CN112082976A - 基于药物探针及组织切片的体外药物敏感性检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于药物探针及组织切片的体外药物敏感性检测方法。本发明是将化学生物学中的药物探针与荧光素利用“点击化学”相偶联，从而实现药物“可视化”。本发明不依赖于原代培养或动物模型，检测周期短，成功率高，无二次创伤性；本发明具有很广阔的临床应用和科学研究价值，尤其可用于抗肿瘤靶向药的药效预测，从而指导患者用药；且本方法对新药临床试验中的患者入组也有重要指导意义；此外，本方法的某些靶向药探针的染色结果还可用于辅助病理诊断。

Description

基于药物探针及组织切片的体外药物敏感性检测方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体是一种基于药物探针及组织切片的体外药物敏感性检测方法。
背景技术
小分子药物(包括化疗药和靶向药)在恶性肿瘤治疗过程中占有重要地位，是临床常用的治疗方法。然而恶性肿瘤具有异质性,即使病理分型和组织学类型相同的同一种肿瘤，对同一种小分子药物的敏感性也不尽相同,多药耐药现象普遍存在,患者个体差异大，这些因素均有可能导致治疗的失败。而且目前市场上的化疗药物及靶向药物种类繁多，仅凭临床经验选用治疗方案具有一定的盲目性，治疗有效率低，毒副作用大，易产生耐药性。因此临床上迫切需要开发快速、可靠的药敏检测方法，在用药前筛选出合适的药物对患者进行个体化化疗，减少不必要的毒副作用，提高治疗效果。
目前采用的肿瘤药敏检测方法，主要是体外药敏检测和基因测序。体外药敏检测一般是直接从患者体内获取新鲜的肿瘤组织进行原代培养或移植到动物模型(PDX)，然后通过检测细胞活性或动物对药物的反应情况来判断药物的疗效。肿瘤细胞原代培养成功率较低，培养周期较长，效率低，严重限制了该方法的使用。此外传统的细胞活性检测方法也存在着诸多缺点，例如肿瘤细胞集落测定法，原代培养周期较长，标本可评价率低(40％-70％)，操作繁琐，难以标准化；MTT(四甲基偶氮唑盐)比色法，所需细胞数较多，实验数据不稳定，而且检测到的是活细胞，不能区分间质细胞和肿瘤细胞，因此当应用于高度不均一的临床肿瘤组织时，难以准确反映其药物敏感性。PDX所需成本高、周期长，也有一定局限性。目前用于指导用药的基因测序，只能给出基因突变信息，不是直接检测药物靶点，因而准确性较低。因此，开发更加简便高效的药物敏感性检测方法具有重要的临床意义。
发明内容
针对现有的肿瘤药敏检测方法存在的问题，本发明的目的在于提供一种新型药敏检测方法，该方法不依赖于原代培养或动物模型，检测周期短，成功率高，具有广阔的临床应用价值。。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案，该方法首先设计合成药物探针，利用抗肿瘤药物探针工作液与肿瘤组织切片进行共孵育，使药物探针与靶点蛋白结合，然后通过点击反应或非点击反应将荧光报告基团引入到抗肿瘤药物上，随后利用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察染色的荧光强度和分布特征，判断该组织对药物的敏感程度。
优选地，所述药物探针在组织上的染色具有明显的组织特异性，所述药物探针优选为伊马替尼探针，利用伊马替尼探针对胃肠间质瘤组织芯片进行的染色实验也表明，伊马替尼探针与胃肠间质瘤的恶性程度正相关，不仅可以反应出肿瘤组织对药物的敏感程度，还可以作为独立的诊断和预后标志物，用于病理诊断。
优选地，所述药物包括伊马替尼、吉非替尼、索拉非尼、甲氨蝶呤、依托泊苷、三苯氧胺等研发中及已上市的药物。
优选地，所述合成的药物探针应包含炔基基团，或炔基基团和光敏基团如羰基、双吖丙啶基团、二苯甲酮基团等。
优选地，所述的荧光报告基团应包含荧光基团及叠氮基团，可以与药物探针发生点击反应，或采用非点击反应(一步法)。
优选地，所述药物探针的合成应保留原药物的作用效果及靶点结合活性；
优选地，所述的肿瘤组织切片，包括石蜡切片和冰冻切片，还可包括组织芯片、多病例切片等高通量病理标本。
优选地，所述石蜡切片，优选的方案为经过脱蜡、复水处理后进行抗原修复。
所述石蜡切片经过抗原修复的部分探针的染色结果明显优于没有进行抗原修复的结果。
