CN114149592B - 一种复合比率荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种复合比率荧光探针及其制备方法和应用，属于纳米材料科学与传感器制备技术领域；在本发明中，基于谷胱甘肽功能化的二硫化钼纳米片与铕配位聚合物掺杂制备得到复合比率荧光探针，所述复合比率荧光探针随着四环素的不断加入可观察到两种相反的荧光信号；所述复合比率荧光探针具有内置校准效应，能降低环境和仪器带来的干扰。

Description

一种复合比率荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于纳米材料科学与传感器制备技术领域，具体涉及一种复合比率荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

四环素（TC）类抗生素是一类广谱抗生素，因其毒性低和价格低廉在畜禽养殖业常被当作添加剂，用于治疗动物疾病感染或促进家畜生长。然而，四环素滥用会造成在动物体内积累，并最终通过食物链转移到消费者体内，致使耐药细菌的产生。目前四环素检测手段包括高效液相色谱法、液相色谱-质谱法和酶联免疫分析法等，尽管上述方法具有较高的灵敏度、特异性和精密度的优点，但是需要复杂的设备、专业的人员和费力的操作，在缺乏基础设施、专业专家和适当环境处理的情况下，迫切需要更加方便快捷的新兴检测技术。近年来，荧光法因其操作简单、准确度高、可测性强等优点被大量研究，其具有良好的选择性和合理的仪器价格，有助于资源有限地区的四环素定量分析。因此，开发高灵敏性的四环素荧光检测探针具有重要的实际意义。

镧系材料具有尖锐的线状发射带和长的荧光寿命，特别是基于铕离子（Eu³⁺）的配位聚合物具有良好的红色荧光发射，适用于荧光定量和可视化检测。由于β-二酮结构的存在， TC可以自发地与Eu³⁺ 螯合形成二元配合物Eu-TC。TC吸收紫外线激发的能量，通过天线效应迅速转移到Eu³⁺，进而敏化Eu³⁺ 发光。然而，Eu-TC配合物在潮湿环境和紫外光下荧光稳定性差，这限制了在实际中的应用。尽管通过螯合柠檬酸、聚合物等合适的试剂可以提高Eu-TC探针的灵敏度，但是由于基于Eu³⁺ 的单通道“开启”荧光传感器容易受到环境和仪器的干扰，这使得荧光探针的波动大、重现性较差。因此，迫切需要设计和开发一种用于四环素检测的比率型荧光探针，通过比率探针的自校准效应消除上述因素引起的波动，提高检测结果的可靠性和重现性。

发明内容

针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种复合比率荧光探针及其制备方法和应用。在本发明中，基于谷胱甘肽功能化的二硫化钼纳米片与铕配位聚合物掺杂制备得到复合比率荧光探针，所述复合比率荧光探针随着四环素的不断加入可观察到两种相反的荧光信号，MoS₂ NPs由于內滤和光致能量电子转移作用蓝色荧光被淬灭。而Eu³⁺红色荧光被敏化，这是由于四环素的β-二酮结构能够自发地与铕配位聚合物螯合，将吸收能量通过天线效应转移到Eu³⁺；并且所述复合比率荧光探针具有内置校准效应，能降低环境和仪器带来的干扰。

本发明中首先提供了一种复合比率荧光探针，所述复合比率荧光探针基于谷胱甘肽功能化的二硫化钼纳米片掺杂铕配位聚合物得到；所述谷胱甘肽功能化的二硫化钼纳米片大小分散均匀；所述铕配位聚合物自组装制备得到，其具有清晰的三维空间网状结构。

本发明中还提供了上述复合比率荧光探针的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）谷胱甘肽功能化的二硫化钼纳米片的制备：

将钼酸钠溶液与谷胱甘肽溶液超声混合，然后将混合溶液恒温加热反应，反应结束后冷却、离心、过滤，得到所述谷胱甘肽功能化的二硫化钼纳米片，记为MoS₂ NPs。

进一步的，步骤（1）中，混合溶液中钼酸钠和谷胱甘肽的质量比为1:2。

进一步的，步骤（1）中，所述超声的条件为超声功率为60~100 W，时间为5~10 min。

进一步的，步骤（1）中，恒温加热反应的条件为200~250 ℃，时间为20~30 h。

进一步的，步骤（1）中，所述的离心转速为10000 rpm，时间为10~15 min。

（2）铕配位聚合物的制备：

将硝酸铕水溶液和含有鸟苷酸二钠（Gmp）的HEPES缓冲液混合，室温下搅拌、离心、洗涤；然后将洗涤后的白色沉淀分散在HEPES缓冲液中形成Gmp/Eu悬浮液，将Gmp/Eu悬浮液与柠檬酸（Cit）溶液混合，得到所述铕配位聚合物，记为Gmp/Eu-Cit。

