CN116794327B - 一种电化学发光免疫传感器及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种电化学发光免疫传感器及其制备与应用，属于分析技术方法技术领域。所述电化学发光免疫传感器的工作电极为依次在玻碳电极表面修饰金纳米粒子、甲胎蛋白一级抗体、牛血清白蛋白、甲胎蛋白、PCNDs‑Ab2复合物得到的GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP|PCNDs‑Ab2。本发明以PCNDs为ECL探针，AFP为模型蛋白，构建了三明治型ECL免疫传感器。在没有任何信号放大策略的协助下，所构建的ECL免疫传感器实现了对癌症标志物AFP的灵敏检测，线性范围在0.1～400ng/mL，检出限为0.05ng/mL。
Description
技术领域
本发明涉及分析技术方法技术领域，特别是涉及一种电化学发光免疫传感器及其制备与应用。
背景技术
甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)是胚胎发育早期的一种主要血清蛋白，在健康的成人体内，其值通常低于25ng/mL，血清中甲胎蛋白的升高对原发性肝癌诊断具有重要的意义。目前甲胎蛋白的检测方法主要有酶联免疫分析法、放射免疫测定法、间接血酶法和琼脂双扩散法等。这些方法前处理过程耗时长、分析时间长、对设备要求极高、并且需要配备专门的技术人员，最关键的是这些方法通常是使用酶作为信号探针，但是用酶作标记，制备过程复杂、价格昂贵，并且酶容易失活导致不稳定。因此，研究一种用于检测AFP的新方法或新装置成为了亟待解决的技术问题。
电化学发光(ECL)传感器是通过ECL活性发光体与目标分析物发生反应，将目标分析物的浓度转换为光电信号，从而达到分析、检测目的的一种分析装置。ECL生化免疫传感器集合了生物识别专一性、ECL发光体的生物兼容性及光电信号检测放大作用的优势，具有灵敏度高、选择性好、易于微型化和自动化的特点，在实现微型便携式终端检测设备普及的大健康时代将发挥重要作用。近年来，ECL生化免疫传感的研究工作取得了巨大的进展，其种类和性能也得到了很大的发展，可实现皮摩尔到飞摩尔量级以及单分子/单细胞水平的分析。若是能将ECL技术用于AFP的检测，开发一种用于检测AFP的电化学发光传感器，将对AFP的检测起到重要意义。
发光体是ECL传感器的核心部件之一，其发光效率和波段直接决定了ECL传感器的灵敏度、选择性和可靠性等传感器性能。目前基于半导体(CdTe、CdSe)量子点为标记物的光强型ECL免疫检测方法已有报道，但基于重金属(如铅、镉和汞)的纳米材料被认为具有急性和慢性毒性，这限制了它们的生物应用。为了解决这个问题，迫切需要开发对生物组织具有低毒性或无毒性的新型纳米材料。
碳点(Caborn Dots,简称CDs)作为一种2004年首次发现的新型荧光碳基纳米材料，由于其良好的生物相容性、化学稳定性和优异的光致发光性能且生产成本低廉等优点，在光电器件、生物成像、催化以及发光二极管(LED)等领域引起了科研工作者的深入研究。
与传统的碳化CDs不同，聚合物碳纳米点(PCNDs)作为一种碳化聚合物点(CPDs)，通常是通过聚合物团簇的碳化产生，具有聚合物/碳杂化结构，其表面含有丰富的官能团/聚合物链和尺寸小于20nm的碳核。PCNDs不仅具有传统碳化CDs突出的光学性能和生物相容性，而且继承了聚合物的性能。由于聚合物/碳杂化结构和特殊的PL机理，它们具有高氧/氮含量、优异的水溶性和优异的光致发光量子产率(PLQY)等独特特性。
若是能将PCNDs与ECL传感器以及AFP的检测相结合，开发一种基于PCNDs的用于检测AFP的电化学发光传感器，将具有十分广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种电化学发光免疫传感器及其制备与应用，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明的技术方案之一：一种电化学发光(ECL)免疫传感器，所述电化学发光免疫传感器的工作电极为依次在玻碳电极(GCE)表面修饰金纳米粒子(AuNPs)、甲胎蛋白一级抗体(Ab1)、牛血清白蛋白(BSA)、甲胎蛋白(AFP)、PCNDs-Ab2复合物得到的GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP|PCNDs-Ab2。
