KR101062183B1 - 단백질 정량 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질 정량 방법에 관한 것이다. 본 발명의 단백질 정량 방법은 (S1) 금 나노입자에 단클론 PSA 항체를 고정화하여 금 나노프루브를 만들고, 자기성 마이크로비드에 다클론 PSA 항체를 고정화한 후, 상기 금 나노프루브와 자기성 마이크로비드를 PSA-ACT 항원과 용액상에서 반응시키는 단계; (S2) 상기 용액에서 상기 금 나노프루브와 자기성 마이크로비드를 분리한 후, 상기 금 나노루브와 자기성 마이크로비드를 용리시키는 단계; (S3) 상기 용액에서 상기 자기성 마이크로비드를 분리하고, 분리된 상기 금 나노프루브에 AA 및 CTAB를 첨가하여 상기 금 나노프루브를 성장시키는 단계; 및 (S4) 상기 (S3) 단계에서 성장된 금 나노프루브의 양을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 단백질 정량 방법은 금나노입자와 자기성 마이크로 비드를 결합한 샌드위치 기법을 사용함으로써 저렴한 비용으로 간편하게 표적단백질을 분석할 수 있어, 극미량의 단백질을 분석해야 하는 질병진단센서, 프로테오믹스 연구 등에 다양하게 적용될 수 있다.
단백질, 정량 방법, 금 나노프루브, 마이크로 비드, PSA-ACT

Description

단백질 정량 방법{QUANTITATIVE ANALYSIS METHOD OF PROTEIN}
본 발명은 용액상에서 자성의 마이크로비드와 금나노프루브의 성장을 이용한 단백질 정량 분석법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 전립선암의 지표물질인 PSA (Prostate specific antigen)를 금나노프루브와 자기성 마이크로비드를 이용하여 분리한 후 금 결정성장법에 의해 단백질을 정량하는 방법에 관한 것이다.
특정한 단백질의 정량 분석 방법은 효소면역 측정법(Enzyme Immunoassay, EI), ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 및 방사면역 측정법(Radioimmunoassay, RIA) 등이 있다. 이 중에서도 ELISA 법은 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 반응을 확인하는 방법으로, 그 방법이 간단하고 비용이 많이 들지 않으며 다량 분석이 가능하여 현재 가장 널리 쓰이고 있는 분석 방법의 하나가 되고 있다. 특히, 이 방법은 방사능면역시험법과 같이 매우 민감한 반응이면서도 방사능면역시험법에서 처럼 방사능을 사용하지 않는다는 잇점이 있어서 그 사용이 증가되고 있는 방법이다. 하지만 이 방법은 분석 시 많은 시료량을 요구하며, 시간 이 오래 걸리고, 여러 단계의 지루한 과정을 거쳐야 한다는 단점이 있다. 또한 가장 민감도(sensitivity)가 높은 방사면역 측정법의 경우 방사능 물질에 의한 위험이 문제가 된다.
최근, 금 나노입자가 그 생체 적합성과 특별한 성질 때문에 다양한 바이오센싱 시스템의 제작에 이용되고 있다. 금 나노입자는 항원이나 항체에 결합되어, 광학적 및 전기화학적 표지나 표면 플라즈몬 증폭 등에 이용될 수 있다. 입자의 성장을 위한 촉매 프루브로써 금 나노입자는 그 성장을 통해 생체인식 신호를 전달해줄 수 있어, 바이오센싱을 하는데 있어 큰 장점을 갖는다. 보통 센싱 신호는 금 나노입자에 의해 촉매된 은의 환원으로 강하게 증폭될 수 있다.
