CN110609133B - 一种检测癌胚抗原的荧光比率型光谱分析方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测癌胚抗原的荧光比率型光谱分析方法，属于光分析技术领域。本发明主要内容包括：长余辉纳米棒ZGO:Sr NRs的制备及其表面癌胚抗原适配体修饰以及ZGC@PDA纳米材料的制备，利用ZGC@PDA既作为参比信号又作为淬灭剂，以及可特异性识别癌胚抗原的检测探针ZGO:Sr NRs，构建一种可用于检测癌胚抗原的比率型光谱分析方法。该分析方法具有很好的准确度和稳定性。

Description

一种检测癌胚抗原的荧光比率型光谱分析方法及其应用
技术领域
本发明属于光分析技术领域，尤其是涉及一种检测癌胚抗原的荧光比率光谱分析技术。
背景技术
癌胚抗原(CEA)是对结肠癌和直肠癌进行早期诊断的常用肿瘤标志物，在大量临床实验的研究下，发现除了胃肠道的肿瘤能够使癌胚抗原的含量升高，其他一些癌症如乳腺癌、肺癌等也会引起血清中癌胚抗原浓度值的增大。所以说，癌胚抗原被认为是一种广谱性的生物标志物，尽管不能作为判断某种肿瘤疾病的特异性标志物，但是准确地检测体内癌胚抗原的含量水平在鉴别诊断恶性肿瘤、监测癌症病情、评价治疗疗效等诸多方面仍具有十分重要的研究价值。常见的检测癌胚抗原的方法有：放射免疫法(RIA)法；酶联免疫吸附试验(ELISA)；电化学免疫分析；化学发光免疫分析；比色免疫分析等。但是这些方法都存在不容忽视的缺点，例如辐射危害，耗时，成本高，灵敏度低，精度差，选择性和再现性差。因此，迫切需要开发更简便，高效和灵敏的检测方法。荧光传感器由于卓越的灵敏度，快速响应和多重检测能力而备受关注。
由于长余辉纳米材料可在无激发光的情况下持续发光，可避免自发光的干扰，近年来将长余辉纳米材料应用在分析检测、细胞成像、肿瘤治疗等方面的研究受到广泛关注。但目前利用余辉纳米材料构建的分析传感器大多基于单一发光信号的变化来评价待检测样品中目标物的含量，不能够避免检测环境中某些因素对发光强度的干扰。而比率型的传感器在检测时引入参比信号，有效避免了检测环境中某些因素对检测信号的干扰，使得检测结果更加稳定准确。
发明内容
本申请针对现有技术的不足，本发明提供了一种检测癌胚抗原的荧光比率型光谱分析方法。本发明构建的荧光比率传感器具有良好的发光稳定性和优异的选择性，灵敏度高、重现性好，在肿瘤标志物含量的检测方面具有很广阔的应用前景。
本发明的技术方案如下：
一种检测癌胚抗原的荧光比率型光谱分析方法，所述分析方法包括如下步骤：
(1)长余辉纳米棒ZGO:Sr NRs的制备及表面癌胚抗原适配体修饰：
①长余辉纳米棒ZGO:Sr NRs的制备：将Zn(NO3)2、Sr(NO3)2固体加入到8-12mL超纯水中混合搅拌均匀，并加入200-400μL浓HNO3，混合均匀后得到溶液1，随后将1-3mL Na2GeO3溶液逐滴加入到上述所得溶液1中，用氨水调节溶液的pH值至7-11；在室温下搅拌1-2h后转入聚四氟乙烯水热反应釜中，在200-240℃下加热4-6h，升温速率为2-4℃/min；冷却至室温后，通过离心收集下层沉淀物，沉淀用超纯水至少洗涤三次，最后干燥研磨即得长余辉纳米棒ZGO:Sr NRs粉末；
②长余辉纳米棒ZGO:Sr NRs的氨基化：将上述所得ZGO:Sr NRs粉末分散于NaOH溶液中，室温下剧烈搅拌10-14h；离心收集下层沉淀，将其分散在N,N-二甲基甲酰胺试剂中，然后逐滴加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)试剂，在70-90℃水浴中加热搅拌24-26h，反应结束后离心收集产物，并均匀分散在超纯水中，得到氨基化ZGO:Sr NRs溶液；