进一步地，所述PCNDs-Ab2复合物为PCNDs标记的甲胎蛋白二级抗体，所述PCNDs以色氨酸和精氨酸为前体，采用一锅水热法合成。
本发明的技术方案之二：一种利用上述电化学发光免疫传感器检测甲胎蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)制备PCNDs：将色氨酸和精氨酸溶解在水中，得到氨基酸混合溶液，将所述氨基酸混合溶液加热反应，反应结束后冷却，过滤，透析，冷冻干燥，得到所述PCNDs；
(2)制备PCNDs-Ab2复合物：将PCNDs加入到水中，搅拌，得到PCNDs水溶液，将所述PCNDs水溶液与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液混合，超声分散，离心，得到沉淀；将所述沉淀分散到PBS溶液中，然后加入甲胎蛋白二级抗体溶液，搅拌，再加入牛血清白蛋白溶液，搅拌，离心，得到所述PCNDs-Ab2复合物；将所述PCNDs-Ab2复合物分散到PBS溶液中，得到PCNDs-Ab2复合物溶液；
EDC和NHS的作用是活化PCNDs，使PCNDs表面上的羧基官能团具有更高的反应活性，从而使其与Ab2进行共价偶联反应，从而制备PCNDs-Ab2复合材料；
(3)构建电化学发光免疫传感器：
(a)以玻碳电极作为基底，通过电镀反应在玻碳电极表面沉积金纳米粒子，得到金纳米粒子修饰的工作电极GCE|AuNPs；
(b)将甲胎蛋白一级抗体滴加到GCE|AuNPs表面，孵育，得到甲胎蛋白一级抗体修饰的工作电极GCE|AuNPs|Ab1；所述孵育的条件为在4℃下孵育12h；
(c)将牛血清白蛋白溶液滴加到GCE|AuNPs|Ab1表面，孵育，得到牛血清白蛋白修饰的工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA；所述孵育的条件为在37℃下孵育1h；
(d)分别将不同浓度的甲胎蛋白标准溶液滴加到GCE|AuNPs|Ab1|BSA表面，孵育，得到不同浓度甲胎蛋白修饰的工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP；所述孵育的条件为在37℃下孵育2h；
(e)将PCNDs-Ab2复合物溶液滴加到不同浓度甲胎蛋白修饰的工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP表面，孵育，得到PCNDs-Ab2复合物修饰的含有不同浓度甲胎蛋白标准溶液的工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP|PCNDs-Ab2；所述孵育的条件为在37℃下孵育2h；
(4)绘制工作曲线：
将工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP|PCNDs-Ab2与参比电极和对电极构成三电极系统，以含有K2S2O8的PBS溶液为电解质溶液，分别对步骤(e)中得到的含有不同浓度甲胎蛋白标准溶液的工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP|PCNDs-Ab2进行ECL检测，记录ECL信号强度，ECL信号强度与甲胎蛋白标准溶液浓度的对数呈线性关系，以甲胎蛋白标准溶液浓度的对数为横坐标，ECL信号强度为纵坐标绘制工作曲线；
(5)甲胎蛋白的检测：将待测甲胎蛋白样品溶液代替步骤(d)中的甲胎蛋白标准溶液制备工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP|PCNDs-Ab2，按照步骤(4)进行检测，根据ECL信号强度和工作曲线得到待测甲胎蛋白的含量。
进一步地，步骤(1)中所述色氨酸和精氨酸的摩尔比为1:1，所述氨基酸混合溶液中色氨酸的浓度为0.05M；所述加热反应的温度为200℃，时间为8h。