소위 은 염색 방법은 수많은 칩 기반 바이오센싱 플랫폼에서 색깔, 전도도, 빛 스캐터링 등에 의해 적절히 신호를 읽을 수 있도록 제공되었다. 그러나, 이러한 방법은 글래스칩이나 니트로셀룰로즈 띠에서 눈으로 직접 그 반응을 확인할 수 있지만, 형광이나 색깔, 방사선 방법에 비해 민감도가 훨씬 떨어진다. 후에 몇몇 연구팀에서 HAuCl4와 은 염색 용액을 대신한 환원제와의 혼합물을 이용한 금성장법으로 IgG 검출을 시도했을 때, 은 염색 방법보다 민감도를 훨씬 증가시킬 수 있었다. 이러한 금 성장방법을 이용했을 때 IgG 검출 농도는 10 pg/ml로서, 이는 정상적인 형광이나 색도 분석 기술의 민감도와 비슷한 수준을 보여주었다. 또한 금 성장법은 앱타머로 기능화된 금 나노입자를 이용하여 고체 기질에서 트롬빈(thrombin)의 광학 검출을 위한 증폭제로도 사용될 수 있다.
또 다른 연구팀에서는 금 나노입자 프루브로 증폭된 은의 빛 산란을 이용하여 핵산을 검출하는 기술을 개발하였다. 그들은 이러한 방법으로 10 fM의 핵산을 검출함으로써 매우 빠르고, 간단하고, 민감도가 높은 검출법을 제공하였다. 그러나 이 방법은 단백질과 단백질 상호작용을 모니터링하기 위해 사용되지는 못하였다.
명백하게 금 면역 프루브를 활용한 액체 기반 검출법은 칩 기반플랫폼에서 몇 가지의 놀라운 장점을 제공한다. 첫번째로, 금 프루브가 용액에서 볼륨대 표면적이 넓기 때문에 금 프루브에 표적 분석 대상물(analyte)의 접근성을 높게 해준다. 둘째로, 샌드위치 기법에서 자기성의 마이크로프루브의 유용한 장점을 활용할 수 있게 해준다. 자기성의 마이크로프루브는 외부의 전자기적 힘에 의해 쉽게 유도될 수 있기 때문에 필요할 때 적절히 이용하여 단백질의 농축, 분리, 정제 등을 간단하게 할 수 있다. 세번째로, 색조를 띈 용액을 이용한 검출의 균일성은 분광학적 분석을 할 때 더 높은 적합성을 제공한다. 마지막으로 오염에 의한 환원 위험이 적고, 실시간 모니터링이 가능하여 균일 검출을 할 수 있다는 장점이 있다.
이에 본 발명자들은 샌드위치 기법을 기반으로 표적 단백질 바이오마커를 정량화하기 위해 자기성 마이크로비드 입자와 금 나노결정 성장법을 결합한 방법인 새로운 균일상 검출법을 통하여, 극미량의 농도 및 다양한 농도의 생체분자 분석이 가능하게 함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 샌드위치 기법을 기반으로 표적 단백질 바이오마커를 정량화하기 위해 자기성 마이크로비드 입자와 금 나노결정 성장법을 결합한 방법인 새로운 균일상 검출법을 통하여, 극미량의 농도 및 다양한 농도의 생체분자를 정량할 수 있는 생체분자 정량 방법을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은, (S1) 금 나노입자에 단클론 PSA(Prostate specific antigen) 항체를 고정화하여 금 나노프루브를 만들고, 자기성 마이크로비드에 다클론 PSA 항체를 고정화한 후, 상기 금 나노프루브와 자기성 마이크로비드를 PSA-ACT(Prostate specific antigen-α1-antichymotrypsin)항원과 용액상에서 반응시키는 단계; (S2) 상기 용액에서 상기 금 나노프루브와 자기성 마이크로비드를 분리한 후, 상기 금 나노프루브와 자기성 마이크로비드를 용리시키는 단계; (S3) 상기 용액에서 자기성 마이크로비드를 분리하고, 분리된 금 나노프루브에 AA(ascorbic acid) 및 CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)를 첨가하여 금 나노프루브를 성장시키는 단계; 및 (S4) 상기 (S3) 단계에서 성장된 금 나노프루브의 양을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 정량 방법을 제공한다.