③表面癌胚抗原适配体修饰：使用PBS缓冲溶液将癌胚抗原适配体(CEA-Apta)稀释，之后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液(EDC/NHS)孵育30-40min，孵育完成后加入步骤②中所得氨基化的ZGO:Sr NRs溶液，并在室温下振荡孵育5-6h，反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水至少清洗三次，最后将沉淀物重新均匀分散在PBS缓冲溶液中，即得浓度为0.6-1mg/mL的检测探针ZGO:Sr/CEA-Apta溶液；
(2)ZGC@PDA的制备：
①将Ga(NO3)3、Zn(NO3)2与Cr(NO3)3溶解在超纯水中剧烈搅拌混匀，用氨水调节溶液的pH值至7-11，搅拌30-50min后转入水热反应釜中，在200-240℃下反应10-12h后冷却至室温，离心分离取沉淀物，将沉淀物用超纯水洗涤，并置于烘箱中80-90℃下干燥4-6h并研磨，再转入坩埚中退火处理，待自然冷却后再次研磨至粉末，并分散溶解在超纯水中，即得ZGC NPs溶液；
②将步骤①中所得ZGC NPs溶液用Tris-HCl缓冲液稀释，在搅拌状态下，加入盐酸多巴胺溶液，室温下避光反应1-2h，反应结束离心取下层沉淀物，并用超纯水洗涤三次以上，最后将沉淀物重新分散在超纯水中，即得浓度为0.6-1mg/mL的ZGC@PDA溶液；
(3)癌胚抗原荧光比率型光谱分析方法构建：
将步骤(1)中所得ZGO:Sr/CEA-Apta溶液与步骤(2)中所得ZGC@PDA溶液在PBS缓冲液中搅拌混匀，并在室温下孵育2-3h，得到ZGO:Sr/CEA-Apta-ZGC@PDA混合溶液，将上述混合溶液分别等体积加入到具有不同浓度梯度的等体积的癌胚抗原(CEA)标准溶液中，室温下振荡孵育5-6h，之后使用254nm紫外灯照射，通过荧光光谱仪测试每组溶液的发光光谱，建立以癌胚抗原适配体(CEA-Apta)浓度对数为横坐标，以检测探针ZGO:Sr/CEA-Apta的恢复发光强度与参比探针ZGC@PDA的发光强度之间的比值为纵坐标的标准曲线。
步骤(1)①中所述浓硝酸的浓度为14-16mol/L；Na2GeO3溶液的浓度为0.02-0.1g/mL；其中，Zn(NO3)2与Sr(NO3)2的摩尔质量比为1.8-2.2:0.004-0.006。
步骤(1)②所述NaOH溶液浓度为4-6mM；所述ZGO:Sr NRs粉末与NaOH溶液的用量比为8-12mg:3-5mL；所述N,N-二甲基甲酰胺溶剂与3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES溶液体积比为3-5:0.020-0.080。
步骤(1)③中所述癌胚抗原适配体CEA-Apta稀释后的浓度为5-15μM；所述PBS缓冲溶液的浓度为8-12mM，pH为7-8；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液EDC/NHS浓度为55-65mM；所述稀释后癌胚抗原适配体CEA-Apta溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液和氨基化的ZGO:SrNRs溶液体积比为22-27:5-7:4-6。
步骤(2)①中所述Ga(NO3)3、Zn(NO3)2与Cr(NO3)3的质量比为0.4-0.6:0.2-0.4:0.001-0.003；所述退火条件为加热温度700-800℃，加热时间4-5h。
步骤(2)②中所述Tris-HCl缓冲液pH为8-9；ZGC NPs溶液与Tris-HCl缓冲液的体积比为0.2-0.4:1-2；所述盐酸多巴胺的浓度为4-35mg/mL。
步骤(3)中所述PBS缓冲液浓度为8-12mM，pH为7-8。
所述ZGO:Sr/CEA-Apta溶液、ZGC@PDA溶液与PBS缓冲液的体积比为：10-30μL:100-120μL:200-300μL。
步骤(3)中所述检测探针ZGO:Sr/CEA-Apta的恢复发光强度等于存在不同浓度梯度癌胚抗原CEA的检测探针的发光强度与不存在癌胚抗原CEA时检测探针的发光强度之差。
所述荧光比率型光谱分析方法应用于癌胚抗原的检测。
本发明有益的技术效果在于：
