CN114384241B - 以纳米金簇为发光标记物的辉光型近红外化学发光试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析技术方法领域，涉及一种以纳米金簇为发光标记物的辉光型近红外化学发光试剂盒。该试剂盒包括：磁性复合物、缓冲溶液和氧化剂；磁性复合物为生物素标记的单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、以一步法反应得到的蛋氨酸包被纳米金簇标记的单抗二。该试剂盒在50pg/mL‑100ng/mL的浓度范围内表现出良好的线性关系，检测限为10pg/mL，具有良好的临床应用前景。

Description

以纳米金簇为发光标记物的辉光型近红外化学发光试剂盒

技术领域

本发明属于分析技术方法领域，涉及以纳米金簇为发光标记物的辉光型近红外化学发光试剂盒。

背景技术

传统的化学发光主要通过分子化学反应实现，其发光物通常为分子类发光物，如：鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯等。由分子化学反应诱导的化学发光辐射主要位于可见光区。纳米晶包括一元纳米金簇通常作为分子类化学发光反应体系的催化剂：例如专利CN104280542A利用纳米金簇增强化学发光效应，实现了纳米粒子标记放大的双增强免疫法，制备了免疫学试剂盒并提高了CLIA方法的灵敏度。专利CN103760149A报道了一种基于纳米金簇的快速化学发光检测心得安的方法，该方法是在鲁米诺与过氧化氢化学发光的基础上，将纳米金与心得安溶液混合，实现了灵敏度的提高。专利CN104062287A利用纳米金簇催化传统的鲁米诺-高碘酸化学发光体系，实现了对铁蛋白的灵敏检测。在发光体系中，纳米金簇主要作为增强剂参与化学发光反应而不是化学发光的发光物，化学发光分析依然借助于经典的分子化学发光反应实现。

目前，将纳米金簇直接作为化学发光标记物的化学发光试剂盒，未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种以纳米金簇为发光标记物的辉光型近红外化学发光试剂盒。合成了蛋氨酸包被的一种n型纳米金簇。氧化剂过二硫酸钾中的S₂O₈ ^2-能够直接氧化此n型纳米金簇，由相关氧化反应所注入的外源性空穴能够直接与n型纳米金簇中的自由电子结合、产生单波段辉光型近红外化学发光，用于构建化学发光试剂盒。

一种以纳米金簇为发光标记物的辉光型近红外化学发光试剂盒，包括：

磁性复合物、缓冲溶液和氧化剂；

所述的磁性复合物为生物素标记的单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、纳米金簇标记的单抗二以一步法反应得到，所述的纳米金簇为蛋氨酸包被的纳米金簇。

根据本发明，优选的，所述的纳米金簇，按如下方法制备得到：

以H₄AuCl₄为金源，蛋氨酸为配体，在pH值为4.0-12.0，于30-40摄氏度孵育后，纯化，即得纳米金簇。

根据本发明，优选的，采用H₄AuCl₄溶液为金源，H₄AuCl₄溶液的浓度为80-100mM；

优选的，pH值范围为5-11，进一步优选6-10，例如：6.5、7、8、9；

优选的，在37摄氏度孵育，孵育时间为8-120小时，进一步优选40-80小时，例如：48h、52h、64h、72h；

优选的，以蛋氨酸溶液为配体，蛋氨酸溶液的浓度为0.1mM-1mM。

优选的，H₄AuCl₄和蛋氨酸的摩尔比为1：(50-3)；

优选的，纯化所用试剂为乙醇。

根据本发明，优选的，纳米金簇标记的单抗二按如下方法制备得到：

将纳米金簇溶于水中，加入EDC、NHS活化羧基，然后溶于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中；

加入单抗二使混匀常温反应，利用单抗二上的氨基与纳米金簇上的羧基偶联，离心除去未反应的单抗二，加入BSA封闭纳米金簇上未反应的羧基，即得纳米金簇标记的单抗二。

根据本发明，优选的，所述的单抗为CEA单抗。

根据本发明，优选的，所述的磁性复合物，按如下方法制备得到：

将生物素标记的单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、纳米金簇标记的单抗二混合后常温反应30-60分钟，形成磁性复合物悬浮液，将磁性复合物悬浮液置于磁场中，磁分离，洗涤后，得到磁性复合物。

根据本发明，优选的，所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液的pH＝7.4。

根据本发明，优选的，所述的氧化剂为过氧二硫酸钾(K₂S₂O₈)溶液；

优选的，K₂S₂O₈溶液的浓度为10-200mM，更优选80-200mM。

根据本发明，还提供一种辉光型近红外化学发光试剂盒的免疫检测方法，包括步骤如下：

I：将磁性复合物加入到含有K₂S₂O₈和标准抗原溶液的磷酸盐缓冲溶液中，测试化学发光强度；

II：依据化学发光最大光强信号与抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制标准工作曲线；

III：将待测样品溶液按照步骤I中的方法进行化学发光测试，根据所得化学发光最大光强信号和标准工作曲线，得到待测样品溶液中的抗原浓度。

根据本发明，优选的，所述的标准抗原溶液浓度为0pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、1000pg/mL、5000pg/mL、10000pg/mL、20000pg/mL、50000pg/mL、100000pg/mL，其中0pg/mL为标准品缓冲液。