进一步地，配制氨基酸混合溶液时，先将称量的色氨酸和精氨酸溶解在一部分水中，用1M HCl调节pH值至2，再添加水定容至要求浓度。调节pH后的溶液是强酸溶液，再加水后对pH的影响较小。先调节好pH值再定容是为了确保生成的PCNDs具有良好的形貌和性质，并且确保最终得到的PCNDs具有一致的性质，是制备过程中的重要步骤。
进一步地，所述过滤的具体操作为：使用孔径为0.22μm的针头过滤器过滤，所述透析的具体操作为：使用截止分子量为500～1000Da的纤维素酯透析袋在超纯水中透析10h，每2h换一次水。
进一步地，步骤(2)中所述PCNDs水溶液的浓度为10mg/mL，所述EDC溶液的浓度为10mg/mL，所述NHS溶液的浓度为10mg/mL，按体积比计，PCNDs水溶液：EDC溶液：NHS溶液＝5:1:1。
进一步地，步骤(2)中将沉淀分散到0.1M PBS溶液中时，0.1M PBS溶液与制备沉淀时使用的PCNDs水溶液的体积比为2:5，将沉淀分散到0.1M PBS溶液后加入的甲胎蛋白(AFP)二级抗体(Ab2)的浓度为1mg/mL，加入量为0.1M PBS溶液的5vol.％，加入的BSA溶液的浓度为3wt.％，加入量为0.1M PBS溶液的5vol.％；将PCNDs-Ab2复合物分散到0.1M PBS溶液中时，0.1M PBS溶液与一开始制备沉淀时使用的PCNDs水溶液的体积比为1:5。
进一步地，步骤(a)中所述电镀反应的电解液为含HAuCl4和KCl的PBS溶液，所述电镀反应的条件为：以-0.2V的工作电压反应200s。
进一步地，所述含HAuCl4和KCl的PBS溶液中HAuCl4的浓度为6mM，KCl的浓度为0.1M，PBS的浓度为0.1M。
进一步地，步骤(b)中所述甲胎蛋白一级抗体的浓度为18μg/mL，滴加量为10μL；步骤(c)中所述血清白蛋白溶液的浓度为3wt.％，滴加量为10μL；步骤(e)中所述PCNDs-Ab2复合物溶液的滴加量为10μL。
进一步地，步骤(d)中所述不同浓度的甲胎蛋白标准溶液为浓度分别为0.1、10.0、50.0、100、200、300和400ng/mL的甲胎蛋白标准溶液，甲胎蛋白标准溶液的滴加量为10μL。
进一步地，步骤(4)中所述含有K2S2O8的PBS溶液中K2S2O8的浓度为80mM，PBS的浓度为0.1M。
进一步地，所述玻碳电极(GCE)在使用前依次使用粒径为1μm、0.3μm和0.05μm的Al2O3打磨粉抛光，使其表面呈现光滑的镜面状，用0.1MK3[Fe(CN)6]/0.2M KNO3溶液测试电极，抛光处理直到[Fe(CN)6]3+/[Fe(CN)6]4+的阴极峰和相应阳极峰之间的电位差小于70mV。
本发明公开了以下技术效果：
(1)本发明以PCNDs为ECL探针，AFP为模型蛋白，构建了三明治型ECL免疫传感器。在没有任何信号放大策略的协助下，所构建的ECL免疫传感器实现了对癌症标志物AFP的灵敏检测，线性范围在0.1～400ng/mL，检出限为0.05ng/mL；同时该ECL免疫传感器在人体血清实际样品的检测中表现出满意的结果，回收率为100.49～102.24％。
(2)本发明以色氨酸和精氨酸为前体，采用简便的一锅水热法合成了一种水溶性良好的具有高荧光量子产率，高ECL效率的蓝色荧光纳米材料—PCNDs。以该PCNDs作为ECL探针构建ECL免疫传感器，ECL信号强，ECL效率高，制备得到的传感器灵敏度高，稳定性好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中PCNDs-Ab2复合物的制备流程示意图；
图2为本发明实施例1中电化学发光免疫传感器的制备流程示意图；
图3为本发明应用例1中绘制的工作曲线；
图4为本发明实施例1制备的PCNDs的水溶液(0.0125mg/mL)的TEM图像；
图5为实施例1制备的PCNDs以及原料色氨酸和精氨酸的FT-IR光谱图；
图6为PCNDs水溶液(0.0125mg/mL)的紫外-可见吸收(UV-vis)光谱和光致发光(PL)光谱(λex＝280nm；λem＝350nm)；
图7为实施例1步骤(a)～(e)中在基底表面修饰不同成分后得到的工作电极的电化学阻抗谱；
图8为ECL免疫传感器在含有80mM K2S2O8的0.1M PBS/KCl(pH＝7.4)溶液中检测不同浓度AFP的ECL时间曲线；
