는 접합부(컨쥬게이션 패드), 무기 나노입자가 결합된 표적물질과 결합할 수 있는 검출물질이 고정된 측정부, 오류 확인을 위한 컨트롤부 및 액체 시료를 모세관 현상에 의해 흡수할 수 있는 흡수부를 포함하여 이루어질 수 있다.
상기 측면 유동 면역 발색칩의 분석 키트의 각각 샘플부, 반응부, 측정부, 컨트롤부 및 흡수부는 미세관을 통하여 서로 연결되거나, 또는 멤브레인로 서로 연결되며, 상기 멤브레인은 천연 또는 합성 재료의 다공질 재료일 수 있으며, 니트로셀룰로오스 일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 ‘효소 모방 무기 나노입자’는 단백질효소와 유사하게 다양한 기질의 화학반응을 촉매하는 물질을 의미한다.
상기 용어‘발색 기질’은 상기 효소 모방 나노입자의 촉매 작용에 의해 반응 전 물질과 반응 후 물질의 발색 변화가 일어나는 물질을 의미한다.
상기 용어‘발색 변화’ 또는 ‘증폭’은 색의 발현, 발색 파장 변화, 및 발색 강도 변화 중 하나 이상을 의미하는 것으로 이해된다.
용어 ‘표적물질’은 항원 단백질, 리간드, DNA, 환경 호르몬, 환경 오염 물질, 및 바이러스 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 일 수 있으나, 검출항체와 결합할 수 있는 물질이라면 그 종류는 제한되지 않는다.
상기 용어 "검출항체"란 표적물질과 결합할 수 있는 항체, 항체의 단편인 Fab 또는 항체의 재조합 물질을 의미한다. 결합은 화학적 결합 및 물리적 결합 모두 가능하다.
용어 ‘검출물질’은 표적물질, 또는 표적물질과 결합된 반응물질과 결합할 수 있는 물질을 의미한다. 결합은 화학적 결합 및 물리적 결합 모두 가능하나, 특별한 화학 반응 없이 결합이 이루어질 수 있는 물리적 결합이 바람직하다. 상기 반응물질의 예로는 항체, 항체의 단편인 Fab나 재조합 scFv 등 일 수 있으며, 리셉터 또는 리셉터의 단편일 수 있다.
용어‘효소-기질 반응’이란 효소에 의해서 촉매 작용이 이루어지는 기질의 반응 뿐만아니라, 효소 모방 나노입자에 의해서 촉매 작용이 이루어지는 발색 기질의 반응을 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명에 있어서, 상기 ‘나노입자’(Nanoparticle)는 1000nm미만의 직경을 가지는 나노 단위의 임의 입자를 말한다. 일부 실시예에 있어서, 상기 나노입자는 National Science Foundation에서 정의한 것에 따르면, 나노 입자는 300nm미만의 직경을 가진다. 일부 구체예에서, 나노입자는 National Institutes of Health에서 정의한 것에 따르면 직경이 100nm미만이다. 본 발명의 바람직한 실시에 있어서, 상기 나노입자는 10~90 nm 직경을 가진다.
본 발명에서 무기 나노입자는 무기 성분을 포함하는 나노입자를 의미한다. 상기 무기 물질은 무기, 무기 물질의 산화물, 무기성 복합체, 예를 들어, 금속과 함께 비금속, 세라믹, 플라스틱, 고분자, 생물학적 소재, 반도체, 양자점 들이 복합된 복합 재질일 수 있으며, 상기 복합 재질이라 함은 예를 들어, 내부는 세라믹이나 고분자와 같은 비금속 재질의 핵제가 들어 있으며, 외부는 무기 물질로 코팅된 입자일 수 있으며, 무기 입자의 표면이 반응성 관능기나 분자체 등이 존재할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 효소 모방 무기 나노입자는 발색기질을 산화시킬 수 있는 무기 나노입자로서, 바람직하게는 철산화물 (Fe3O4), 백금 (Pt, Platinum), graphene oxide, V2O5, 이들의 혼합물 또는 합금 등으로 이루어진 입자이다.