优选地，所述冰冻切片可直接与探针工作液进行共孵育然后进行后续的操作；最佳共孵育时间为0.1-2h。
进一步改进地，所述的回顾性研究可采用组织芯片，多病例切片等高通量病理标本。
本发明的有益效果如下：
本发明是将化学生物学中的药物探针与荧光素利用“点击化学”相偶联，从而实现药物“可视化”。本发明不依赖于原代培养或动物模型，检测周期短，成功率高，无二次创伤性；本发明具有很广阔的临床应用和科学研究价值，尤其可用于抗肿瘤靶向药的药效预测，从而指导患者用药；且本方法对新药临床试验中的患者入组也有重要指导意义；此外，本方法的某些靶向药探针的染色结果还可用于辅助病理诊断。
附图说明
图1为去甲基伊马替尼探针合成路线；
图2.与去甲基伊马替尼探针有关的化合物的图谱:2-A:化合物b的1H NMR；2-B:化合物c的1H NMR；2-C:化合物d的1H NMR；2-D:化合物d的1C NMR
图3.伊马替尼和去甲基伊马替尼探针的测MTT的GIST-882细胞的生长曲线图；
图4.去甲基伊马替尼探针在GIST-882细胞上的定位实验结果；
图5.去甲基伊马替尼探针在GIST-882细胞上的共定位实验结果；
图6.抗肿瘤药物荧光探针肿瘤组织石蜡切片及冷冻切片染色实验流程图；
图7.去甲基伊马替尼探针在GIST-882实体瘤石蜡组织切片上的定位实验结果；
图8.去甲基伊马替尼探针与CD117蛋白在GIST-882实体瘤石蜡组织切片上的共定位实验结果；
图9.去甲基伊马替尼探针在GIST-882实体瘤石蜡组织切片上不进行抗原修复的定位实验结果；
图10.去甲基伊马替尼探针与CD117蛋白在GIST-882实体瘤组织冷冻切片上的共定位实验结果；
图11.去甲基伊马替尼探针及CD117蛋白在人GIST组织芯片上的定位结果；
图12.A:去甲基伊马替尼探针荧光强度与CD117蛋白荧光强度的相关性分析结果；图B:去甲基伊马替尼探针荧光强度与肿瘤病理分级的相关性分析结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下列实施例中，所用的试验材料及其来源包括：
(1)实验动物、细胞、组织芯片
昆明裸鼠(雌性)：由中国人民解放军军事医学科学院试验动物中心和北京维通利华实验动物技术有限公司提供。动物到达后，由专人接收动物于双走廊屏障环境小鼠饲养室内，填写《试验动物接收记录表》(BG-017-V00)，接收时对动物大体情况进行观察，并随机抽取动物进行称重，确保试验动物与引进标准基本吻合。实验动物使用许可证号：SYXK(津)2012-0003。
GIST细胞:凯基生物；
人GIST组织芯片：武汉爱威尔生物科技有限责任公司；
人正常组织芯片：泛谱生物。
(2)实验试剂
EDTA(pH 8.0)：中山金桥，批号：WK152716；
(兔单克隆抗体)c-kit蛋白：中杉金桥，批号：16691604；
羊抗兔lgG-FITC:凯基生物；
TBTA:梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；
TCEP:梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；
CuSO4·5H2O：西陇生化。
(3)试剂的配制方法
a)去甲基伊马替尼探针溶液的配制：称取去甲基伊马替尼探针3mg，用DMSO稀释到1.5mL,配制成100mM的母液，放-4℃避光保存，每次使用时用母液现用现稀释，使工作液浓度为10μM。
b)甲基伊马替尼溶液的配制：称取甲基伊马替尼6mg，用DMSO稀释到240μL，配制成40mM的母液，每次使用时现用现稀释。
c)点击液溶液的配制：称取含叠氮的罗丹明16.3mg，用DMSO配成20mL,浓度为1M的母液，放-4℃保存；称取TBTA 6.4mg，用去离子水配成1mL，浓度为12mM的母液，放-20℃保存；称取TCEP 30mg,用去离子水配成1mL，浓度为120mM的母液，放-4℃保存；称取CuSO4·5H2O 30mg，用去离子水配成1mL，浓度为120mM的母液，放-4℃保存。点击液工作液(现配现用)：取TBTA母液200μL,取TCEP母液200μL,取CuSO4·5H2O母液200μL,取含叠氮的罗丹明母液2.4mL，用1×PBS稀释到24mL。