进一步的，步骤（2）中，所述硝酸铕水溶液和含有鸟苷酸二钠的HEPES缓冲液的体积比为1:1，其中硝酸铕水溶液的浓度为10 mM，含有Gmp的HEPES缓冲液中Gmp的浓度为10mM。

进一步的，步骤（2）中，Gmp/Eu悬浮液与柠檬酸（Cit）溶液的体积比为1:1；其中，Gmp/Eu悬浮液的浓度为10 mM，柠檬酸（Cit）溶液的浓度为5 mM。

进一步的，步骤（2）中，所述搅拌的时间为1~3 h，所述的HEPES缓冲液浓度为0.1mol/L，pH = 7.4。

（3）复合比率荧光探针的制备：

将MoS₂ NPs溶液，Gmp/Eu-Cit溶液，HEPES缓冲液混合均匀后即可得到复合比率荧光探针溶液，记为MoS₂ NPs@Gmp/Eu-Cit。

进一步的，步骤（3）中，所述MoS₂NPs溶液、Gmp/Eu-Cit溶液和HEPES缓冲液的体积比为1:10:30。

进一步的，所述MoS₂NPs溶液浓度为0.5-1 mol/L，Gmp/Eu-Cit溶液浓度为2.5-5mmol/L，HEPES缓冲液浓度为0.1 mol/L。

本发明中还提供了上述复合比率荧光探针在可视化检测四环素中的应用，所述可视化检测为半定量检测或定量检测。

进一步的，所述应用具体包括如下步骤：

（1）四环素检测标准曲线的绘制：

将四环素水溶液与MoS₂ NPs@Gmp/Eu-Cit混合得到荧光复合体系，通过荧光分析法拟合出四环素浓度的标准曲线，并记录荧光复合体系在紫外灯下的颜色情况；

（2）将待测样品与比率荧光复合体系混合后放置在紫外灯下，记录颜色信息，得到四环素浓度范围；然后检测混合液的荧光强度值，根据标准曲线得出四环素浓度。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1. 本发明的比率荧光探针所用的钼酸钠、谷胱甘肽、硝酸铕、柠檬酸、鸟苷酸二钠来源广泛，成本较低。二硫化钼纳米片通过一步水热法制备，铕配位聚合物通过自装配进行合成，两者仅通过简单的比例混合即可制备出所需的比率荧光探针，制备过程简便快速、节约能源，不需要特异性的生物材料，如适配体或抗原抗体等，便于推广。

2. 本发明的比率荧光探针随着四环素的加入，可观察到两种相反的荧光信号，MoS₂ NPs由于內滤和光致能量电子转移作用蓝色荧光被淬灭；而Eu³⁺红色荧光被敏化，这是由于四环素的β-二酮结构能够自发地与铕配位聚合物螯合，将吸收能量通过天线效应转移到Eu³⁺；相比单荧光信号探针，本发明的优势是能降低环境和仪器带来的干扰。

3. 本发明的比率荧光探针与不同浓度四环素混合后在紫外灯下可以产生渐变的颜色变化，随着四环素浓度的增加，混合体系的荧光颜色从蓝色变到紫色，再渐变到红色。根据颜色可半定量判断出四环素浓度范围，更易于实现待测物的可视化检测。

4. 本发明的比率荧光探针对四环素有良好的选择性，对常见的抗生素、生理物质、无机离子具有良好的抗干扰性能，在食品检测方面具有一定的实用价值。

附图说明

图1是本发明所得MoS₂ NPs的透射电镜图（A）和X射线光电子能谱图（B）。

图2是本发明所得Gmp/Eu-Cit的透射电镜图（A）和X射线光电子能谱图（B）。

图3是加入不同浓度四环素后MoS₂NPs@Gmp/Eu-Cit复合体系的荧光图谱（A）和荧光强度比值F₆₁₇/F₄₃₀与四环素浓度拟合的校准曲线（B）。

图4是不同浓度四环素对应比率荧光探针的荧光颜色图。

图5是本发明所得比率荧光探针的选择性示意图；其中A为复合比率荧光探针对不同种抗生素（四环素、氧四环素、环丙沙星、青霉素、阿奇霉素、氨苄西林、氟苯尼考和阿莫西林）的选择性示意图，B为复合比率荧光探针对不同种生理物质（谷氨酸、乳糖、半乳糖、谷胱甘肽、甘氨酸、苏氨酸、组氨酸、半胱氨酸、赖氨酸）的选择性示意图，C为复合比率荧光探针对不同种无机离子（钾离子、钠离子、镁离子、锌离子、铁离子、碳酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子）的选择性示意图。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1：复合比率荧光探针的制备