본 발명에 있어서, 발색기질은 효소 모방 무기 나노입자가 산화촉매로 작용하여 산화 후 무기 나노입자가 존재하는 위치에서 침전 및 불용화되면서 발색하여, 검출신호를 육안으로 인식할 수 있을 정도로 증폭시키게 된다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 발색기질은 과산화 효소 모방 무기 나노입자일 경우, 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 무기 나노입자의 표면에는 검출 항체를 고정시킬 수 있는 기능기들이 존재할 수 있다. 상기 무기 나노입자의 표면에 존재하는 기능기는 검출 항체의 고정 수단으로써 공유결합 또는 이온성의 전기적 인력을 제공할 수 있는 카르복실산기 (Carboxylic acid group)인 것이 바람직하다. 이 경우 IgG 항체에 풍부하게 존재하는 아민기 (-NH2, amine group)를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 무기 나노 입자는 액상에 포함되어 수 마이크로미터 직경의 모세관로를 통해서 측면 유동 면역 발색칩의 접합부로 이동할 수 있도록 단분산된 나노입자인 것이 바람직하다.
상기 단분산성이라 함은 나노입자의 크기와 구조가 균일한 정도를 나타내는 척도로서, 실질적으로 균일한 것을 의미한다.
상기 단분산성 무기 나노입자의 제조 방법은 본 발명에서 전체로 참고문헌으로 도입된 문헌[(J. Am. Chem. Soc., Shouheng Sun 외, 단분산성의 MFe2O4 (M = Fe, Co, Mn) 나노입자 : 2004, Vol.126, 273-279 쪽]을 이용해서 제조할 수 있다.
본 발명의 실시에 있어서, 상기 단분산성 무기 나노입자의 합성은 유기용매 내에서 계면활성제를 이용하여 단분산성을 향상시킨 합성법을 이용하여 제조될 수 있다.
검출 항체를 무기 나노입자 표면에 고정시킨 후 수크로오즈와 소혈청알부민이 포함된 생리식염수에 분산시켜 유리 섬유로 이루어진 접합부에 고르게 흡수시켜 건조시켰다. 유리섬유는 단백질에 대해서 친화능력이 낮기 때문에 건조된 상태의 항체-무기 나노입자는 유리섬유 속에서 분석물의 유체를 만났을 때 수화된 후 쉽게 테스트 패드로 빠져나갈 수 있다.
분석물의 검출을 위하여 분석물이 함유된 체액을 측면유동 면역발색칩에 흘려주고 침전성의 불용 기질을 사용하여 효소-기질 반응을 보내주면 발색 시그널이 증폭되면서 성공적으로 검출 감도를 향상시킬 수 있다.???
본 발명에서 제공하는 고감도의 측면유동 면역 발색칩은 효소-기질 반응을 통한 시그널 증폭법이 적용된 것이며, 산화되어 침전을 형성하는 발색 기질은 증폭된 시그널을 간편하게 현장에서 육안으로 관찰 가능하게 한다.
또한 효소 모방 무기 나노입자를 사용했기 때문에 이는 기존에 사용되어온 단백질로 구성된 효소에 비해 안정적인 검출 시스템으로 보존될 수 있다. 상기 특징들은 고감도로 체액으로부터 소량의 분석물을 검출해낼 수 있게 함으로써 급성발병질환이나 암질환의 조기 진단과 초기 대응을 가능하게 하고, 안정적으로 검출시스템이 보존되기 때문에 내전지역이나 재난지역에 구호물품으로 제공될 진단 도구에 적용될 수 있다.