상기 금 나노프루브를 고정화하는 PSA 항체는 단클론 PSA 항체로 하고, 상기 자기성 마이크로비드를 고정화하는 PSA 항체는 다클론 PSA 항체로 하는 것이 더욱 효율적이다.
상기 자기성 마이크로비드로는 자기성을 갖는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 은, 팔라듐, 플래티늄을 포함한 다양한 금속, 마그네슘 옥사이드, 인듐 옥사이드를 포함한 다양한 금속산화물, 실리콘 옥사이드, 글래스 비드 등이 사용될 수 있다.
금 나노프루브에 단클론 PSA 항체를 고정화하는 방법은 물리적 흡착법이 사용될 수 있다.
상기 (S3) 단계에서 상기 금 나노프루브에 AA 및 CTAB를 첨가하여 상기 금 나노프루브를 성장시키는 반응은 5 내지 60 분 동안 이루어지는 것이 바람직하다. 성장 반응 시간이 지나치게 짧을 경우 성장이 일어나지 않아 면역반응이 일어났는지 판단하기가 어려우며, 성장 반응 시간이 지나치게 길 경우 분석 시간이 길어져 바람직하지 못하다.
검출되는 PSA-ACT의 농도가 제한되는 것은 아니나, 1 pg/ml~100ng/ml의 농도에서 PSA-ACT의 검출이 효과적으로 이루어질 수 있다.
상기 단백질 정량 방법은 PSA-ACT 외에도 다양한 다른 질병진단지표 단백질의 검출에도 활용될 수 있는데, 이러한 질병진단지표 단백질의 예로 위암의 진단지표 물질인 CEA나 췌장 진단물질인 CA 19-9가 대표적이다.
이와 같은 질병진단지표 단백질의 정량 방법은, (S1) 금 나노입자에 질병진단지표 단백질 항체를 고정화하여 금 나노프루브를 만들고, 자기성 마이크로비드에 질병진단지표 단백질 항체를 고정화한 후, 상기 금 나노프루브와 자기성 마이크로비드를 질병진단지표 단백질 항원과 용액상에서 반응시키는 단계; (S2) 상기 용액에서 상기 금 나노프루브와 자기성 마이크로비드를 분리한 후, 상기 금 나노프루브와 자기성 마이크로비드를 용리시키는 단계; (S3) 상기 용액에서 자기성 마이크로 비드를 분리하고, 분리된 금 나노프루브에 AA 및 CTAB를 첨가하여 금 나노프루브를 성장시키는 단계; 및 (S4) 상기 (S3) 단계에서 성장된 금 나노프루브의 양을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 단백질 정량 방법은 금 이외의 다른 금속 입자를 이용하여 단백질을 검출할 수 있는데, 이러한 금속으로는 대표적으로 은, 백금, 구리 등이 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 용액상에서 자성의 마이크로비드와 금 나노프로브의 균일 성장을 이용한 단백질 정량 분석법에 관한 것으로, 극미량의 항원 단백질의 정량을 가능하게 하여 의료용 진단 센서로 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1에서 보여준 것처럼 금나노입자를 NaBH4와 HAuCl4의 환원에 의해 제조한 후 모노클로날 PSA 항체를 금 나노입자에 물리적 흡착으로 고정화하고, 에폭시(epoxy) 기가 덮여있는 자기성 마이크로비드에 폴리클로날 PSA 항체를 공유결합으로 고정화한 후, 표적단백질은 PSA-ACT 단백질을 넣고 샌드위치 형식으로 면역반응 시킨다. 그리고 나서 샌드위치 된 금나노프루브와 자기성 마이크로비드를 자석을 이용하여 분리해낸다. 그리고 50mM NaCl/1M NaOH 혼합 용액을 넣고 모노클로날 PSA 항체로 개질된 금 나노프루브와 자기성 마이크로비드를 용리시킨 후 다시 자석으로 마이크로 비드를 분리한다. 그 후 남아 있는 금 나노프루브를 CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)와 AA(ascorbic acid)를 넣고 성장시킨다. 이 단계에서 모노클로날 PSA 항체로 개질된 금나노프루브는 AA의 환원으로부터 생산된 전자를 Au 이온에 전달하는 자기촉매로서 행동하며 금결정 성장을 위해 금 입자 표면에 Au 이온이 적층되도록 촉매 한다. 이 때 CTAB와 AA는 금성장방법으로 널리 사용된다. AA는 하기 화학식 1에서와 같이 금 나노입자의 작은 표면에서 CTAB-Au3+ 복합체를 Au+로 그리고 Au0로 연속적으로 환원할 수 있다. 이 때 금 프루브는 입자의 성장을 위한 핵과 촉매로서 작용하고, CTAB는 계면활성제를 안정화하는 역할을 수행한다.