本发明提出的一种检测癌胚抗原的比率型光谱分析方法具有很高的灵敏度和特异性，本方法检测癌胚抗原无需激发光源直接照射，可以消除检测环境中自体荧光的背景干扰，大大提高了检测的灵敏度；通过引入ZGC@PDA既作为参比信号又作为淬灭剂，可以消除检测过程中某些不确定因素对检测信号的影响，进一步提高了检测的准确度和稳定性。
本发明将锶元素掺杂在锗酸锌(Zn2GeO4)基质中制备出具有蓝色发射的长余辉纳米棒，记作ZGO:Sr NRs，以其发光信号作为检测信号来反映目标物的含量变化。ZGC@PDANPs的制备方法是在近红外发射的长余辉纳米粒子ZGC NPs表面生长聚多巴胺，该结构既以ZGC NPs的发光信号为参比信号，又以PDA NPs的淬灭能力作为淬灭剂，设计出比率型的发光传感器用于癌胚抗原的检测，提高了检测的准确性和稳定性。
采用蓝色发射的长余辉纳米棒ZGO:Sr NRs作为发光材料，通过羧基与氨基之间形成酰胺共价键的方式将CEA-Apta连接在ZGO:Sr NRs表面，制备出可特异性识别癌胚抗原的检测探针。将Cr掺杂的近红外发射的长余辉纳米粒子ZGC NPs做为参比发光信号，并在其表面引发多巴胺聚合制备出兼具发光和淬灭能力的ZGC@PDA。当无CEA存在时，适配体修饰的ZGO:Sr NRs会由于“π-π堆积作用”吸附在ZGC@PDA表面，做为检测信号的ZGO:Sr NRs的发光被淬灭；当存在CEA时，由于目标物与检测探针的特异性识别使检测探针从ZGC@PDA表面脱离从而使检测信号的发光得到恢复。据此开发出一种可以用于监测CEA含量的比率荧光检测方法，该方法能够有效消除自体荧光干扰以及检测过程中某些不确定因素对检测信号的影响，具有较高的灵敏度和特异性。
附图说明
图1是实施例2中制备得到的长余辉纳米棒ZGO:Sr NRs的TEM图；
图2是实施例2中制备得到的ZGC@PDA NPs纳米粒子的紫外可见吸收光谱；
图3是实施例2中制备得到的ZGC@PDA NPs纳米粒子的发光光谱；
图4是实施例2中检测癌胚抗原的比率荧光适配体传感器的原理示意图；
图5测试例1中存在不同浓度的癌胚抗原时，比率荧光传感器的荧光光谱和标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1
一种检测癌胚抗原的荧光比率型光谱分析方法，所述分析方法包括如下步骤：
(1)ZGO:Sr NRs的合成及表面CEA-Apta修饰：
①将0.5g Zn(NO3)2，0.0008g Sr(NO3)2固体加入到8mL超纯水中混合搅拌均匀，并加入200μL浓度为14mol/L的浓HNO3混合均匀后形成无色透明的溶液1；随后将1mL浓度为0.02g/mL Na2GeO3溶液逐滴加入到上述无色透明溶液1中，通过加入氨水调节溶液的pH值至7，溶液由澄清逐渐变为白色浑浊。在室温下连续快速搅拌1h后转入聚四氟乙烯水热反应釜中升温至200℃下加热4h，升温速率为2℃/min，冷却至室温后，通过离心收集下层沉淀物，沉淀用超纯水洗涤三次，最后干燥研磨得长余辉纳米棒ZGO:Sr NRs粉末；
②将上述所得8mg的ZGO:Sr NRs粉末分散于3mL浓度为4mM的NaOH溶液中，室温下剧烈搅拌10h；离心收集下层沉淀，将其分散在3mL N,N-二甲基甲酰胺试剂中，然后逐滴加入20μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)试剂，在70℃水浴中加热搅拌24h，反应结束后离心收集产物，并均匀分散在2mL超纯水中，得到浓度为4mg/mL氨基化ZGO:Sr NRs溶液；
③使用PBS缓冲溶液将癌胚抗原适配体CEA-Apta稀释至5μM，之后加入50μL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液(EDC/NHS)孵育30min，孵育完成后加入步骤②中所得氨基化的ZGO:Sr NRs溶液，并在室温下振荡孵育5h，反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水清洗三次，最后将沉淀物重新均匀分散在200μL PBS缓冲溶液(浓度为8mM，pH为7)中，即得浓度为0.6mg/mL的ZGO:Sr/CEA-Apta溶液。