图9为ECL免疫传感器的选择性测试结果；
图10为ECL免疫传感器的再现性和稳定性测试结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
电化学发光(ECL)免疫传感器的制备
(1)PCNDs的制备：
称取0.6127g(0.03mol)色氨酸和0.5226g(0.03mol)精氨酸溶解在40mL超纯水中，用1M HCl将溶液的pH值调至2，添加超纯水将溶液定容到60mL得到氨基酸混合溶液，并将其倒入100mL以聚四氟乙烯为内衬的高压反应釜中，在200℃下反应8h；反应结束后将溶液自然冷却至室温，产生的深棕色悬浮液通过针头过滤器(孔径：0.22μm)过滤，然后使用截止分子量(MWCO)为500～1000Da的纤维素酯透析袋在超纯水中透析10h(每2h换一次水)，最后对透析后的纯化产物进行冷冻干燥获得粉末状PCNDs。
(2)PCNDs-Ab2复合物的制备：
将步骤(1)制备的PCNDs加入到水中溶解，得到浓度为10mg/mL的PCNDs水溶液，将5mL的PCNDs水溶液(10mg/mL)与1mL EDC溶液(10mg/mL)和1mLNHS溶液(10mg/mL)混合，超声分散2h，在12500rpm的转速下离心10min得到沉淀，将其重新分散到2mL 0.1M PBS溶液(pH＝7.4)中，然后向溶液中加入100μL 1mg/mL甲胎蛋白(AFP)二级抗体(Ab2)并在37℃下搅拌30min，随后加入100μL 3wt.％BSA溶液继续搅拌1h，最后将混合溶液在12500rpm的转速下离心10min，得到PCNDs-Ab2复合物(PCNDs标记的甲胎蛋白二级抗体)沉淀，将此沉淀分散到1mL 0.1M PBS(pH＝7.4)溶液中，得到PCNDs-Ab2复合物溶液，并储存在4℃冰箱中备用(PCNDs-Ab2复合物的制备流程示意图如图1所示)；
(3)构建电化学发光免疫传感器(电化学发光传感器的制备流程示意图如图2所示)：
(a)将玻碳电极(GCE)依次使用粒径为1μm、0.3μm和0.05μm的Al2O3打磨粉抛光，使其表面呈现光滑的镜面状，用0.1M K3[Fe(CN)6]/0.2M KNO3溶液测试电极，抛光处理直到[Fe(CN)6]3+/[Fe(CN)6]4+的阴极峰和相应阳极峰之间的电位差小于70mV；然后将玻碳电极(GCE)作为工作电极，将其置于含6mM HAuCl4和0.1M KCl的0.1M PBS溶液中，以Ag/AgCl为参比电极，Pt丝为对电极，在-0.2V下保持200s，通过电化学反应在玻碳电极表面沉积金纳米粒子(AuNPs)，得到金纳米粒子修饰的工作电极GCE|AuNPs；
(b)将10μL 18μg/mL甲胎蛋白的一级抗体(Ab1)滴加到GCE|AuNPs表面，在4℃下孵育12h，得到甲胎蛋白一级抗体修饰的工作电极GCE|AuNPs|Ab1；
(c)将10μL的BSA溶液(3wt.％)滴加到GCE|AuNPs|Ab1表面，在37℃下孵育1h，得到牛血清白蛋白修饰的工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA；
(d)分别将浓度为0.1、10.0、50.0、100、200、300和400ng/mL的甲胎蛋白标准溶液甲胎蛋白溶液滴加到GCE|AuNPs|Ab1|BSA表面(滴加量为10μL)，在37℃下孵育2h，得到甲胎蛋白修饰的工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP；
(e)取10μL步骤(1)制得的PCNDs-Ab2复合物溶液，将其滴到GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP表面，在37℃下孵育2h，得到PCNDs-Ab2复合物修饰的工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP|PCNDs-Ab2。
步骤(b)～(e)中，在每个修饰过程后，都需要用0.1M PBS(pH＝7.4)清洗修饰过的电极。
应用例1
通过ECL免疫分析绘制工作曲线