本发明的近红外单波段化学发光体系为辉光型，采集信号时间为300s，其化学发光波段位于近红外区，在824nm左右。

本发明未详尽说明的，均按本领域现有技术。

本发明的有益效果：

1、本发明利用蛋氨酸包被的n型纳米金簇标记单抗，该纳米金簇可直接作为近红外化学发光物质，在氧化剂过二硫酸钾存在下，直接产生强烈的辉光型近红外化学发光辐射。

2、本发明的基于纳米金簇的辉光型近红外化学发光试剂盒和免疫检测方法，抗干扰能力强，灵敏度高，检测灵敏度为10pg/mL，检测线性好。

附图说明

图1为实施例1中所制的水溶性纳米金簇的荧光光谱图。

图2为实施例1中所制的水溶性纳米金簇的紫外光谱图。

图3为实施例1中所制的水溶性纳米金簇的高倍透射电镜照片照片。

图4为实施例1中所制的水溶性纳米金簇的X射线光电子能谱分析。

图5为实施例1中所制的水溶性纳米金簇的zeta电位图。

图6为实施例1中基于纳米金簇的辉光型近红外化学发光试剂盒的近红外化学发光光谱图。

图7为实施例2中CEA抗原不同浓度的标准品，浓度与化学发光光强图。

图8为实施例2中CEA抗原标准品得到的标准曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明做进一步说明，但不限于此。

本发明制备的纳米金簇的荧光光谱图由WGY-10型荧光分光光度计采集获得，高倍透射电镜图由TecnaiG2 F30高倍投射电子显微镜所得，操作电压为300kV。化学发光由MPI-EII电化学发光检测仪所得，CL光谱由化学发光光谱仪采集系统所得。

实施例中所用的生物素标记的CEA单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、CEA单抗二、CEA抗原，均购自北京科跃中楷生物技术有限公司。

实施例1：

1、纳米金簇的合成：将96mM氯金酸(H₄AuCl₄)溶液(250微升)，4毫升蛋氨酸(Met)溶液(4mM)和氢氧化钠(NaOH)溶液超声混合均匀，同时用1M的NaOH或1M盐酸(HCl)将混合所制的溶液调节pH至8，于37摄氏度孵育48小时，然后将所得溶液离心去除底部大颗粒，最后将所得溶液用乙醇低转速离心纯化，所得沉淀即为纳米金簇。

将所得纳米金簇配制成1mg/mL的溶液检测荧光谱图，如图1所示。由图1可知合成金纳米团簇有两个荧光过程，分别位于610nm和810nm，可以分别归属于带隙发射峰和缺陷荧光发射峰。

将所得纳米金簇配制浓度为1mg/mL的溶液检测紫外谱图，如图2所示。如图2所示。由图2可知该纳米金簇有两个吸收峰，分别位于380和541nm。

将所得纳米金簇配制浓度为0.5mg/mL的溶液滴于铜网观察形貌，如图3所示。由图3由图3可知该纳米金簇的尺寸大约为4nm，在水中为单分散的球形。

将所得纳米金簇配制浓度为0.5mg/mL的溶液滴于硅片测试X射线光电子能谱，如图4所示。由图4可知所得金纳米团簇中含有Au和S元素。其中金(Au-4f)峰位于84.1和88.0eV，表明合成的金簇中同时含有+1和0价的金。蛋氨酸充当还原剂，将HAuCl4中+3价的金还原成为+1和0价的金。一价金的存在有助于金簇的稳定。S(S-2p)元素的峰位于161.8和162.8eV，表明合成的金簇表面配体S的价态是-2价。

将所得的纳米金簇粉末压片测试霍尔效应，如表1所示。

表1

由表1可知，该纳米金簇的霍尔系数为-38.36，证明其为n型半导体且内部有大量的自由电子。

2、将制得的纳米金簇溶液离心后复溶于1毫升体积的超纯水中，加入10μL 100mg/mL EDC、100mg/mL NHS活化羧基15-30分钟，离心复溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中(PBS)。

加入CEA单抗二使混匀常温反应2小时，利用单抗二上的氨基与纳米金簇上的羧基偶联，离心3次以除去未反应的CEA单抗二，加入BSA封闭纳米金簇上未反应的羧基。

3、将生物素标记的CEA单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、纳米金簇标记的CEA单抗二以一步法反应。按一定比例混合后常温反应30-60分钟，形成磁性复合物悬浮液，将磁性复合物悬浮液置于磁场中，磁分离2分钟，多次洗涤，得到磁性复合物。

4、将得到的磁性复合物注入1毫升含有150mM过氧二硫酸钾(K₂S₂O₈)的0.1M pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，得到基于纳米金簇的辉光型近红外化学发光试剂盒。