(2)ZGC@PDA的合成及尺寸调控：0.4g Ga(NO3)3和0.2g Zn(NO3)2与0.001g Cr(NO3)3在14mL超纯水中剧烈搅拌混合均匀。接着，向上述溶液中快速加入NH3·H2O来调节溶液的pH到7，原本无色澄清的溶液变成白色浑浊。此溶液在室温下剧烈搅拌30min后转入洁净的水热反应釜中，在200℃反应10h后自然冷却至室温。离心分离取白色沉淀，超纯水洗涤后在80℃烘箱中放置4h至完全干燥并研磨，再转入坩埚中退火处理(退火条件：700℃，4h)，待自然冷却后再次研磨至粉末，分散在6mL超纯水中备用，由此得到了具有强近红外发射的零维长余辉纳米粒子(ZGC NPs)。
将合成的200μL ZGC NPs超声分散在1mL Tris-HCl(pH 8)缓冲液中。在剧烈搅拌状态下，将浓度为4mg/mL的盐酸多巴胺溶液转入到ZGC NPs的Tris-HCl分散液中，室温下避光反应1h。然后离心收集下层棕黑色沉淀即为ZGC@PDA，用超纯水洗涤三次后重新分散在200μL超纯水中备用。
(3)癌胚抗原比率型光谱分析方法构建：将步骤(1)中所得10μL ZGO:Sr/CEA-Apta溶液与步骤(2)中所得100μL ZGC@PDA在200μL PBS缓冲液中搅拌混合均匀，并在室温下孵育2h，得到ZGO:Sr/CEA-Apta与ZGC@PDA的混合液。为了得到标准曲线，将配置好的一系列浓度为0pg/mL、0.1pg/mL、0.5pg/mL、1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL的癌胚抗原CEA标准溶液分别加入到上述混合液中，室温下振荡孵育5h，随后使用254nm紫外灯照射10min，通过荧光光谱仪(F7000)测试每组溶液的发光光谱，每组溶液测三次，得到了检测探针ZGO:Sr/CEA-Apta的恢复发光强度与参比探针ZGC@PDA的发光强度F696之间的比值和癌胚抗原CEA浓度间的标准曲线，其中恢复发光强度是指存在不同浓度梯度CEA的检测探针的发光强度F与不存在CEA时检测探针的发光强度F0之差。
实施例2
一种检测癌胚抗原的荧光比率型光谱分析方法，所述分析方法包括如下步骤：
(1)ZGO:Sr NRs的合成及CEA-Apta修饰：
①将0.6g Zn(NO3)2，0.001g Sr(NO3)2固体加入到10mL超纯水中混合搅拌均匀，并加入300μL浓度为15mol/L的浓HNO3混合均匀后形成无色透明的溶液1，随后将2mL浓度为0.06g/mL Na2GeO3溶液逐滴加入到上述无色透明溶液1中，通过加入氨水调节溶液的pH值至9，溶液由澄清逐渐变为白色浑浊。在室温下连续快速搅拌1.5h后转入聚四氟乙烯水热反应釜中升温至220℃下加热5h，升温速率为3℃/min，冷却至室温后，通过离心收集下层沉淀物，沉淀用超纯水洗涤三次，最后干燥研磨得长余辉纳米棒ZGO:Sr NRs粉末。得到的ZGO:SrNRs的TEM如图1所示。
②将上述所得10mg的ZGO:Sr NRs粉末分散于4mL浓度为5mM的NaOH溶液中，室温下剧烈搅拌12h；离心收集下层沉淀，将其分散在4mL N,N-二甲基甲酰胺试剂中，然后逐滴加入50μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)试剂，在80℃水浴中加热搅拌25h，反应结束后离心收集产物，并均匀分散在3mL超纯水中，得到浓度为3.5mg/mL氨基化ZGO:Sr NRs溶液；
③使用PBS缓冲溶液将癌胚抗原适配体CEA-Apta稀释至10μM，之后加入60μL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液(EDC/NHS)孵育35min，孵育完成后加入步骤②中所得氨基化的ZGO:Sr NRs溶液，并在室温下振荡孵育5.5h，反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水清洗三次，最后将沉淀物重新均匀分散在250μL PBS缓冲溶液(浓度为8-12mM，pH 7-8)中，即得浓度为0.8mg/mL的ZGO:Sr/CEA-Apta溶液。