将工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP|PCNDs-Ab2与参比电极Ag/AgCl(饱和KCl)和对电极铂丝构成三电极系统，在西安瑞迈MPI-E II型电化学发光仪上进行ECL免疫分析。电化学池为特别定制的适合测试仪器尺寸的石英池，并且在实验之前，分别在碱缸(含有5wt.％KOH的异丙醇溶液)和酸缸(5wt.％HCl溶液)中浸泡4h以达到完全清洁的测试条件。然后以含有80mM K2S2O8的0.1M PBS(pH＝7.4)溶液作为电解液，分别对步骤(e)中得到的含有不同浓度甲胎蛋白标准溶液的工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP|PCNDs-Ab2进行ECL检测，检测条件为：光电倍增管的电压为1000V，扫描电位为0～-1.8V，扫描速度为0.1V/s；记录ECL信号强度，ECL信号强度与甲胎蛋白标准溶液浓度的对数呈线性关系，以甲胎蛋白标准溶液浓度的对数为横坐标，ECL信号强度为纵坐标绘制工作曲线，制得的工作曲线如图3所示。由图3可知，ECL强度与AFP浓度成正比，线性范围为0.1～400ng/mL，线性回归方程为IECL＝1593.84lgCAFP+3260.81(R2＝0.995，n＝5)，计算得到检出限为0.05ng/mL(S/N＝3)。
应用例2
实际样品中AFP的检测
用0.1M PBS(pH＝7.4)将新鲜人血清稀释至100倍，得到待测AFP样品溶液，将待测AFP样品溶液代替实施例1步骤(d)中的甲胎蛋白标准溶液制备工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP|PCNDs-Ab2，按照应用例1的ECL免疫分析过程进行检测，经检测，其ECL信号强度为2723.3a.u.，根据工作曲线计算得到该待测AFP样品溶液中甲胎蛋白的含量为0.46ng/mL。
应用例3
通过加标回收法检测人血清样品中的AFP：使用前，用0.1M PBS(pH＝7.4)将新鲜人血清稀释至100倍，制备4份空白样品。然后在其中3份空白样品中分别加入不同浓度的AFP抗原溶液，使最终溶液中添加的AFP浓度分别为50、100、150ng/mL，得到4份待测血清样本。之后，将这4份待测血清样本分别代替实施例1步骤(d)中的甲胎蛋白标准溶液制备工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP|PCNDs-Ab2，按照应用例1的ECL免疫分析过程进行检测，根据ECL信号强度和工作曲线得到血清样本中甲胎蛋白的含量，计算回收率，以上检测过程重复三次，结果取平均值，如表1所示：
表1人血清样品中AFP的测定结果
由表1可知，通过加标回收法测得的平均回收率在100.49～102.24％之间，相对标准偏差(RSD)为1.75～2.47％(n＝3)，通过加标回收法检测血清样本中的AFP，证明了该免疫传感器在实际样本中的潜在应用，说明本发明所制备的免疫传感器在临床分析中可实际应用。
效果例1
PCNDs的性能测试
(1)PCNDs的形貌结构表征
采用透射电子显微镜(TEM)对本发明实施例1制备的PCNDs的水溶液(0.0125mg/mL)的形貌进行表征，实施例1制备的PCNDs的TEM图如图4所示，由图4可知PCNDs具有良好的水溶性，没有明显的聚集现象，具有无定形球形态，平均粒径约为13nm。
同时，通过傅里叶变换红外(FT-IR)光谱分析实施例1制备的PCNDs以及原料色氨酸和精氨酸的表面化学性质，实施例1制备的PCNDs以及原料色氨酸和精氨酸的FT-IR光谱图如图5所示，由图5可知，PCNDs的FT-IR光谱图中含有多种含O、含N官能团的FT-IR特征吸收峰，这些FT-IR特征吸收峰表明PCNDs继承了原料色氨酸和精氨酸的基本结构，并且其表面富含-OH、C＝O和-NH。
PCNDs具有羧酸、羟基和氨基等表面官能团，这些官能团使得PCNDs具有更好的水溶性。此外，PCNDs的表面带有带电官能团，这些带电官能团可以与水分子形成氢键和离子键，从而增强了它们与水的相互作用能力。
(2)PCNDs的发光特性