도 1은 무기 나노입자를 함유한 측면유동 면역발색칩의 제조 및 효소-기질 반응을 기반으로 한 분석물 검출법 (가) 합성된 무기 나노입자에 항체가 부착되는 과정 (나) 측면유동 면역발색칩을 사용한 분석물의 검출 및 효소-기질 반응에 의한 발색 시그널 증폭법
?도 2는 무기 나노입자를 함유한 측면유동 면역발색칩의 분석물 검출 기능 검증 (가) 기능이 부여되지 않은 순수한 마우스 IgG 항체가 고정된 나노입자를 이용한 측면유동 면역발색 에세이 모식도 (나) AEC와 DAB 두가지 기질을 사용한 무기 나노입자와의 반응 적합성 테스트
도 3은 hCG를 사용한 검출 감도 테스트 (가) 효소-기질 반응으로 시간에 따라 증폭되는 발색 시그널 이미지(나) hCG 농도에 따른 표준 곡선 (다) 효소-기질 반응 시간에 따라 증폭되는 값에 따른 표준 곡선
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 발명을 예시하기 위한 것이며, 어떤 경우에도 발명을 한정하기 위한 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1. 무기 나노입자 합성과 표면 항체 고정법
1-1 무기 나노입자의 합성
철 산화물 나노입자는 공침방법을 이용해 합성하였다. 합성 방법을 요약하면, 0.4 g의 ferrous chloride와 1.1 g의 ferric chloride를 20 mL의 증류수에 넣고, 아르곤 가스를 흘려주며 80 °C까지 올려주었다. 80 °C 에서 28%의 ammonium hydroxide solution을 5 mL 넣고 한 시간 반응시킨 후 상온으로 식혀주었다. 그 후, 자석을 이용해 에탄올과 증류수로 5회 깨끗이 씻어 주었다.
백금 나노입자는 기존의 시드-성장에 의한 합성방법을 수정하여 합성하였다. 주요 내용을 간략히 요약하면 다음과 같다. 0.2%의 chloroplatinic acid hexahydrate 18 mL를 232 mL의 끓는 물에 넣고 1분 후에 1%의 sodium citrate와 0.05%의 citric acid를 5.5 mL 넣었다. 30초 후에, 0.08%의 신선한 sodium borohydrate 와 1%의 sodium citrate, 0.05%의 citric acid가 포함된 용액 2.75 mL를 넣어주었다. 반응을 10분 진행시킨 후, 얻어진 5 nm의 백금 나노입자시드를 이용해 백금 나노입자를 합성하였다. 위의 시드용액 10 mL와 증류수 90 mL를 섞은 후 0.4 M chloroplatinic acid hexahydrate 0.05 mL (30 nm 는 0.5 mL를 넣어줌)와 sodium citrate 1%, L-ascorbic acid 1.25%의 0.5 mL 를 넣어 10 °C/분으로 끓는점까지 올리고 30분동안 유지하고 식힌 후, 원심분리기로 20 분 동안 입자를 가라앉힌 후 (8000 rpm) 에탄올과 증류수로 3회 깨끗이 씻어 주었다.
1-2 무기 나노입자의 검출 항체 표지법
수계로 옮겨온 단분산성의 무기 나노입자에 검출 항체를 고정시키기 위해서 두 재료를 1:1의 비율 (최종 0.5 mg/mL의 농도)로 물에서 섞어주었다. 두 물질이 물에서 잘 분산돼 있도록 해준 뒤 24 시간 4°C에서 고정반응을 실시하였다. (도 1. (가)) 반응 후 무기 나노입자 표면에 붙지 못한 항체들을 원심분리기 (14,000 rpm, 15 분, 4°C)를 사용하여 제거해 준 뒤 생리식염수에 검출항체가 표지된 무기 나노입자를 보관하였다.
실시예 2. 측면유동 면역발색칩의 조립
2-1 검출 항체가 표지된 무기 나노입자의 저장 및 조립
측면유동 면역발색칩에서 샘플 패드 다음에 위치하고 있는 접합부에 실시예 1-2를 통해 완성된 검출 항체가 표지된 무기 나노입자를 건조 및 저장 하였다. (도 1 (나) step 1) 접합부는 유리섬유로 이루어져 있는데, 이는 단백질과 호환성이 좋지 않기 때문에 샘플 패드로부터 유체가 흘러들어왔을 때 접합부 내에서 건조 돼 있던 검출 시약은 수화되면서 쉽게 테스트 패드쪽으로 빠져나갈 수 있다. 수화 능력을 향상시키기 위해 당성분인 수크로오스를 10 wt% 첨가하고 비특이적 반응을 줄이기 위한 소혈청알부민이 3 wt% 포함된 생리식염수 용액 에 검출 항체가 표지된 무기 나노입자를 1 mg/mL의 농도로 고르게 분산시켜 유리패드로 옮겨주었다. 총 8 μg 의 나노입자가 하나의 칩 속에 저장되며, 샘플은 이것과 모두 반응하여 검출된다. 무기 나노입자를 용액형태로 저장한 유리패드를 진공 환경에서 충분히 건조 시켜준 뒤, 이를 샘플 패드와 테스트 패드 사이에 위치시켜 칩을 완성하였다.