(2)ZGC@PDA的合成及尺寸调控：0.5g Ga(NO3)3和0.3g Zn(NO3)2与0.002g Cr(NO3)3在17mL超纯水中剧烈搅拌混合均匀。接着，向上述溶液中快速加入NH3·H2O来调节溶液的pH到9，原本无色澄清的溶液变成白色浑浊。此溶液在室温下剧烈搅拌40min后转入洁净的水热反应釜中，在220℃反应11h后自然冷却至室温。离心分离取白色沉淀，超纯水洗涤后在85℃烘箱中放置5小时至完全干燥并研磨，再转入坩埚中退火处理(退火条件：750℃，4.5h)，待自然冷却后再次研磨至粉末，分散在8mL超纯水中备用，由此得到了具有强近红外发射的零维长余辉纳米粒子(ZGC NPs)。
将合成的300μL ZGC NPs超声分散在1.5mL Tris-HCl(pH为8.5)缓冲液中。在剧烈搅拌下状态下，将的浓度为20mg/mL盐酸多巴胺溶液转入到ZGC NPs的Tris-HCl分散液中，室温下避光反应1.5h。然后离心收集下层棕黑色沉淀即为ZGC@PDA，用超纯水洗涤三次后重新分散在250μL超纯水中备用。
(3)ZGC@PDA的荧光性质及淬灭能力测试：将上述制得的120μL ZGC NPs的Tris-HCl溶液分别与0μL，21μL，63μL，125μL，250μL盐酸多巴胺溶液混合，室温下避光反应1.5h，然后离心收集下层棕黑色沉淀即为ZGC@PDA。采用紫外可见分光光度计测得ZGC@PDA的紫外吸收曲线，如图2所示。采用荧光分光光度计测试ZGC@PDA的荧光光谱，如图3所示。上述结果表明随着PDA量的增加，ZGC NPs的发光强度逐渐降低，ZGC@PDA的淬灭能力也逐渐增强。
(4)癌胚抗原比率型光谱分析方法构建：将步骤(1)中所得20μL ZGO:Sr/CEA-Apta溶液与步骤(2)中所得110μL ZGC@PDA在250μL PBS缓冲液中搅拌混合均匀，并在室温下孵育2.5h，得到ZGO:Sr/CEA-Apta与ZGC@PDA的混合液。为了得到标准曲线，将配置好的一系列浓度为0pg/mL、0.1pg/mL、0.5pg/mL、1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL的癌胚抗原CEA标准溶液分别加入到上述混合液中，室温下振荡孵育5.5h，随后使用254nm紫外灯照射10min，通过荧光光谱仪(F7000)测试每组溶液的发光光谱，每组溶液测三次，得到了检测探针ZGO:Sr/CEA-Apta的恢复发光强度与参比探针ZGC@PDA的发光强度F696之间的比值和癌胚抗原CEA浓度间的标准曲线，其中恢复发光强度是指存在不同浓度梯度CEA的检测探针的发光强度F与不存在CEA时检测探针的发光强度F0之差。
实施例3
一种检测癌胚抗原的荧光比率型光谱分析方法，所述分析方法包括如下步骤：
(1)ZGO:Sr NRs的合成及CEA-Apta修饰：
①将0.7g Zn(NO3)2,0.0012g Sr(NO3)2固体加入到12mL超纯水中混合搅拌均匀，并加入400μL浓度为16mol/L浓HNO3混合均匀后形成无色透明的溶液1，随后将,3mL浓度为0.1g/mL Na2GeO3溶液逐滴加入到上述无色透明溶液1中，通过加入氨水调节溶液的pH值至11，溶液由澄清逐渐变为白色浑浊。在室温下连续快速搅拌2h后转入聚四氟乙烯水热反应釜中升温至240℃下加热6h，升温速率为4℃/min。冷却至室温后，通过离心收集下层沉淀物，沉淀用超纯水洗涤三次，最后干燥研磨得长余辉纳米棒ZGO:Sr NRs粉末。
②将上述所得12mg的ZGO:Sr NRs粉末分散于5mL浓度为6mM的NaOH溶液中，室温下剧烈搅拌14h；离心收集下层沉淀，将其分散在5mL N,N-二甲基甲酰胺试剂中，然后逐滴加入80μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)试剂，在90℃水浴中加热搅拌26h，反应结束后离心收集产物，并均匀分散在4mL超纯水中，得到浓度为3mg/mL氨基化ZGO:Sr NRs溶液；
