CN109781687A - 一种复合荧光纳米探针的制备方法及其体内应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及荧光纳米探针的制备方法和体内应用,包括以下步骤(a)借助DNA杂交反应,制备可特异性识别目标生物毒素的长余辉‑硫化铜复合纳米荧光探针;(b)通过适配体选择性识别,实现纳米探针对于目标生物毒素的体内靶向识别和活体荧光成像监控。本发明的有益效果在于:本发明所制备的长余辉‑硫化铜复合纳米探针具有优异的选择性识别目标毒素的能力,融合了长余辉纳米发光材料的超强近红外发光和超长余辉寿命、优异的生物相容性和结构稳定性、良好的粒径均一度和低毒性的特质,以及硫化铜纳米粒子合成简便、结构稳定和低毒性的特点,适合于活体靶向荧光成像和体内示踪。
Description
技术领域
本发明属于荧光纳米探针的研究领域,涉及复合荧光纳米探针的制备方法及其体内应用。
背景技术
食品安全是目前全球关注的一大热点问题,随着经济增长和人口增加而日趋严重。食品安全是一门讨论在食品加工、储存、销售等过程中确保食品卫生及食用安全,降低疾病隐患,防范食物中毒的跨学科领域。目前食品安全已然成为人类健康的重大威胁,也是全社会普遍关注的热点问题。近年来随着我国食品供应和消费的快速增长,重大食品安全事件频发,食品安全问题越来越突出。由于一系列食品原料的化学污染、畜牧业中抗生素的应用、基因工程技术的应用,使食品污染导致的食源性疾病呈上升趋势。此外,食品生产和加工工艺创新的同时也带来了新的危害。目前,食品安全问题主要集中在以下几方面:微生物危害、重金属污染、农药兽药残留、添加剂超标、加工贮藏包装过程危害物、持久性有机污染物、生物毒素和食品掺假等。其中,以黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素、赭曲霉毒素等为代表的生物毒素具有很强的诱导突变、抑制免疫和致癌作用,可污染谷物、花生、玉米、油籽等多种粮食和饲料,已经成为影响食品安全、危害人类和动物健康的巨型杀手。
对于现代分析化学来说,开发先进、可靠、高效的食品安全检测方法是解决日益严峻的食品安全问题的重中之重。越来越多的研究者致力于通过开发先进的研究方法和研究理念探究食品中的有害物质与人类健康的科学关系,其中明确食品中的有害物质在人体内的代谢转化过程和危害作用机理可以为食品安全研究提供更加直观可靠的信息。近年来,随着纳米材料学、免疫学、分子生物学等不断发展,各种基于功能纳米材料的传感检测手段被应用于生物毒素的精准检测中,包括荧光传感、比色探针、表面增强拉曼检测、电化学传感等,实现对于不同样品中目标毒素的高灵敏度高选择性检测,方法操作简便快速且成本低。然而,以上检测方法主要针对体外样品分析,尚无法实现对于食源性有害物质在人体内分布代谢行为的定性定量分析。发展实时无损的检测手段,可以实现对于摄入生物体内的食源性毒素的原位监测和实时追踪,进而为深入探究生物毒素的致病机理和行为调控提供有力的支撑,并最终实现对于生物毒素相关疾病的预防和诊疗,对于揭示食品安全与人类健康的科学关系、推动高效的检测和评价手段的开发具有重要的指导意义和社会价值。
发明内容
针对以上研究方法需求和领域空白,我们引入了荧光成像技术。荧光成像作为探索肿瘤早期诊断治疗的关键技术,是现今生物医学领域和现代分析科学中的前沿方法,尤其是采用无创成像和微创体内生物成像在活体水平上非侵入式监测肿瘤的发生发展,对于癌症的预防和早期诊疗具有重要的生命医学研究意义和临床应用价值。将这种无创成像技术应用到食源性生物毒素体内研究中,可以充分发挥荧光成像实时无损监测的优势,进而可以系统性的研究生物毒素进入生物体后的分布状况和致病行为。