실시예 3. 무기 나노입자를 함유한 측면유동 면역발색칩의 분석물 검출 기능 검증
3-1 항 마우스 항체 구간을 이용한 검출 항체의 고정 상태 확인
무기 나노입자 표면의 카르복실기와 반응하여 고정됐을 검출 항체의 상태를 확인하기 위해서 측면유동 면역발색칩의 컨트롤부에 위치해 있는 항 마우스 항체 구간을 이용해 테스트를 진행했다. (도 2. (가)) 기능이 부여되지 않은 순수 마우스 IgG 단백질을 사용해서 무기 나노표면에 실시예 1-2 방법으로 고정시키고, 실시예 2-1의 방법으로 칩에 내장시킨 뒤 도 1. (나)의 step 2 와 같이 100 μL의 생리 식염수를 샘플 패드를 통해 흘려주었다. 그 결과 도 2. (나)에서 기질 처리전의 이미지가 보여주는 것과 같이 컨트롤부에서 항 마우스 항체에 마우스 IgG가 잡혀서 발색된 시그널이 육안으로 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 항체가 표지된 무기 나노입자가 함께 잡힌 것이기 때문에 발색 시그널은 무기 나노입자 고유의 색으로 나타난다.
3-2 무기 나노입자와 반응 가능한 기질의 선택
본 발명자의 측면유동 면역발색칩에 적용될 기질은 효소와 반응해서 침전을 형성하며 발색할 수 있는 것이어야 한다. 대표적으로 과산화효소와 반응해서 침전 발색하는 기질로 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) 와 3,3′-Diaminobenzidine (DAB)가 있다. AEC는 산화되기 전에 노란색을 띠고 있다가 반응 후 붉은 색으로 변하는 성질을 가진 기질이다. DAB는 산화되기 전에 오렌지색을 띠고 있다가 반응 후 갈색으로 변하는 성질을 가진 기질이다. 우선 실시예 3-1의 방법으로 마우스 IgG에 의해 무기 나노입자가 칩 위의 컨트롤부에 위치할 수 있도록 해 두고 순차적으로 상기 두 종류의 기질을 100 μL씩 처리해 주었다. 그 결과 본 발명자가 개발한 무기 나노입자와 반응하는 기질은 AEC로서 도 2. (나)에서 보여 지는 것처럼 기질 처리 후 컨트롤부가 붉게 발색 되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 융모성 성선자극호르몬 (human chorionic gonadotropin, hCG) 분석물을 사용한 측면유동 면역발색칩의 감도 측정
4-1 항 hCG 항체의 고정
합성 후 수분산 된 백금나노입자 (30 nm) 표면에 hCG를 검출할 수 있는 검출 항체 (detection antibody) 를 고정시키기 위해서 두 물질간의 이차 결합을 매개로한 고정법을 선택하여 적용시켰다. 최종적으로 합성된 뒤 물 (deionized water)에 분산돼 있는 백금나노입자 (0.5 mg/mL)에 검출항체인 β-hCG 단일항체를 0.1 mg/mL의 농도로 넣어서 잘 섞어 주고 24시간 동안 4 °C에서 로테이터에 장착하여 반응을 보내주었다. 반응 후에 생리식염수로 두 번 씻어 주고 (14,000 rpm. 15분, 4 °C), 최종적으로 항체가 고정된 백금나노입자를 1 mg/mL의 농도로 접합부 저장 용액 (10 wt% sucrose, 0.1 wt% Tween 20, 3 wt% BSA, PBS) 나 보존 용액 (1% BSA, PBS)에 보관하였다.