③使用PBS缓冲溶液将癌胚抗原适配体CEA-Apta稀释至15μM，之后加入70μL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液(EDC/NHS)孵育40min，孵育完成后加入步骤②中所得氨基化的ZGO:Sr NRs溶液，并在室温下振荡孵育6h，反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水清洗三次，最后将沉淀物重新均匀分散在300μL PBS缓冲溶液(浓度为8-12mM，pH7-8)中，即得浓度为1mg/mL的ZGO:Sr/CEA-Apta溶液。
(2)ZGC@PDA的合成及尺寸调控：0.6g Ga(NO3)3和0.4g Zn(NO3)2与0.003g Cr(NO3)3在20mL超纯水中剧烈搅拌混合均匀。接着，向上述溶液中快速加入NH3·H2O来调节溶液的pH到11，原本无色澄清的溶液变成白色浑浊。此溶液在室温下剧烈搅拌50min后转入洁净的水热反应釜中，在240℃反应12h后自然冷却至室温。离心分离取白色沉淀，超纯水洗涤后在90℃烘箱中放置6h至完全干燥并研磨，再转入坩埚中退火处理(退火条件：800℃，5h)，待自然冷却后再次研磨至粉末，分散在10mL超纯水中备用，由此得到了具有强近红外发射的零维长余辉纳米粒子(ZGC NPs)。
将合成的400μL ZGC NPs超声分散在2mL Tris-HCl(pH为9)缓冲液中。在剧烈搅拌下状态下，将浓度为35mg/mL的盐酸多巴胺溶液转入到ZGC NPs的Tris-HCl分散液中，室温下避光反应2h。然后离心收集下层棕黑色沉淀即为ZGC@PDA，用超纯水洗涤三次后重新分散在300uL超纯水中备用。
(3)癌胚抗原比率型光谱分析方法构建：将步骤(1)中所得30μL ZGO:Sr/CEA-Apta溶液与步骤(2)中所得120μL ZGC@PDA在300μL PBS缓冲液中搅拌混合均匀，并在室温下孵育3h，得到ZGO:Sr/CEA-Apta与ZGC@PDA的混合液。为了得到标准曲线，将配置好的一系列浓度为0pg/mL、0.1pg/mL、0.5pg/mL、1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL的癌胚抗原CEA标准溶液分别加入到上述混合液中，室温下振荡孵育6h，随后使用254nm紫外灯照射10min，通过荧光光谱仪(F7000)测试每组溶液的发光光谱，每组溶液测三次，得到了检测探针ZGO:Sr/CEA-Apta的恢复发光强度与参比探针ZGC@PDA的发光强度F696之间的比值和癌胚抗原CEA浓度间的标准曲线，其中恢复发光强度是指存在不同浓度梯度CEA的检测探针的发光强度F与不存在CEA时检测探针的发光强度F0之差。
测试例
1、癌胚抗原的检测：将准备好的50μL浓度分别为0.1pg/mL、0.5pg/mL、1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL的癌胚抗原标准溶液加入到实施例2中制备得到的ZGO:Sr/CEA-Apta与ZGC@PDA混合液中，室温下振荡孵育5.5h后，经过254nm紫外灯照射10min，测试每组溶液的发光光谱及发光强度，每组溶液测三次，实验结果说明，来自ZGO:Sr/CEA-Apta的检测信号的恢复发光强度(F-F0)与来自ZGC@PDA的参比信号(F696)和CEA的浓度对数值在0.5pg/mL至100pg/mL的浓度范围内呈现良好的线性关系，如图5所示。