本研究以食源性生物毒素为研究对象,借助DNA杂交反应构建以长余辉纳米材料(PLNPs)为发光中心、硫化铜纳米粒子(CuS)为淬灭剂的可激活复合纳米探针,通过二者之间的荧光共振能量转移过程(FRET)和适配体的选择性识别,建立对于目标生物毒素的特异性检测方法,进而借助近红外长余辉纳米材料可体外激发及优异的生物相容性和光学稳定性,进一步实现PLNPs-CuS可激活复合纳米探针在活体内的选择性识别生物毒素的荧光成像技术,实时无损的原位监测生物毒素在生物体内的代谢分布行为。本发明旨在首次将活体生物成像技术引入到食品科学研究领域中,将生物成像技术独具的实时监控和无损检测的优势以及稀土纳米材料的长余辉发光和优异的生物相容性和理化稳定性的特点相结合,实现对于生物毒素的体内识别和监控,能够为食源性生物毒素的致病机理的研究开辟新方法,并有望拓展创新性和先进性的食品安全和营养学分析方法和研究理念,对于进一步明确食品中的危害物质在人体内的代谢转化过程和危害作用机理和推动基于先进功能材料的分析化学方法学在食品安全和人类健康科学中的应用具有重要的先导意义。
本发明提供的具体技术方案是:
一种复合荧光纳米探针的制备方法和体内应用,包括如下步骤:
(a)借助DNA杂交反应,制备可特异性识别目标生物毒素的长余辉-硫化铜复合纳米荧光探针。
(b)通过适配体选择性识别,实现纳米探针对于目标生物毒素的体内靶向识别和活体荧光成像监控。
进一步,所述步骤(a)借助DNA杂交反应,制备可特异性识别目标生物毒素的长余辉-硫化铜复合纳米荧光探针的过程如下:
(1)长余辉纳米发光材料的制备:精准称取1.4874g的Zn(NO3)2·6H2O固体放入50mL圆底烧瓶中,加入提前配置好的10mL Ga(NO3)3溶液(0.6M),搅拌,待Zn(NO3)2充分溶解后,依次加入300μL Cr(NO3)3溶液(0.1M),1500μL Yb(NO3)3溶液(0.1M),150μL Er(NO3)3溶液(0.1M)和10mL锗酸铵溶液(0.1M)混合搅拌,并调节pH,发生共沉淀反应得到反应液,反应液转移到反应釜中120℃条件下溶剂热反应24小时后,产物离心洗涤并使用玛瑙研钵粗研后于750℃条件下煅烧反应5小时得到长余辉材料PLNPs;
(2)长余辉纳米材料的表面功能化:在10mM,pH 7.4磷酸缓冲溶液体系中,将羧基修饰的适配体单链DNA(采购)通过与步骤(1)得到的长余辉纳米发光材料PLNPs表面的氨基在催化剂作用下反应,修饰到长余辉纳米发光材料表面;
(3)硫化铜纳米材料的制备及功能化:将一定量的硝酸铜和柠檬酸钠溶解于水中制成250mL的混合溶液,再将250μL,1M的硫酸钠溶液加入到混合溶液中并搅拌5min,然后加热至90℃,继续搅拌15min得到的硫化铜纳米材料,在磷酸缓冲溶液(PBS,10mM,pH 7.4)体系中,将巯基修饰的单链DNA(采购)通过Cu-S键合作用修饰到硫化铜纳米粒子表面;
(4)在避光条件下,将5mg用适配体修饰的长余辉纳米材料分散在5mL PBS(10mM,pH 7.4)中,并将其缓缓加入到5mL用单链DNA修饰的硫化铜纳米粒子溶液(5mg mL-1)中,搅拌3h,离心洗涤得到复合纳米探针。
进一步,所述步骤(1)溶剂热反应的溶剂为2mL油酸和15mL甲苯,pH调节使用叔丁胺,最终pH为7.5。
进一步,步骤(1)制备好的长余辉材料,用乙醇湿研2~3遍,重新悬浮于5mmol L-1的NaOH溶液中,并磁力搅拌过夜,4500rmp离心7min取上层浑浊液后再用3500rmp离心15min取上层液体,将获得的上层液体冷冻干燥最终获得粒径为30~80nm的长余辉纳米发光材料。
进一步,所述催化剂为EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺,12mg)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺,30mg)。
进一步,所述硝酸铜和柠檬酸钠的用量分别为0.25mmol和0.17mmol。
进一步,所述步骤(b)通过适配体选择性识别,实现纳米探针对于目标生物毒素的体内靶向识别和活体荧光成像监控的过程如下:
(1)将步骤(a)得到的长余辉-硫化铜复合荧光纳米探针通过小鼠尾静脉注射到小鼠体内;