4-2 효소-기질 반응을 이용한 hCG의 검출
실시예 4-1로 완성된 hCG 검출용 측면유동 면역발색칩을 사용하여 무기 나노입자와 AEC의 효소-기질 반응으로 증폭된 검출 감도를 측정하였다. 상용화된 hCG 검출용 dip-stick은 25 mIU/mL (3.7 ng/mL) 의 감도를 가지고 있다. 이것을 참고하여 hCG의 농도를 11.1~0.41 ng/mL 의 범위로 정하였고, 상기 범위 내에서 검출 표준 곡선을 그려보았다. 확인된 농도의 hCG를 생리식염수에 섞어서 샘플 패드로 흘려주었고 약 10 분의 시간동안 테스트 패드를 흐르게 하여 검출부의capture antibody에 포획될 수 있게 하였다. 기질과 반응할 수 있는 환경을 조성하기 위해 pH 4.5의 sodium acetate 용액을 사용하여 테스트 패드를 충분히 씻어 주었고, 패드가 마르지 않도록 하여 검출부와 컨트롤부 쪽에 AEC 기질 용액을 100 μL떨어뜨려 효소-기질 반응이 일어나도록 해 주었다. 그 결과 시간이 지남에 따라 컨트롤 라인과 테스트 라인에서는 효소-기질 반응의 결과로 붉은색의 시그널이 관찰되었다. 1.23 ng/mL 의 농도 이하 에서는 기질과 반응 전에 무기 나노입자만의 발색현상은 보이지 않다가 기질 처리 후 시간이 지남에 따라 발색 시그널이 증폭되어 점점 붉은색으로 띠가 나타나는 것이 관찰되었다. hCG가 없는 생리식염수 (0 ng/mL)만 흘려준 경우에 시간이 지나도 테스트 라인쪽의 붉은색이 발색되지 않음을 미루어 도 3. (가)에서 보여 지는 발색 시그널은 모두 분명한 hCG 검출 값임을 확인할 수 있었다. 도 3. (나)는 이미지 분석으로 검출부의 발색값을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. hCG 농도에 따른 표준 곡선 값은 각각의 칩에서 나오는 검출부의 시그널 값을 컨트롤부의 시그널 값으로 나눠준 비율로 정의하였다. 도 3. (다)는 기질과 반응시간을 늘려줄수록 검출값의 시그널 세기는 증가되는 현상을 보여주고 있다.

Claims (20)

  1. 표적 물질을 포함하는 시료가 투입되는 샘플부,
    표적 물질과 결합할 수 있는 검출 항체를 포함하는 효소 모방 무기 나노 입자가 존재하는 접합부, 여기서, 상기 무기 나노 입자는 발색 기질을 산화시키는 금속 나노 입자이며; 및
    상기 금속 나노 입자에 결합된 표적물질과 결합되는 검출 항체가 고정된 검출부를 포함하고, 상기 발색 기질의 산화에 의해서 검출부의 색상 변화가 육안으로 관측되는 것을 특징으로 하는 측면 유동 면역 발색칩.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 무기 나노입자는 단분산성 무기 나노입자인 것을 특징으로 하는 측면 유동 면역 발색칩.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 무기 나노입자는 산화철, 백금을 포함하는 것을 특징으로 하는 측면 유동 면역 발색칩.
  5. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 검출항체는 무기 나노 입자의 표면에 존재하는 카르복실기와 반응하여 무기 나노 입자에 결합된 것을 특징으로 하는 측면 유동 면역 발색칩.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 효소 모방 무기 나노입자는 발색 기질을 침전 및 불용화시키는 것을 특징으로 하는 측면 유동 면역 발색칩.
  9. 제8항에 있어서, 상기 발색기질은 3-아미노-9-에틸카바졸
    (3-amino-9-ethylcarbazole) 인 것을 특징으로 하는 측면 유동 면역 발색칩.
  10. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 측면 유동 면역 발색칩은 오류 확인을 위한 컨트롤부를 포함하는 것을 특징으로 하는 측면 유동 면역 발색칩.
  11. 제1항 또는 제3항에 따른 측면 유동 면역 발색 칩을 이용하여 표적물질을 검출하는 단계;와 발색기질을 효소 모방 무기 나노입자로 반응시켜 검출 신호를 증폭시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출 방법.