(a)观察PCNDs水溶液(0.0125mg/mL)在日光下和紫外光照射下的颜色，发现PCNDs水溶液在日光下呈淡黄色，在紫外光(365nm)照射下呈明亮的蓝色，表明PCNDs具有蓝色荧光特性。
(b)PCNDs水溶液(0.0125mg/mL)的紫外-可见吸收(UV-vis)光谱和光致发光(PL)光谱如图6所示，由图6可知PCNDs的UV-vis光谱在230nm和280nm左右显示出两个特征吸收带，这分别是由芳香结构C＝C sp2结构域的π-π*跃迁和表面官能团(C＝O，C-N)的n-π*跃迁引起的。且在280nm处的吸收带中存在精细结构，这表明PCNDs成功地继承了其原料(色氨酸和精氨酸)的芳香结构。当激发波长为280nm时，PCNDs的发射波长为350nm。
(3)PCNDs的荧光量子产率
荧光量子产率(PLQY)的计算公式如下：
其中I是PL发射强度的积分，A是吸光度(小于0.1)，η是溶剂的折射率，下标“st”代表标准物质硫酸奎宁，“x”代表PCNDs。标准物质硫酸奎宁溶解在0.1M H2SO4中(ηst＝1.33)，而PCNDs分析物分散在超纯水中(ηx＝1.33)。
经计算，PCNDs的荧光量子产率为46％。
(4)PCNDs的ECL效率
ECL效率(ΦECL)定义为测试体系的氧化与还原物质间的每次电子转移产生的光子数相较与标准体系的比值，本效果例中选择Ru(bpy)3Cl2/K2S2O8为标准体系，计算公式如下：
其中，“ECL”和“Current”分别指ECL强度和电化学电流值，“st”代表Ru(bpy)3Cl2/K2S2O8标准物，“x”代表待测化合物。
经计算，PCNDs的ΦECL最大值为52％。
效果例2
在基底表面修饰不同成分后得到的工作电极的电化学阻抗谱
在上海辰华CHI 760E型电化学工作站进行测试监测免疫传感器的组装。典型的阻抗谱图有两部分，包括在较高的频率处的半圆部分，代表电荷转移电阻(Rct)，和在较低的频率处的线性部分，对应于扩散过程。Rct值代表Fe(CN)6 3-/4-氧化还原体系的电荷转移动力学，可由高频区的半圆直径估算。
分别将玻碳电极基底、实施例1步骤(a)～(e)中在基底表面修饰不同成分后得到的工作电极GCE|AuNPs、GCE|AuNPs|Ab1、GCE|AuNPs|Ab1|BSA、GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP、GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP|PCNDs-Ab2在含有10mM[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-的0.1M PBS/KNO3(pH＝7.4)溶液中获得电化学阻抗谱(EIS)，如图7所示:其中，a为GCE、b为GCE|AuNPs、c为GCE|AuNPs|Ab1、d为GCE|AuNPs|Ab1|BSA、e为GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP、f为GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP|PCNDs-Ab2，由图7可知，裸GCE的EIS显示出几乎一条直线(曲线a)，这证明裸GCE具有较低的Rct。电沉积一层AuNPs后，可以观察到获得的GCE|AuNPs(曲线b)的Rct变得更小，这是由于AuNPs的优异导电性促进[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-氧化还原体系的快速电子转移。随着Ab1(曲线c)、BSA(曲线d)和AFP(曲线e)的依次孵育，半圆部分的直径逐渐增大，因为非导电生物蛋白质的电阻会阻碍电极表面氧化还原对的电子转移。随着PCNDs-Ab2(曲线f)在电极上的进一步孵育，EIS中的半圆直径减小。阻抗谱证明了GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP|PCNDs-Ab2夹心型免疫传感器的成功构筑，并且用于AFP检测的可行性。
效果例3
ECL免疫传感器在含有80mM K2S2O8的0.1M PBS/0.1M KCl(pH＝7.4)溶液中检测不同浓度AFP的ECL时间曲线