（1）谷胱甘肽功能化的二硫化钼纳米片溶液的制备：

将0.121 g钼酸钠溶解于12.5 mL水，超声处理 5 min，用0.1 M HCl将溶液pH调至6.5；随后加入0.615 g谷胱甘肽和25 mL水，80 W超声处理10 min。将混合物转移至100 mL高压反应釜的特氟龙内衬中，200 ℃恒温加热24 h，待反应物冷却至室温后，10000 rpm离心10 min，用0.22 μm滤膜将上清液过滤，得到发射亮蓝色荧光的谷胱甘肽功能化二硫化钼纳米片溶液。

如图1透射电镜图所示，制备的二硫化钼纳米片大小分散均匀，没有聚集，粒径约为8~12 nm，X射线光电子能谱图也证明了的MoS₂ NPs成功合成。

（2）铕配位聚合物溶液的制备：

将2 mL 硝酸铕水溶液（10 mM）和含有Gmp（10 mM）的2 mL HEPES缓冲液混合，室温下搅拌2 h，8000 rpm离心5 min；用超纯水洗涤下层白色悬浮液，重复三次。最后将白色沉淀重新分散在2 mL HEPES缓冲液（10 mM，pH 7.4）中形成Gmp/Eu悬浮液，最终，2 mL Gmp/Eu悬浮液与2 mL柠檬酸（Cit）溶液（5 mM）混合即合成铕配位聚合物。

如图2透射电镜图所示，通过自组装制备的铕配位聚合物具有清晰的三维空间网状结构，X射线光电子能谱图也证明了铕离子与Gmp成功配位。

（3）复合比率荧光探针MoS₂ NPs@Gmp/Eu-Cit的制备：

向比色皿中加入10 μL MoS₂ NPs溶液，100 μL Gmp/Eu-Cit溶液，300 μL浓度为0.1M的HEPES缓冲液，以及超纯水，混合均匀后最终得到总体积为1000 μL 的复合测试体系。

实施例2：复合比率荧光探针的制备

（1）谷胱甘肽功能化的二硫化钼纳米片溶液的制备：

将0.121 g钼酸钠溶解于12.5 mL水，超声处理 5 min，用0.1 M HCl将溶液pH调至6.5；随后加入0.615 g谷胱甘肽和25 mL水，60W超声处理5 min。将混合物转移至100 mL高压反应釜的特氟龙内衬中，220 ℃恒温加热20h，待反应物冷却至室温后，10000 rpm离心12min，用0.22 μm滤膜将上清液过滤，得到发射亮蓝色荧光的谷胱甘肽功能化二硫化钼纳米片溶液。

（2）铕配位聚合物溶液的制备：

将2 mL 硝酸铕水溶液（10 mM）和含有Gmp（10 mM）的2 mL HEPES缓冲液混合，室温下搅拌1 h，8000 rpm离心5 min；用超纯水洗涤下层白色悬浮液，重复三次。最后将白色沉淀重新分散在2 mL HEPES缓冲液（10mM，pH 7.4）中形成Gmp/Eu悬浮液，最终，2 mL Gmp/Eu悬浮液与2 mL柠檬酸（Cit）溶液（5 mM）混合即合成铕配位聚合物。

（3）复合比率荧光探针MoS₂ NPs@Gmp/Eu-Cit的制备：

向比色皿中加入10 μL MoS₂ NPs溶液，100 μL Gmp/Eu-Cit溶液，300 μL浓度为0.1M的HEPES缓冲液，以及超纯水，混合均匀后最终得到总体积为1000 μL 的复合测试体系。

实施例3：复合比率荧光探针的制备

（1）谷胱甘肽功能化的二硫化钼纳米片溶液的制备：

将0.121 g钼酸钠溶解于12.5 mL水，100W超声处理8 min，用0.1 M HCl将溶液pH调至6.5；随后加入0.615 g谷胱甘肽和25 mL水，超声处理10 min。将混合物转移至100 mL高压反应釜的特氟龙内衬中，250 ℃恒温加热30 h，待反应物冷却至室温后，10000 rpm离心15 min，用0.22 μm滤膜将上清液过滤，得到发射亮蓝色荧光的谷胱甘肽功能化二硫化钼纳米片溶液。