2、检测方法的特异性研究：用实施例2中制备得到的20μL ZGO:Sr/CEA-A与110μLZGC@PDA加入250μL PBS缓冲液(10mM，pH 7.4)中在室温下孵育2.5h。将浓度为200pg/mL的不同干扰物质包括AFP、PSA、CA 125、Ig G、凝血酶、缬氨酸、赖氨酸、精氨酸、L-半胱氨酸、色氨酸、组氨酸、GSH分别与浓度为10pg/mL的癌胚抗原混匀后加入到检测体系中，在室温下振荡5.5h。经过254nm紫外灯照射10min，测试每组溶液的发光光谱及发光强度，每组溶液测三次。当不存在干扰物时，(F-F0)/F696为0.5；在添加了干扰物质的情况下，传感器的发光没有受到明显影响，(F-F0)/F696维持在0.5左右。由此表明本方法具有很高的特异性适用于CEA的特异性检测。
3、检测方法的准确性研究：2mL正常人血液在转速为400rpm的情况离心处理5min后吸取上层血清，体积为1mL。用PBS溶液将血清稀释到2mL。样品1，样品2，样品3，样品4和样品5的人血清中CEA标准样品的浓度分别为2pg/mL，20pg/mL，40pg/mL和80pg/mL。将50μL制备好的加标血清试样分别加入到实施例2的检测体系中，室温下振荡孵育5h。经过254nm紫外灯照射10min，测试每组溶液的发光光谱及发光强度，每组溶液测三次。血清中CEA的回收率在97.5％-99.1％的范围内。这一实验结果表明了本方法具有很高的准确性，能够应用于实际样品中CEA的灵敏检测。

Claims (10)

1.一种检测癌胚抗原的荧光比率型光谱分析方法，其特征在于，所述分析方法包括如下步骤：
（1）长余辉纳米棒ZGO:Sr NRs的制备及表面癌胚抗原适配体修饰：
①长余辉纳米棒ZGO:Sr NRs的制备：将Zn(NO3)2、Sr(NO3)2固体加入到8-12 mL超纯水中混合搅拌均匀，并加入200-400 μL浓HNO3，混合均匀后得到溶液1，随后将1-3 mL Na2GeO3溶液逐滴加入到上述所得溶液1中，用氨水调节溶液的pH值至7-11；在室温下搅拌1-2h后转入聚四氟乙烯水热反应釜中，在200-240℃下加热4-6h，升温速率为2-4 ℃/min；冷却至室温后，通过离心收集下层沉淀物，沉淀用超纯水至少洗涤三次，最后干燥研磨即得长余辉纳米棒ZGO:Sr NRs粉末；
②长余辉纳米棒ZGO:Sr NRs的氨基化：将上述所得ZGO:Sr NRs粉末分散于NaOH溶液中，室温下剧烈搅拌10-14h；离心收集下层沉淀，将其分散在N, N-二甲基甲酰胺试剂中，然后逐滴加入3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES试剂，在70-90 ℃水浴中加热搅拌24-26h，反应结束后离心收集产物，并均匀分散在超纯水中，得到氨基化ZGO:Sr NRs溶液；
③表面癌胚抗原适配体修饰：使用PBS缓冲溶液将癌胚抗原适配体CEA-Apta稀释，之后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液EDC/NHS孵育30-40 min，孵育完成后加入步骤②中所得氨基化的ZGO:Sr NRs溶液，并在室温下振荡孵育5-6 h，反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水至少清洗三次，最后将沉淀物重新均匀分散在PBS缓冲溶液中，即得浓度为0.6-1 mg/mL的检测探针ZGO:Sr/CEA-Apta溶液；
（2）ZGC@PDA的制备：
①将Ga(NO3)3、 Zn(NO3)2与Cr(NO3)3溶解在超纯水中剧烈搅拌混匀，用氨水调节溶液的pH值至7-11，搅拌30-50min后转入水热反应釜中，在200-240 ℃下反应10-12h后冷却至室温，离心分离取沉淀物，将沉淀物用超纯水洗涤，并置于烘箱中80-90℃下干燥4-6h并研磨，再转入坩埚中退火处理，待自然冷却后再次研磨至粉末，并分散溶解在超纯水中，即得ZGCNPs溶液；
②将步骤①中所得ZGC NPs溶液用Tris-HCl缓冲液稀释，在搅拌状态下，加入盐酸多巴胺溶液，室温下避光反应1-2h，反应结束离心取下层沉淀物，并用超纯水洗涤三次以上，最后将沉淀物重新分散在超纯水中，即得浓度为0.6-1mg/mL的ZGC@PDA溶液；