d)1×PBS溶液的配制：用5L的PBS粉包用去离子水定容到5L
e)5％FBS：取500μL FBS用1×PBS定容到10mL。
f)EDTA(pH 8)工作液：取5mL EDTA，用去离子水稀释到250mL。
实施例1.伊马替尼分子荧光探针肿瘤组织切片染色在肿瘤药敏检测中的应用研究
1.去甲基伊马替尼探针的合成及鉴定
去甲基伊马替尼探针的合成路线如附图1所示，表征图谱见附图2-A到2-D。去甲基伊马替尼探针的结构式见附图1中的化合物d。
1.1化合物L6的合成参考文献：[J].Angewandte Chemie InternationalEdition,2013,52(33):8551–8556.进行合成。
1.2化合物(b)的合成
取一个50mL两口圆底烧瓶,称取化合物对氯甲基苯甲酸(1.5g，8.79mmol),加入8mL重蒸DCM(二氯甲烷)，加入二氯亚砜(5mL，68.8mmol),置于油浴锅中加热回流3小时。TLC(薄层层析)检测反应进程。反应完全后浓缩旋蒸除去溶剂，干燥得到白色固体的酰氯A(化合物A易变质不可久置，要立即投入下一步反应)。取一个50mL两口圆底烧瓶,称取化合物(a)(500mg，1.8mmol),置于0℃低温搅拌反应器中，加入三乙胺(0.52mL，3.6mmoL),搅拌十分钟后将化合物A溶于15mL的重蒸干燥过的四氢呋喃中，用恒压滴液漏斗慢慢滴入反应瓶中(20分钟内)，随着滴加的进行反应液由澄清变乳黄色混浊。滴毕，在0℃反应1h，随后转移室温搅拌过夜。TLC检测(DCM:MeOH＝20:1)，反应完后，抽滤，淡黄色滤饼即为粗产物，浓缩滤液得淡黄色固体，加入适量乙酸乙酯溶解，分别用蒸馏水，饱和氯化钠溶液与EA进行萃取,合并EA相，无水硫酸钠干燥，浓缩旋蒸除去溶剂，以200—300目硅胶为固定相进行柱层析分离(二氯甲烷/甲醇体系)，得化合物(b)，产率69％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(如附图2-A)δppm:10.23(s,1H),9.28(d,J＝1.5Hz,1H),8.98(s,1H),8.68(d,J＝3.6Hz,1H),8.51(d,J＝5.1Hz,1H),8.48(d,J＝8.0Hz,1H),8.09(d,J＝1.3Hz,1H),7.96(d,J＝8.1Hz,2H),7.59(d,J＝8.2Hz,2H),7.55＝8.2Hz,2H),7.55(d,J＝5.1Hz,1H),7.21(d,J＝8.3Hz,1H),4.84(s,2H),2.23(s,3H)，ESI-MS(m/z):430.35([M+H+]).
1.3化合物(c)的合成
取一个25mL两口圆底烧瓶,称取化合物(b)(100mg,0.27mmol),无水哌嗪(73mg,0.87mmol),碳酸铯(227mg,0.73mmol),加入干燥的DMF 5mL,在氩气保护下常温搅拌反应过夜，薄层层析检测(DCM:MeOH＝10:1)，反应完毕，抽滤，滤饼用DMF洗两次，浓缩滤液，以200—300目硅胶为固定相进行柱层析分离(二氯甲烷/甲醇体系)DCM:MeOH＝10:1冲杂质点，之后加1％的氨水加大极性得淡黄色固体目标产物化合物c,产率45％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(如附图2-B)δppm:10.17(s,1H),9.27(d,J＝1.4Hz,1H),8.98(s,1H),8.68(d,J＝3.5Hz,1H),8.51(d,J＝5.1Hz,1H),8.47(d,J＝8.1Hz,1H),8.08(s,1H),7.91(d,J＝8.1Hz,2H),7.56(s,1H),7.91(d,3H)，dd,J＝6.3,4.4Hz,3H),7.20(d,J＝8.3Hz,1H),3.50(d,J＝9.6Hz,3H),2.74(d,J＝4.4Hz,4H),2.34(s,4H),2.22(s,3H)，ESI-MS(m/z):480.45([M+H+])。
1.4化合物(d)的合成