将实施例1制得的含有不同浓度甲胎蛋白标准溶液的ECL免疫传感器在含有80mMK2S2O8的0.1M PBS/KCl(pH＝7.4)溶液中检测不同浓度AFP(0.1、10.0、50.0、100、200、300和400ng/mL)的ECL强度随时间的变化，扫速为0.1V/s，扫描电位在0～-1.8V之间。ECL时间曲线如图8所示，其中，从a到h分别代表0.1、10.0、50.0、100、200、300和400ng/mL，由图8可知ECL的信号强度随着AFP浓度从0.1ng/mL增加到400ng/mL而增加，表明该传感器可检测0.1～400ng/mL浓度范围之间的AFP。
效果例4
ECL免疫传感器的选择性
ECL免疫传感器的选择性测试结果如图9所示，其中a为空白、b为100ng/mLAFP、c为100ng/mLAFP和1μg/mL CEA(癌胚抗原)的混合物、d为100ng/mLAFP和1KU/mL CA19-9(癌抗原19-9)的混合物、e为100ng/mLAFP、1μg/mL CEA和1KU/mL CA19-9的混合物，由图9可知将100ng/mL的AFP与100倍浓度的不同干扰物质混合孵育到电极表面，AFP/混合物的ECL强度几乎与纯AFP的相同，表明所构建的ECL免疫传感平台对AFP具有优异的选择性和特异性。
效果例5
ECL免疫传感器的再现性和稳定性
采用应用例1的ECL检测方法，连续10次测试AFP浓度为100ng/mL的ECL免疫传感器的再现性和稳定性，结果如图10所示，由图10可知相对标准偏差(RSD)仅为1.07％，说明了PCNDs为发光体的ECL免疫传感器具有良好的重复性和稳定性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种电化学发光免疫传感器，其特征在于，所述电化学发光免疫传感器的工作电极为依次在玻碳电极表面修饰金纳米粒子、甲胎蛋白一级抗体、牛血清白蛋白、甲胎蛋白、PCNDs-Ab2复合物得到的GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP|PCNDs-Ab2；
所述PCNDs-Ab2复合物为PCNDs标记的甲胎蛋白二级抗体，所述PCNDs以色氨酸和精氨酸为前体，采用一锅水热法合成；
具体合成方法为：
称取0.6127g色氨酸和0.5226g精氨酸溶解在40mL超纯水中，用1M HCl将溶液的pH值调至2，添加超纯水将溶液定容到60mL得到氨基酸混合溶液，并将其倒入100mL以聚四氟乙烯为内衬的高压反应釜中，在200℃下反应8h；反应结束后将溶液自然冷却至室温，产生的深棕色悬浮液通过针头过滤器过滤，然后使用截止分子量为500～1000Da的纤维素酯透析袋在超纯水中透析10h，最后对透析后的纯化产物进行冷冻干燥获得粉末状PCNDs。
2.根据权利要求1所述的电化学发光免疫传感器，其特征在于，所述电化学发光免疫传感器的制备包括以下步骤：
（1）制备PCNDs：称取0.6127g色氨酸和0.5226g精氨酸溶解在40mL超纯水中，用1M HCl将溶液的pH值调至2，添加超纯水将溶液定容到60mL得到氨基酸混合溶液，并将其倒入100mL以聚四氟乙烯为内衬的高压反应釜中，在200℃下反应8h；反应结束后将溶液自然冷却至室温，产生的深棕色悬浮液通过针头过滤器过滤，然后使用截止分子量为500～1000Da的纤维素酯透析袋在超纯水中透析10h，最后对透析后的纯化产物进行冷冻干燥获得粉末状PCNDs；
（2）制备PCNDs-Ab2复合物：将PCNDs加入到水中，搅拌，得到PCNDs水溶液，将所述PCNDs水溶液与1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐溶液以及N-羟基琥珀酰亚胺溶液混合，超声分散，离心，得到沉淀；将所述沉淀分散到PBS溶液中，然后加入甲胎蛋白二级抗体溶液，搅拌，再加入牛血清白蛋白溶液，搅拌，离心，得到所述PCNDs-Ab2复合物；将所述PCNDs-Ab2复合物分散到PBS溶液中，得到PCNDs-Ab2复合物溶液；
（3）构建电化学发光免疫传感器：
（a）以玻碳电极作为基底，通过电镀反应在玻碳电极表面沉积金纳米粒子，得到金纳米粒子修饰的工作电极GCE|AuNPs；