  12. 발색 기질을 산화시키는 금속 나노 입자의 표면에 표적 물질과 결합할 수 있는 검출 항체가 표지되고, 상기 표적 물질은 검출부에 고정된 검출 항체에 고정되고, 발색 기질의 산화에 의해서 육안상 검출부의 색상의 변하는 것을 특징으로 하는 효소 모방 무기 나노 입자.
  13. 제12항에 있어서, 상기 무기 나노 입자는 철산화물, 백금 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 효소 모방 무기 나노입자.
  14. 제12항에 있어서, 상기 검출항체는 무기 나노입자에 물리적 결합에 의해 표지된 것을 특징으로 하는 효소 모방 무기 나노입자.
  15. 제12항에 있어서, 상기 무기 나노입자는 단분산성 무기 나노입자인 것을 특징으로 하는 효소 모방 나노입자.
  16. 제12항에 있어서, 상기 발색기질을 침전 및 불용화시키는 것을 특징으로 하는 효소 모방 무기 나노입자.
  17. 분산성의 효소 모방 무기 나노입자를 합성하는 단계;
    상기 무기 나노입자에 검출 항체를 표지하는 단계; 및
    상기 검출항체가 표지된 무기 나노입자를 측면유동 발색칩의 접합부에 위치시키는 단계; 를 포함하고,
    여기서, 효소 모방 무기 나노 입자는 발색 기질을 산화시키는 금속 나노 입자의 표면에 표적 물질과 결합할 수 있는 검출 항체가 표지되고, 상기 표적 물질은 검출부에 고정된 검출 항체에 고정되고, 상기 발색 기질의 산화에 의해서 육안상 검출부의 색상의 변하는 나노 입자인 것을 특징으로 하는 측면 유동 면역 발색칩의 제조 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 무기 나노입자는 산화철과 백금을 사용하여 합성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 무기 나노입자는 유기용매환경에서 계면활성제를 사용하여 크기가 균일하게 조절되어 단분산성으로 합성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 17항에 있어서, 상기 무기 나노입자는 무기 나노입자의 표면을 카르복실산기로 치환하고, 치환된 무기 나노입자와 검출 항체를 생리식염수에 고르게 분산시켜 고정시키는 것을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10596632B2 (en) * 2015-12-15 2020-03-24 Fondazione Istituto Italiano Di Tecnologia Method for the synthesis of metal nanoparticles in aqueous environment without the use of shape directing agents
KR20180049602A (ko) * 2016-11-03 2018-05-11 (의료)길의료재단 효소 모방 나노자임에 기반한 면역학적 분석에 의한 IgE 검출 및 알러지 진단법
KR102064961B1 (ko) * 2017-12-13 2020-01-10 주식회사 포스코 자성 나노입자 및 이를 이용한 측방유동 분석에서의 신호 증폭 방법
KR102070794B1 (ko) * 2019-01-21 2020-01-29 (의료)길의료재단 효소 모방 나노자임에 기반한 면역학적 분석에 의한 IgE 검출 및 알러지 진단법
KR102332618B1 (ko) * 2019-12-17 2021-11-30 한양대학교 에리카산학협력단 성게 모양 백금 나노입자를 이용한 당화알부민의 고감도 측정방법
CA3196874A1 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Henry Hongjun Ji Lateral flow devices for high sensitivity detection of coronavirus infection, and methods of making and using the same
CN114441779B (zh) * 2022-02-14 2023-05-16 上海交通大学 一种针对胃泌素17的双模态免疫层析试剂盒及其检测方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101350722B1 (ko) * 2012-01-09 2014-01-16 한국세라믹기술원 효소 모방 자성나노촉매의 합성방법 및 그에 의하여 합성된 효소 모방 자성나노촉매

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Enhanced lateral flow immunoassay using gold nanoparticles loaded with enzymes (Biosensors and Bioelectronics, Vol. 40, (2013), pp 412-416.)
Ultrasensitive nucleic acid biosensor based on enzyme-gold nanoparticle dual label and lateral flow strip biosensor (Biosensors and Bioelectronics, Vol. 26, (2011), pp 2018-2024.)
Ultratrace detection of C-reactive protein by a piezoelectric immunosensor based on Fe203 SiO2 magnetic capture nanoprobes and HRP-antibody co-immobilized nano gold as signal tags (Sensors and Actuato*

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