[화학식 1]
Figure 112008027506462-pat00001
이러한 성장 프로세스는 금 이온과 수화된 전자들이 다 소모될 때까지 계속된다. 이렇게 성장된 금 입자들은 UV-Vis 스펙트로포토미터(UV-Vis spectrophotometer)로 확연히 분석이 가능하며, 심지어는 눈으로도 색깔 변화를 관찰할 수 있다.
도 2는 모노클로날 PSA 항체가 결합된 금 프루브 분리 후, CTAB와 AA를 넣고 2분 마다 금나노입자의 성장 과정을 UV-Vis 스펙트럼 분석한 결과이다. 그 결과 시간이 지날수록 흡광도가 증가하고 각 시간대별로 최대파장(λmax)이 529 nm까지 증 가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 금 나노입자의 크기가 증가했기 때문이다. 이러한 금 나노입자의 성장 형태는 도 3인 TEM 사진을 통하여 확인할 수 있다. 도 3의 A는 나노프루브를 분리했을 때의 모습으로 그 평균 크기가 약 5 nm 이고, 도 3의 B는 CTAB와 AA를 넣고 성장을 시켜 그 크기와 모양이 변형된 것을 보여준다.
한편, 도 4를 통해 금나노프루브의 농도에 따라 UV-Vis 스펙트럼 흡광도가 다른 것을 확인할 수 있었다. 이러한 스펙트럼이나 색깔 변화는 분리된 금 프루브의 양에 따라 차이가 있기 때문에 표적 단백질인 PSA의 농도에 따라 분리된 금 나노프루브의 양이 달라져 단백질의 정량을 가능하게 한다. 그리고 실제 PSA-ACT 복합체를 위와 같은 방법으로 농도에 따라 검출하였다. 도 5에 나타난 바와 같이 1 pg/ml부터 100 ng/ml까지 농도에 따라 검출해 낼 수 있었다
따라서, 본 발명의 단백질 정량 방법은 샌드위치 기법을 기반으로 표적 단백질 바이오마커를 정량화하기 위해 자기성 마이크로비드 입자와 금 나노결정 성장법을 결합한 새로운 검출법을 통하여, 극미량의 농도 및 다양한 농도의 생체분자 분석을 가능하게 하여, 금 프루브의 성장을 기반으로 한 질병진단용 센서로 활용될 수 있는 분석 방법이다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 단백질 정량 방법은 금나노입자와 자기성 마이크로 비드를 결합한 샌드위치 기법을 사용함으로써 간편하고, 값싸게 표적단백질을 분석할 수 있어, 극미량의 단백질을 분석해야 하는 질병진단센서, 프로 테오믹스 연구 등에 다양하게 적용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
< 실시예 > 금나노프루브와 자기성 마이크로비드를 이용한 전립선암 바이오마커 PSA-ACT 검출 및 정량
1) 금 나노프루브 제조
만들어진 5-6 nm 크기의 금 나노입자 용액에 0.1 M K2CO3를 이용하여 pH 9로 적정하였다. 그리고 금나노입자 용액 400 μl에 PSA 모노클로날 항체(1 mg/ml)를 50 μl 넣고 혼합한 후, 상온에서 20분 동안 배양한다. 그리고나서 10% NaCl 400 μl를 넣고 빠르게 혼합하였다. 이때 만약 단백질이 금 나노입자 표면에 흡착되지 않고 안정화되지 않는다면, 금 입자들의 뭉침현상이 발생하며 금 나노입자 용액의 색도 붉은색에서 밝은 파랑색으로 변하게 된다. 이러한 뭉침 현상을 방지하기 위한 최소한의 단백질 농도가 이용된다. 그리고나서 나노프루브의 뭉침 현상과 비특이적 흡착을 막기 위해 10% BSA와 1% tween 20을 넣고, 공극 크기가 0.45μm 인 필터로 걸러낸다. 그리고 걸러진 용액을 15000g, 1시간 동안 원심분리하여 금 나노입자에 흡착되지 못한 PSA 모노클로날 항체를 분리해내고, 남은 펠렛(pellet)은 0.01 M PBS 버퍼(pH 7.4) 10 ml를 넣고 현탁한다. 금 나노프루브 용액은 4℃에 일주일간 보관할 수 있다.