（b）将甲胎蛋白一级抗体滴加到GCE|AuNPs表面，孵育，得到甲胎蛋白一级抗体修饰的工作电极GCE|AuNPs|Ab1；
（c）将牛血清白蛋白溶液滴加到GCE|AuNPs|Ab1表面，孵育，得到牛血清白蛋白修饰的工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA；
（d）分别将不同浓度的甲胎蛋白标准溶液滴加到GCE|AuNPs|Ab1|BSA表面，孵育，得到不同浓度甲胎蛋白修饰的工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP；
（e）将PCNDs-Ab2复合物溶液滴加到不同浓度甲胎蛋白修饰的工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP表面，孵育，得到PCNDs-Ab2复合物修饰的含有不同浓度甲胎蛋白标准溶液的工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP|PCNDs-Ab2；
（4）绘制工作曲线：
将工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP|PCNDs-Ab2与参比电极和对电极构成三电极系统，以含有K2S2O8的PBS溶液为电解质溶液，分别对步骤（e）中得到的含有不同浓度甲胎蛋白标准溶液的工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP|PCNDs-Ab2进行ECL检测，记录ECL信号强度，ECL信号强度与甲胎蛋白标准溶液浓度的对数呈线性关系，以甲胎蛋白标准溶液浓度的对数为横坐标，ECL信号强度为纵坐标绘制工作曲线；
（5）甲胎蛋白的检测：用待测甲胎蛋白样品溶液代替步骤（d）中的甲胎蛋白标准溶液制备工作电极GCE|AuNPs|Ab1|BSA|AFP|PCNDs-Ab2，按照步骤（4）进行ECL检测，根据ECL信号强度和工作曲线得到待测甲胎蛋白的含量。
3.根据权利要求2所述的电化学发光免疫传感器，其特征在于，步骤（2）中所述PCNDs水溶液的浓度为10 mg/mL，所述1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为10 mg/mL，所述N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度为10 mg/mL，按体积比计，PCNDs水溶液：EDC溶液：NHS溶液=5:1:1。
4.根据权利要求2所述的电化学发光免疫传感器，其特征在于，步骤（a）中所述电镀反应的电解液为含HAuCl4和KCl的PBS溶液，所述电镀反应的条件为：以-0.2 V的工作电压反应200 s。
5.根据权利要求4所述的电化学发光免疫传感器，其特征在于，所述含HAuCl4和KCl的PBS溶液中HAuCl4的浓度为6 mM，KCl的浓度为0.1 M，PBS的浓度为0.1 M。
6.根据权利要求2所述的电化学发光免疫传感器，其特征在于，步骤（b）中所述甲胎蛋白一级抗体的浓度为18 μg/mL，滴加量为10 μL；步骤（c）中所述牛血清白蛋白溶液的浓度为3wt.%，滴加量为10 μL；步骤（e）中所述PCNDs-Ab2复合物溶液的滴加量为10 μL。
7.根据权利要求2所述的电化学发光免疫传感器，其特征在于，步骤（d）中所述不同浓度的甲胎蛋白标准溶液为浓度分别为0.1、10.0、50.0、100、200、300和400 ng/mL的甲胎蛋白标准溶液，甲胎蛋白标准溶液的滴加量为10 μL。
8.根据权利要求2所述的电化学发光免疫传感器，其特征在于，步骤（4）中所述含有K2S2O8的PBS溶液中K2S2O8的浓度为80 mM，PBS的浓度为0.1 M。
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| 荧光碳点的制备及应用;颜范勇;邹宇;王猛;代林枫;周旭光;陈莉;;化学进展(第01期);全文 * |
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