测试本实施例得到的基于纳米金簇的辉光型近红外化学发光试剂盒的近红外化学发光光谱图，如图6所示，采集信号时间为300s，该近红外化学发光体系为辉光型。由图6可知，其化学发光波段位于近红外区，在824nm左右。

实施例2

一种辉光型单波段近红外化学发光试剂盒的免疫检测方法，包括步骤如下：

I：将磁性复合物加入到含有K₂S₂O₈和CEA抗原标准抗原溶液的磷酸盐缓冲溶液中，测试化学发光强度；

II：依据化学发光最大光强信号与CEA抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制标准工作曲线；

III：将待测CEA抗原样品溶液按照步骤I中的方法进行化学发光测试，根据所得化学发光最大光强信号和标准工作曲线，得到待测样品溶液中的CEA抗原浓度。

CEA抗原标准品梯度溶液的配置方法是，将购置的CEA抗原按3pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的比例制备模拟血清中CEA标准品，具体操作为：

以磷酸氢二钾配制0.1mol/L pH为7.4的标准品缓冲液，以标准品缓冲液制备浓度梯度为0pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、1000pg/mL、5000pg/mL、10000pg/mL、20000pg/mL、50000pg/mL、100000pg/mL的10个标准品浓度。其中0pg/mL为标准品缓冲液。

本实施例中CEA抗原不同浓度的标准品，浓度与化学发光光强图如图7所示。CEA抗原标准品得到的标准曲线图如图8所示。

由图7、8可知，本发明的基于纳米金簇的辉光型近红外化学发光试剂盒和免疫检测方法，抗干扰能力强，灵敏度高，检测灵敏度为10pg/mL，检测线性好。

Claims (9)

1.一种以纳米金簇为发光标记物的辉光型近红外化学发光试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

磁性复合物、缓冲溶液和氧化剂；

所述的磁性复合物为生物素标记的单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、纳米金簇标记的单抗二以一步法反应得到，所述的纳米金簇为蛋氨酸包被的纳米金簇；

所述的纳米金簇，按如下方法制备得到：

以H₄AuCl₄为金源，蛋氨酸为配体，在pH值为4.0-12.0，于30-40摄氏度孵育后，纯化，即得纳米金簇；

纳米金簇标记的单抗二按如下方法制备得到：

将纳米金簇溶于水中，加入EDC、NHS活化羧基，然后溶于磷酸盐缓冲溶液（PBS）中；加入单抗二使混匀常温反应，利用单抗二上的氨基与纳米金簇上的羧基偶联，离心除去未反应的单抗二，加入BSA封闭纳米金簇上未反应的羧基，即得纳米金簇标记的单抗二；

所述的磁性复合物，按如下方法制备得到：

将生物素标记的单抗一、链霉亲和素标记的磁珠、纳米金簇标记的单抗二混合后常温反应30-60分钟，形成磁性复合物悬浮液，将磁性复合物悬浮液置于磁场中，磁分离，洗涤后，得到磁性复合物。

2. 根据权利要求1所述的以纳米金簇为发光标记物的辉光型近红外化学发光试剂盒，其特征在于，采用H₄AuCl₄溶液为金源，H₄AuCl₄溶液的浓度为80-100 mM；

pH值范围为5-11；

在37摄氏度孵育，孵育时间为8-120小时；

以蛋氨酸溶液为配体，蛋氨酸溶液的浓度为0.1 mM-1 mM；

H₄AuCl₄和蛋氨酸的摩尔比为1：（50-3）。

3.根据权利要求2所述的以纳米金簇为发光标记物的辉光型近红外化学发光试剂盒，其特征在于，pH值范围为6-10，孵育时间为40-80小时。

4.根据权利要求1所述的以纳米金簇为发光标记物的辉光型近红外化学发光试剂盒，其特征在于，所述的单抗为CEA单抗。

5.根据权利要求1所述的以纳米金簇为发光标记物的辉光型近红外化学发光试剂盒，其特征在于，所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液的pH=7.4。

6.根据权利要求1所述的以纳米金簇为发光标记物的辉光型近红外化学发光试剂盒，其特征在于，所述的氧化剂为过氧二硫酸钾K₂S₂O₈溶液。

7. 根据权利要求6所述的以纳米金簇为发光标记物的辉光型近红外化学发光试剂盒，其特征在于，K₂S₂O₈溶液的浓度为10-200 mM。

8. 根据权利要求7所述的以纳米金簇为发光标记物的辉光型近红外化学发光试剂盒，其特征在于，K₂S₂O₈溶液的浓度为80-200 mM。

9.一种辉光型近红外化学发光试剂盒的免疫检测方法，包括利用权利要求1所述的以纳米金簇为发光标记物的辉光型近红外化学发光试剂盒，包括步骤如下：

I：将磁性复合物加入到含有K₂S₂O₈和标准抗原溶液的磷酸盐缓冲溶液中，测试化学发光强度；

II：依据化学发光最大光强信号与抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制标准工作曲线；

III：将待测样品溶液按照步骤I中的方法进行化学发光测试，根据所得化学发光最大光强信号和标准工作曲线，得到待测样品溶液中的抗原浓度。

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