(2)借助荧光活体成像系统,监控纳米探针进入生物体后的荧光成像信号;
进一步,所述复合荧光纳米探针的注射量为0.3mL(1mg mL-1),分散于磷酸缓冲液(10mM,pH 7.4)中。
进一步,所述活体荧光成像系统设置参数为发射光滤光片为700nm,曝光时间为0.1s。
本发明的应用为通过静脉注射进入生物体内,借助长余辉体外激发的光学生物成像技术,靶向识别目标生物毒素并实时监控其在体内的代谢分布过程。
常规的荧光探针,比如有机染料、荧光蛋白、半导体量子点等,分别存在荧光稳定性差、荧光生物成像信噪比低、毒性高等缺陷,其应用性受限。本发明所制备的近红外长余辉纳米材料,具有发光效率高、荧光寿命长、毒性较低、光化学稳定性好、合成可控等优势,并且可体外激发进行光学成像,可以有效的避免生物体的自发光和激发光源的背景光对成像效果的影响,提高光学成像的灵敏度,因此非常适合用于体内监测,从而进一步实现食源性生物毒素在生物体内行为的实时监控和致病机理探究。
本发明的有益效果在于:
(1)本发明所制备的长余辉-硫化铜复合纳米探针具有优异的选择性识别目标毒素的能力,融合了长余辉纳米发光材料的超强近红外发光和超长余辉寿命、优异的生物相容性和结构稳定性、良好的粒径均一度和低毒性的特质,以及硫化铜纳米粒子合成简便、结构稳定和低毒性的特点,适合于活体靶向荧光成像和体内示踪。
(2)本发明所开发的复合纳米探针可借助近红外长余辉纳米材料可体外激发及优异的生物相容性和光学稳定性,实现可激活复合纳米探针在活体内的选择性识别目标生物毒素的荧光成像技术,实时无损的原位监测生物毒素在生物体内的代谢分布行为,进一步探究其致病机理,为临床诊疗提供有力的科学依据。
(3)本发明各物质的量的选择合理,均为实验过程中经详细对比、分析和优化得出的最佳反应配比和反应条件,反应得到的纳米探针稳定性最强。
附图说明:
图1:复合荧光纳米探针的透射电镜图:(a-b)硫化铜纳米粒子;(c)长余辉纳米材料;(d)长余辉-硫化铜复合荧光纳米探针
图2:复合荧光纳米探针的细胞毒性
图3:复合荧光纳米探针的组织病理学分析
图4:复合荧光纳米探针对目标毒素的选择性识别。
具体实施方式
为了使本发明上述特征和优点更加清楚和容易理解,下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。
实施例1
一种复合荧光纳米探针的制备方法及其体内应用
(1)通过DNA杂交反应,制备可特异性识别黄曲霉毒素的长余辉-硫化铜复合纳米荧光探针。
长余辉纳米材料的制备:精准称取1.4874g的Zn(NO3)2·6H2O固体放入50mL圆底烧瓶中,加入提前配置好的10mL Ga(NO3)3溶液(0.6M),搅拌,待Zn(NO3)2充分溶解后,依次加入300μL Cr(NO3)3溶液(0.1M),1500μL Yb(NO3)3溶液(0.1M),150μL Er(NO3)3溶液(0.1M)和10mL锗酸铵溶液(0.1M)混合搅拌,用叔丁胺调pH至7.5进行共沉淀,加入2mL油酸和15mL甲苯,超声处理使其混合均匀,继续磁力搅拌2h,超声处理30min使其混合均匀,将形成的白色乳浊液置于反应釜中120℃水热反应24h。取出待自然冷却至室温后,加入2倍体积乙醇中,混合均匀,产生沉淀,7000rpm 10min离心收取沉淀物并用无水乙醇洗涤2-3次。离心好的沉淀置于80℃真空干燥箱中干燥3h后,使用玛瑙研钵粗研,然后放于马弗炉中750℃煅烧5h。制备好的长余辉材料,用乙醇湿研2~3遍,重新悬浮于5mmol L-1的NaOH溶液中,并磁力搅拌过夜。4500rmp离心7min取上层浑浊液后再用3500rpm离心15min取上层液体,将获得的上层液体冷冻干燥最终获得粒径为30~80nm的长余辉材料。