（2）铕配位聚合物溶液的制备：

将2 mL 硝酸铕水溶液（10 mM）和含有Gmp（10 mM）的2 mL HEPES缓冲液混合，室温下搅拌3 h，8000 rpm离心5 min；用超纯水洗涤下层白色悬浮液，重复三次。最后将白色沉淀重新分散在2 mL HEPES缓冲液（10 mM，pH 7.4）中形成Gmp/Eu悬浮液，最终，2 mL Gmp/Eu悬浮液与2 mL柠檬酸（Cit）溶液（5 mM）混合即合成铕配位聚合物。

（3）复合比率荧光探针MoS₂ NPs@Gmp/Eu-Cit的制备：

向比色皿中加入10 μL MoS₂ NPs溶液，100 μL Gmp/Eu-Cit溶液，300 μL浓度为0.1M的HEPES缓冲液，以及超纯水，混合均匀后最终得到总体积为1000 μL 的复合测试体系。

实施例4：四环素检测标准曲线绘制

用超纯水配制1 M的四环素标准溶液，将四环素水溶液与实施例1所述的比率荧光探针MoS₂ NPs@Gmp/Eu-Cit混合后得到四环素浓度分别为0， 0.03， 0.1， 0.5， 1， 3， 5，10， 15， 20， 25， 30， 35， 40， 45， 50， 55， 60， 70， 80， 90， 100 μM的复合体系。在330 nm激发光下，记录在不同四环素浓度下复合体系在350~650 nm下的荧光光谱。

如图3 A所示，当没有四环素存在时，MoS₂ NPs@Gmp/Eu-Cit复合体系只发出MoS₂ NPs在430 nm下的蓝色荧光，随着四环素的加入，MoS₂ NPs由于內滤作用和光致能量电子转移作用蓝色荧光被淬灭。由于β-二酮结构的存在， 四环素自发地与Gmp/Eu-Cit螯合，将吸收紫外线激发的能量，通过天线效应迅速转移到Eu³⁺，进而敏化Eu³⁺在617 nm处的红色发光。图3 B是根据617 nm和430 nm处荧光强度比值F₆₁₇/F₄₃₀与四环素浓度变化拟合的校准曲线，对应的函数为Y=0.024 X + 0.0025，相关系数R² = 0.996，线性范围为0~100 μM。

实施例5：四环素半定量可视化检测

将实施例4中获得的在不同四环素浓度下比率荧光复合探针放置在紫外灯下，记录上述溶液对应的颜色信息；将颜色信号与四环素浓度分别对应，按照从小到大的顺序记录颜色变化，根据颜色信息可实现四环素的半定量可视化检测。在365 nm紫外光下，通过肉眼可以清晰地看到，添加不同浓度四环素浓度（0~100 μM）后，混合体系的荧光颜色从蓝色变到紫色，再渐变到红色（对应图4）。

实施例6：牛奶样品中四环素的检测分析

从当地食品药品管理局获得四环素污染的牛奶，将100 μL（20% V/V）的三氯乙酸加入到10 mL牛奶中，超声处理30 min，在10000 rpm下离心5 min，去除牛奶中的蛋白质和脂质，定容到100 mL，得到含有四环素的提取液；将提取液加入到实施例1所述的比率荧光探针MoS₂ NPs@Gmp/Eu-Cit中，反应1 min后放置在365 nm紫外灯下，观察到溶液颜色为浅紫色，与实施例4中的颜色进行对比可以初步判定溶液中四环素浓度在500~1000 nM。将上述溶液放置在荧光光谱仪中，在330 nm激发光下测定荧光光谱，得到荧光强度比值F₆₁₇/F₄₃₀，将得到的F₆₁₇/F₄₃₀带入到实施例4所述的拟合方程中得到牛奶中四环素含量为743 nM。

实施例7：复合比率荧光探针的特异性评估

本实施例中分别配制了抗生素类（四环素、氧四环素、环丙沙星、青霉素、阿奇霉素、氨苄西林、氟苯尼考和阿莫西林）、生理物质类（谷氨酸、乳糖、半乳糖、谷胱甘肽、甘氨酸、苏氨酸、组氨酸、半胱氨酸、赖氨酸）、无机离子类（钾离子、钠离子、镁离子、锌离子、铁离子、碳酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子）等标准溶液作为干扰物质测试评估复合比率荧光探针的特异性，浓度均为1 M。