称取化合物(C)(96.9mg,0.40mmol)，化合物L6(50mg,0.40mmol)和K2CO3(69.8mg,1.01mmol)加入含2ml干燥的DMF的圆底烧瓶中。室温下反应3h，浓缩之后用乙酸乙酯和水萃取。合并有机相，用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，硅胶柱纯化。得到化合物(d)(53％).1HNMR(400MHz,DMSO)(如附图2-C)δppm:10.15(s,1H),9.30–9.24(m,1H),8.96(s,1H),8.68(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),8.53–8.45(m,2H),8.07(d,J＝2.1Hz,1H),7.90(d,J＝7.9Hz,2H),7.57–7.39(m,5H),7.20(d,J＝8.3Hz,1H),3.52(s,2H),2.81(t,J＝2.7Hz,1H),2.35(d,J＝17.3Hz,7H),2.22(s,3H),2.10(t,J＝7.4Hz,2H),2.00(td,J＝7.4,2.6Hz,2H),1.54(dt,J＝17.9,7.4Hz,4H),1.35(s,1H).13C NMR(101MHz,CDCl3)(如附图2-D)δppm:165.38,162.77,160.61,159.01,151.45,148.51,137.82,136.61,134.97,134.06,132.71,130.79,129.39,127.07,125.51,124.31,123.74,115.39,113.25,108.36,82.80,69.12,62.40,52.85,52.52,32.45,31.92,30.33,29.69,29.35,27.22,22.68,17.66,14.10,13.30.ESI-MS(m/z):600.56([M+H+])。
2.去甲基伊马替尼和去甲基伊马替尼探针的抗肿瘤活性检测
复苏GIST-882细胞，按常规方法测伊马替尼和去甲基伊马替尼探针的MTT。实验结果如附图3(A、B)所示：甲基伊马替尼的IC50为1.677μM，去甲基伊马替尼探针的IC50为13.44μM。说明对其结构改造后仍能与靶点蛋白结合，保留了抗肿瘤活性，可以用于后续的肿瘤组织药敏检测实验中。
3.去甲基伊马替尼探针及其与CD117抗体免疫荧光染色在GIST-882细胞上的共定位实验
3.1去甲基伊马替尼探针在GIST-882细胞上的定位实验
实验方法：
用对数期的GIST-882细胞于铺24孔板(爬片)，约7×104/孔，每孔中加入500μL。9小时后实验组加入去甲基伊马替尼探针(终浓度为：10μM)对照组加等量DMSO。共孵育4h后弃去培养基，PBS浸洗3次每次3分钟，加入200μL的冷甲醇室温下固定20min。弃甲醇，PBS浸洗3次每次3分钟,紫外灯(365nm)照射60min。加入0.1％的tritionX-100共孵育10min，PBS浸洗3次每次3分钟，加含5％FBS的PBS溶液，室温封闭30min。1×PBS洗3次，加点击反应的工作液，点击反应2h，此过程需要避光。PBS洗4次，至无色。DAPI胶封片激光共聚焦显微镜拍照并采集信息。
实验结果：
实验结果如附图4所示，去甲基伊马替尼探针的红色荧光主要集中分布在细胞膜和核膜上,红色荧光的主要集中部位与伊马替尼的作用靶点蛋白CD 117的主要分布位置是一致的。
3.2去甲基伊马替尼探针与CD 117抗体免疫荧光染色在GIST-882细胞上的共定位实验
实验方法：
用对数期的GIST-882细胞于铺24孔板(爬片)，约7×104/孔，每孔中加入500μL。9小时后弃去培养基，PBS浸洗3次每次3分钟，加入200μL的冷甲醇室温下固定20min。弃甲醇，PBS浸洗3次，加入0.1％的tritionX-100共孵育10min，PBS浸洗3次，加含5％FBS的PBS溶液，室温封闭30min。弃封闭液，实验组加一抗(CD 117抗体)工作液，对照组加等量PBS，37℃共孵育1h，PBS浸洗3次。加入荧光二抗(羊抗兔lgG-FITC)工作液，室温避光孵育40min，PBS洗3次。实验组加去甲基伊马替尼探针工作液(终浓度10μM)，对照组加等量PBS，37℃共孵育1h。PBS浸洗后用紫外灯(365nm)照射1h，弃PBS，加点击液反应2h。PBS浸洗后用DAPI胶封片，激光共聚焦显微镜下拍照并采集信息。