（3）癌胚抗原荧光比率型光谱分析方法构建：
将步骤（1）中所得ZGO:Sr/CEA-Apta 溶液与步骤（2）中所得ZGC@PDA溶液在PBS缓冲液中搅拌混匀，并在室温下孵育2-3 h，得到ZGO:Sr/CEA-Apta-ZGC@PDA混合溶液，将上述混合溶液分别等体积加入到具有不同浓度梯度的等体积的癌胚抗原CEA标准溶液中，室温下振荡孵育5-6h，之后使用254nm紫外灯照射，通过荧光光谱仪测试每组溶液的发光光谱，建立以癌胚抗原适配体CEA-Apta浓度对数为横坐标，以检测探针ZGO:Sr/CEA-Apta的恢复发光强度与参比探针ZGC@PDA的发光强度之间的比值为纵坐标的标准曲线。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤（1）①中所述浓硝酸的浓度为14-16 mol/L；Na2GeO3溶液的浓度为0.02-0.1 g/mL；其中，Zn(NO3)2与Sr(NO3)2的摩尔质量比为1.8-2.2:0.004-0.006。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤（1）②所述NaOH溶液浓度为4-6mM；所述ZGO:Sr NRs粉末与NaOH溶液的用量比为8-12mg:3-5mL；所述N, N-二甲基甲酰胺溶剂与3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES溶液体积比为3-5 :0.020-0.080。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤（1）③中所述癌胚抗原适配体CEA-Apta稀释后的浓度为5-15 μM；所述PBS缓冲溶液的浓度为8-12 mM，pH为7-8；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液EDC/NHS浓度为55-65mM；所述稀释后癌胚抗原适配体CEA-Apta溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液和氨基化的ZGO:Sr NRs溶液体积比为22-27:5-7:4-6。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤（2）①中所述Ga(NO3)3、Zn(NO3)2与Cr(NO3)3的质量比为0.4-0.6: 0.2-0.4:0.001-0.003；所述退火条件为加热温度700-800℃，加热时间4-5 h。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤（2）②中所述Tris-HCl缓冲液pH为8-9；ZGC NPs溶液与Tris-HCl缓冲液的体积比为0.2-0.4:1-2；所述盐酸多巴胺的浓度为4-35mg/mL。
7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤（3）中所述PBS缓冲液浓度为8-12mM，pH为7-8。
8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述ZGO:Sr/CEA-Apta 溶液、ZGC@PDA溶液与PBS缓冲液的体积比为：10-30 μL:100-120 μL :200-300μL。
9.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤（3）中所述检测探针ZGO:Sr/CEA-Apta的恢复发光强度等于存在不同浓度梯度癌胚抗原CEA的检测探针的发光强度与不存在癌胚抗原CEA时检测探针的发光强度之差。
10.一种权利要求1所述的荧光比率型光谱分析方法的应用，其特征在于，所述荧光比率型光谱分析方法应用于癌胚抗原的检测，所述检测不以疾病诊断治疗为目的。
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