将不同种抗生素分别加入到实施例1所述的复合荧光探针MoS₂ NPs@Gmp/Eu-Cit溶液中，最终抗生素的浓度均为50 μM。检测结果见图5 A，从图中可以看出，荧光探针只对四环素和四环素结构类似物氧四环素抗生素有响应。

将四环素分别与不同种的生理物质或者无机离子混合得到两者的混合液，将混合液分别加入到实施例1所述的复合荧光探针MoS₂ NPs@Gmp/Eu-Cit溶液中，最终复合体系中生理物质或者无机离子的浓度均为500 μM，四环素的浓度为50 μM。检测结果见图5 B和C，从图中可以看出，混合液的信号与四环素单独存在时的信号未观察到显著变化，说明该传感器具有良好的选择性。

所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种复合比率荧光探针，其特征在于，所述复合比率荧光探针基于谷胱甘肽功能化的二硫化钼纳米片掺杂铕配位聚合物得到；所述谷胱甘肽功能化的二硫化钼纳米片大小分散均匀；所述铕配位聚合物自组装制备得到，其具有清晰的三维空间网状结构；

所述铕配位聚合物的制备方法为：

将硝酸铕水溶液和含有鸟苷酸二钠的HEPES缓冲液混合，室温下搅拌、离心、洗涤，其中所述鸟苷酸二钠记为Gmp；然后将洗涤后的白色沉淀分散在HEPES缓冲液中形成Gmp/Eu悬浮液，将Gmp/Eu悬浮液与柠檬酸溶液混合得到所述铕配位聚合物，所述柠檬酸记为Cit。

2.一种复合比率荧光探针的制备方法，其特征在于，包括：

（1）谷胱甘肽功能化的二硫化钼纳米片的制备：

将钼酸钠溶液与谷胱甘肽溶液超声混合，然后将混合溶液恒温加热反应，反应结束后冷却、离心、过滤，得到所述谷胱甘肽功能化的二硫化钼纳米片，记为MoS₂ NPs；

（2）铕配位聚合物的制备：

将硝酸铕水溶液和含有鸟苷酸二钠的HEPES缓冲液混合，室温下搅拌、离心、洗涤，其中所述鸟苷酸二钠记为Gmp；然后将洗涤后的白色沉淀分散在HEPES缓冲液中形成Gmp/Eu悬浮液，将Gmp/Eu悬浮液与柠檬酸溶液混合，得到所述铕配位聚合物，记为Gmp/Eu-Cit，其中所述柠檬酸记为Cit；

（3）复合比率荧光探针的制备：

将MoS₂ NPs溶液，Gmp/Eu-Cit溶液，HEPES缓冲液混合均匀后即可得到复合比率荧光探针溶液，记为MoS₂ NPs@Gmp/Eu-Cit。

3.根据权利要求2所述的复合比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述混合溶液中钼酸钠和谷胱甘肽的质量比为1:2；所述恒温加热反应的条件为200~250 ℃，时间为20~30 h。

4.根据权利要求2所述的复合比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述硝酸铕水溶液和含有Gmp的HEPES缓冲液的体积比为1:1，其中硝酸铕水溶液的浓度为10mM，含有Gmp的HEPES缓冲液中Gmp的浓度为10 mM；

Gmp/Eu悬浮液与Cit溶液的体积比为1:1；其中，Gmp/Eu悬浮液的浓度为10 mM，Cit溶液的浓度为5 mM。

5.根据权利要求2所述的复合比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述搅拌的时间为1~3 h，所述的HEPES缓冲液浓度为0.1 M，pH = 7.4。

6.根据权利要求2所述的复合比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述MoS₂NPs溶液、Gmp/Eu-Cit溶液和HEPES缓冲液的体积比为1:10:30。

7.根据权利要求6所述的复合比率荧光探针的制备方法，其特征在于，所述MoS₂NPs溶液浓度为0.5-1mol/L，Gmp/Eu-Cit溶液浓度为2.5-5 mmol/L，HEPES缓冲液浓度为0.1 mol/L。

8.权利要求1所述的复合比率荧光探针在可视化检测四环素中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述可视化检测为半定量检测或定量检测。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用具体包括如下步骤：

（1）四环素检测标准曲线的绘制：

将四环素水溶液与MoS₂ NPs@Gmp/Eu-Cit混合得到荧光复合体系，通过荧光分析法拟合出四环素浓度的标准曲线，并记录荧光复合体系在紫外灯下的颜色情况；

（2）将待测样品与比率荧光复合体系混合后放置在紫外灯下，记录颜色信息，得到四环素浓度范围；然后检测混合液的荧光强度值，根据标准曲线得出四环素浓度。

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