2) 자기성 면역 마이크로비드 제조
PSA 폴리클로날 항체를 코팅하기 위해 Dynabeads M-270 epoxy를 사용하여 제조하였다. 일단 마이크로비드를 세척하고, 15 mg/ml(약 109비드/ml) 농도를 만들기 위해 0.1 M Sodium phospate 버퍼 (pH 7.4)를 이용하여 희석한다. 그리고 만들어진 용액에 400 μl PSA 폴리클로날 항체(1 mg/ml)를 넣고 혼합한다. 단백질과 마이크로 비드의 결합을 강화하기 위해 ammonia sulfate를 최종 용액 농도가 1M이 되게 첨가한다. 그와 같이 배양한 후에 0.2% BSA 용액으로 마이크로비드를 블로킹 한 후 자석으로 분리해 낸다. 그리고 Tween 20이 포함된 PBS로 3차례 세척한다.
3) 금프루브의 확장을 위한 성장용액 준비
맑은 오렌지색을 얻기 위하여 0.25 mM HAuCl4와 0.1 M CTAB의 혼합액 10 ml를 용량 20 ml 바이알에 넣고 천천히 교반한다. 그리고 검출하기 직전에 10 mM AA 용액을 넣는다.
4) PSA-ACT 항원의 검출 및 정량
1 mg/ml 농도의 자기성 마이크로비드 100 μl와 0에서 100 ng/ml 범위의 다양한 농도의 PSA-ACT 단백질 300 μl를 넣고 1시간 30분 동안 37℃에서 서서히 교반한다. 다음으로는 0.01 M PBS 버퍼 (pH 7.4)로 세 차례 세척하고, 200 μl 금나노프루브를 첨가한 후 37℃에서 45분간 반응시킨다. 면역반응이 끝나면, 금프루브/PSA-ACT 단백질/자기성 마이크로비드가 서로 결합하여 샌드위치처럼 표적물질인 PSA-ACT를 둘러싸고 있다. 이 복합체를 자석을 이용하여 분리해낸다. 그리고 50 mM NaCl/1 M NaOH 혼합 용액을 넣고 모노클로날 PSA 항체로 개질된 금 나노프루브와 자기성 마이크로비드를 용리시킨 후 다시 자석으로 마이크로 비드를 분리한다. 그리고 나서 남아있는 금 나노프루브를 CTAB와 AA을 넣고 성장시킨다. 이렇게 성장된 금 나노프루브를 HR-TEM과 UV-Vis 스펙트로포토미터를 이용하여 분석할 수 있다. 도 4와 5는 금 나노프루브의 농도와 시간에 따른 금 나노프루브 색상의 변화(도 4) 및 550 nm 파장에서의 스펙트럼 흡광도 변화(도 5)를 보여준다. 1번은 0.65 x 10-7 M 농도의 금 나노프루브이고 2번은 1.3 x 10-7 M 농도의 금 나노프루브이고, 3번은 5.2 x 10-7 M 농도의 금 나노프루브이다. 도4의 A에서처럼 1번에서 3번으로 갈수록 금 나노프루브 용액의 색깔이 진해지고, UV-Vis 스펙트럼 흡광도도 금 나노프루브의 농도에 따라 증가하는 것을 보여준다. 이로써 금 나노프루브를 이용하여 단백질 정량도 가능함을 알 수 있었다.