长余辉纳米材料的表面功能化:取10mg羧基功能化的黄曲霉毒素适配体分散于5mL磷酸缓冲溶液(PBS,10mM,pH 6.0)中,将30mg NHS和12mg EDC快速加入上述悬浮液,搅拌2h后,透析除去过量的NHS和EDC,重新分散于4.5mL PBS(10mM,pH 7.4)。向上述溶液中加入10mg长余辉纳米材料(分散于5mL PBS中),在室温的条件下继续搅拌5h,离心收集并用PBS洗涤得到适配体修饰的长余辉纳米材料。
硫化铜纳米材料的制备及功能化:将0.25mmol的硝酸铜和0.17mmol柠檬酸钠溶解于水中制成250mL的混合溶液,再将250μL的硫酸钠溶液(1M)加入到混合溶液中并搅拌5min后,加热至90℃,继续搅拌15min得到的硫化铜纳米材料。在磷酸缓冲溶液(PBS,10mM,pH7.4)体系中,将巯基修饰的单链DNA通过Cu-S键合作用修饰到硫化铜纳米粒子表面。
复合探针的制备:在避光条件下,5mg的适配体修饰的长余辉纳米材料分散在5mLPBS(10mM,pH 7.4)中,并将其缓缓加入到5mL单链DNA修饰的硫化铜纳米粒子溶液(5mg mL-1)中,搅拌3h,离心洗涤得到复合纳米探针。
(2)通过适配体选择性识别,实现纳米探针对于目标生物毒素的体内靶向识别和活体荧光成像监控。
取步骤(1)得到的长余辉-硫化铜复合荧光纳米探针,通过小鼠尾静脉注射到黄曲霉毒素中毒的小鼠体内,注射量为0.3mL(1mg mL-1),分散于磷酸缓冲液(10mM,pH 7.4)中;借助荧光活体成像系统,设置参数为发射光滤光片为700nm,曝光时间为0.1s,监控纳米探针进入生物体后的荧光成像信号。
实施例2
一种复合荧光纳米探针的制备方法及其体内应用,步骤和方法与实施例1基本相同,不同之处在于生物毒素为杂色曲霉毒素,相应的适配体为杂色曲霉毒素的适配体序列,生物成像使用的小鼠为杂色曲霉毒素中毒的小鼠。
实施例3
一种复合荧光纳米探针的制备方法及其体内应用,步骤和方法与实施例1基本相同,不同之处在于生物毒素为赭曲霉毒素,相应的适配体为赭曲霉毒素的适配体序列,生物成像使用的小鼠为赭曲霉毒素中毒的小鼠。
实施例4
一种复合荧光纳米探针的制备方法及其体内应用,步骤和方法与实施例1基本相同,不同之处在于生物毒素为玉米赤霉烯酮毒素,相应的适配体为玉米赤霉烯酮毒素的适配体序列,生物成像使用的小鼠为玉米赤霉烯酮毒素中毒的小鼠。
图1为复合荧光纳米探针的透射电镜图,表明制备的荧光纳米探针具有良好的粒径均一度,尺寸在80nm左右,适合用于生物体内应用。
图2为复合荧光纳米探针的细胞毒性考察,表明制备的纳米探针对三种细胞株均没有明显的毒性,适合用于活体成像研究。
图3为复合荧光纳米探针的活体毒性实验考察,表明制备的纳米探针对生物体没有明显的毒性,适合用于活体成像研究。
图4为复合荧光纳米探针的选择性识别目标毒素考察,表明探针通过适配体的特异性识别作用,可以靶向识别目标生物毒素,而不受其他毒素和生物分子的干扰,适合用于体内靶向识别目标生物毒素。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已,并不用以限制本发明创造,凡在本发明创造的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明创造的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种复合荧光纳米探针的制备方法,其特征在于,由如下步骤制备:
(a)借助DNA杂交反应,制备能够特异性识别目标生物毒素的长余辉-硫化铜复合纳米荧光探针;
(b)通过适配体选择性识别,实现纳米探针对于目标生物毒素的体内靶向识别和活体荧光成像监控。
2.根据权利要求1所述的一种复合荧光纳米探针的制备方法,其特征在于,所述步骤(a)借助DNA杂交反应,制备能够特异性识别目标生物毒素的长余辉-硫化铜复合纳米荧光探针的过程如下:
(1)长余辉纳米发光材料的制备:精准称取1.4874g的Zn(NO3)2·6H2O固体放入50mL圆底烧瓶中,加入提前配置好的10mL 0.6M Ga(NO3)3溶液,搅拌,待Zn(NO3)2·6H2O充分溶解后,依次加入300μL0.1M Cr(NO3)3溶液,1500μL 0.1M Yb(NO3)3溶液,150μL0.1M Er(NO3)3溶液和10mL0.1M锗酸铵溶液混合搅拌,并调节pH,发生共沉淀反应得到反应液,反应液转移到反应釜中120℃条件下溶剂热反应24小时后,产物离心洗涤并使用玛瑙研钵粗研后于750℃条件下煅烧反应5小时得到长余辉材料PLNPs;
(2)长余辉纳米发光材料的表面功能化:在10mM,pH 7.4磷酸缓冲溶液体系中,将羧基修饰的适配体单链DNA通过与步骤(1)得到的长余辉纳米发光材料PLNPs表面的氨基在催化剂作用下反应,修饰到长余辉纳米发光材料表面;
(3)硫化铜纳米材料的制备及功能化:将硝酸铜和柠檬酸钠溶解于水中制成250mL的混合溶液,再将250μL,1M的硫酸钠溶液加入到混合溶液中并搅拌5min,然后加热至90℃,继续搅拌15min得到的硫化铜纳米材料,在磷酸缓冲溶液体系中,将巯基修饰的单链DNA修饰到硫化铜纳米粒子表面;
(4)在避光条件下,将5mg适配体修饰的长余辉纳米发光材料分散在5mL硫酸缓冲液中,并将其缓缓加入到5mL用单链DNA修饰的浓度为5mg mL-1的硫化铜纳米粒子溶液中,搅拌3h,离心洗涤得到复合纳米探针。
3.根据权利要求2所述的一种复合荧光纳米探针的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)溶剂热反应的溶剂为2mL油酸和15mL甲苯,pH调节使用叔丁胺,最终pH为7.5。
4.根据权利要求2所述一种复合荧光纳米探针的制备方法,其特征在于,步骤1制备好的长余辉材料,用乙醇湿研2~3遍,重新悬浮于5mmol L-1的NaOH溶液中,并磁力搅拌过夜,4500rmp离心7min取上层浑浊液后再用3500rmp离心15min取上层液体,将获得的上层液体冷冻干燥最终获得粒径为30~80nm的长余辉纳米发光材料。
5.根据权利要求2所述一种复合荧光纳米探针的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中所使用的催化剂为12mgEDC和30mgNHS。
6.根据权利要求2所述一种复合荧光纳米探针的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中硝酸铜和柠檬酸钠的用量分别为0.25mmol和0.17mmol。
7.根据权利要求1所述的一种复合荧光纳米探针的制备方法,其特征在于,所述步骤(b)通过适配体选择性识别,实现纳米探针对于目标生物毒素的体内靶向识别和活体荧光成像监控的过程如下:
(1)将步骤(a)得到的长余辉-硫化铜复合荧光纳米探针通过小鼠尾静脉注射到小鼠体内;
(2)借助荧光活体成像系统,监控纳米探针进入生物体后的荧光成像信号。
8.根据权利要求7所述的一种复合荧光纳米探针的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述长余辉-硫化铜复合荧光纳米探针的注射量为0.3mL,探针浓度为1mg mL-1,并在注射前分散于磷酸缓冲液中。
9.根据权利要求7所述的一种复合荧光纳米探针的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述荧光活体成像系统设置参数为发射光滤光片为700nm,曝光时间为0.1s。
10.权利要求1-9任一权利要求所述制备方法制备的复合荧光纳米探针的体内应用,其特征在于,通过静脉注射进入生物体内,借助长余辉体外激发的光学生物成像技术,靶向识别目标生物毒素并实时监控其在体内的代谢分布过程。
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PB01 | Publication | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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