실제 표적물질인 PSA-ACT 항원의 농도(0 pg/ml~100 ng/ml)에 따라 단백질 정량이 가능한지 실험하였다. 그 결과 도 6에서 보여준 것처럼 표적물질이 극소량인 1 pg/ml (3 fM)의 농도까지 검출이 가능하고 최대로는 100 ng/ml까지 검출이 가능함을 보였다.
이와 같이 상기 발명은 실제 50분 정도면 색깔이나 UV-Vis 스펙트로포토미터를 이용하여 질병 진단을 할 수 있고, 그 검출 한계도 3 fM 수준까지 검출이 가능하기 때문에 암의 조기 진단이나 다른 단백질 정량 분석에도 유용하게 쓰일 수 있다.
도 1은 용액상에서 자성의 마이크로비드와 금 나노크리스탈의 균일 성장을 이용한 단백질 정량 분석법에 관한 개념도이다.
도 2는 용액상에서 금 프루브의 성장에 따른 UV/Vis 스캐닝 스펙트라 그래프이다.
도 3은 금 나노프루브 성장 전의 TEM 사진(A) 및 금 나노프루브 성장 후의 TEM 사진(B)이다.
도 4는 PSA 농도에 따른 금 나노입자의 성장정도를 나타낸 색깔 변화 사진이다.
도 5는 550 nm 파장에서의 금 플라즈몬 흡광도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 PSA-ACT 복합체의 검출을 위한 선형 검정선이다.

Claims (11)

  1. (S1) 금 나노입자에 단클론 PSA(Prostate specific antigen) 항체를 고정화하여 금 나노프루브를 만들고, 자기성 마이크로비드에 다클론 PSA(Prostate specific antigen) 항체를 고정화한 후, 상기 금 나노프루브와 자기성 마이크로비드를 표적 단백질인 PSA-ACT(Prostate specific antigen-α1-antichymotrypsin) 항원과 용액상에서 반응시키는 단계;
    (S2) 상기 용액에서 상기 금 나노프루브와 자기성 마이크로비드를 분리한 후, 상기 금 나노프루브와 자기성 마이크로비드를 용리시키는 단계;
    (S3) 상기 용액에서 상기 자기성 마이크로비드를 분리하고, 분리된 상기 금 나노프루브에 AA(ascorbic acid) 및 CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)를 첨가하여 상기 금 나노프루브를 성장시키는 단계; 및
    (S4) 상기 (S3) 단계에서 스펙트로포토미터를 이용하여 성장된 금 나노프루브의 양을 측정하고 상기 측정된 금 나노프루브의 양을 통해 상기 표적 단백질을 정량하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 정량 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    금 나노프루브에 단클론 PSA 항체를 고정화하는 방법은 물리적 흡착인 것을 특징으로 하는 단백질 정량 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (S3) 단계에서 상기 금 나노프루브에 AA 및 CTAB를 첨가하여 상기 금 나노프루브를 성장시키는 반응은 5 내지 60 분 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 단백질 정량 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    검출되는 상기 PSA-ACT의 농도는 1 pg/ml~100ng/ml인 것을 특징으로 하는 단백질 정량 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 금 나노입자는 NaBH4와 HAuCl4의 환원에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 단백질 정량 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 자기성 마이크로비드는 에폭시 기가 덮여 있는 것을 특징으로 하는 단백질 정량 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
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