实验结果：
实验结果如附图5所示，绿色荧光图像为CD 117抗体与细胞作用后的图像，红色荧光图像为去甲基伊马替尼探针与细胞作用后的图像。从图中可以看出两者的重叠程度较高，皮尔森相关系数高达0.78以上。CD 117蛋白为胃肠道间质瘤临床诊断的“金指标”，研究表明伊马替尼的药理机制正是靶向于CD 117从而发挥药理活性和治疗作用的。以上结果表明：设计合成的去甲基伊马替尼探针能够准确的定位在伊马替尼的靶点蛋白CD 117上，合成的抗肿瘤药物荧光探针具有很好的靶向性，探针的分布具有特异性，可以通过探针的平均荧光强值来判断细胞对药物的敏感程度。
4.去甲基伊马替尼探针及其与CD 117蛋白在GIST-882实体瘤石蜡切片上的定位实验
4.1去甲基伊马替尼探针GIST-882实体瘤石蜡切片上的定位实验
实验方法(流程如附图6所示)：
用GIST细胞对昆明裸鼠进行荷瘤实验，等实体瘤有黄豆粒大时取出按常规方法制作成石蜡切片。石蜡切片过二甲苯Ⅰ15分钟，二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟进行脱蜡。放入到100％酒精Ⅰ5分钟，100％酒精Ⅱ5分钟，95％酒精5分钟，80％酒精5分钟，自来水洗5min，蒸馏水冲洗3分钟，PBS洗3分钟洗3次进行复水。将组织切片置于稀释50倍的EDTA(pH 8)修复液中(液面没过切片上端)，用微波炉解冻模式预热6分钟至微微沸腾，再用中低火力维持15分钟，停止加热后自然冷却20-30分钟进行抗原修复。冷却后用PBS浸洗3次每次3分钟，用滤纸擦去标本外的PBS，放入温湿盒中，滴加0.3％tritonX-100，室温共孵育10min。PBS浸洗3次每次3分钟，加2％BSA封闭30min。加去甲基伊马替尼探针工作液(10μM)覆盖组织于37℃共孵育1h，对照组加等量的PBS。PBS浸洗3次每次3分钟，加PBS覆盖组织，紫外灯(365nm)照1h，加点击液的工作液，点击反应2h。PBS浸洗4次每次3分钟，洗至无色，加DAPI胶封片并用激光共聚焦显微镜拍照并采集信息。
实验结果：
实验结果如附图7所示，红色荧光主要集中分布在细胞膜和核膜上，红色荧光的主要集中部位与伊马替尼作用的靶点蛋白CD 117的主要分布位置是一致的。并且在一定药物浓度范围内，荧光强度的均值与药物浓度呈正相关，当达到饱和后，随药物浓度的增加，荧光强度的均值几乎不变。
4.2去甲基伊马替尼探针与CD117蛋白在GIST-882实体瘤石蜡切片上的共定位实验
实验方法：
脱蜡，复水，抗原修复，打孔，封闭等步骤参考4.1进行。然后弃去封闭液，实验组加一抗(CD 117抗体)工作液，对照组加等量PBS，37℃共孵育1h，PBS浸洗3次每次3分钟。加二抗(羊抗兔lgG-FITC)工作液，室温避光孵育40min，PBS洗3次每次3分钟。实验组加去甲基伊马替尼探针工作液(终浓度10μM)，对照组加等量PBS，37℃共孵育1h，PBS浸洗3次每次3分钟。紫外灯(365nm)照射1h，弃PBS，加点击反应工作液，反应2h。PBS浸洗4次，至组织呈现无色，DAPI胶封片，激光共聚焦显微镜下拍照并采集信息。
实验结果：
实验结果如附图(8)，绿色荧光图像为CD117抗体与细胞作用后的图像，红色荧光图像为去甲基伊马替尼探针与细胞作用后的图像。从图中可以看出两者定位的重叠程度较高，皮尔森相关系数高达0.75以上。
以上实验结果表明：在肿瘤组织石蜡切片上，去甲基伊马替尼探针仍然能够准确的定位在伊马替尼的靶点蛋白CD 117上，具有很好的靶向性及特异性，亦可以通过探针的平均荧光强值来判断肿瘤组织对药物的敏感程度。而且在一定范围内随着药物与靶点蛋白结合的数目越多，其产生的荧光强度平均值也越大，而药物与靶点蛋白结合的数目越少荧光强度平均值也越小。因此可以通过化学荧光的平均光强值来判断肿瘤组织对药物的敏感程度。以上结果表明，本发明提供的基于抗肿瘤药物荧光探针及肿瘤组织切片的肿瘤药敏的检测方法在肿瘤组织石蜡切片上(抗原复性后)可以很好的反应出肿瘤组织对药物的敏感性，可以作为潜在的临床肿瘤药敏检测方法。
4.3去甲基伊马替尼探针在GIST-882实体瘤石蜡切片上不进行抗原修复的共定位实验
实验方法：
参考4.1，但是在复水步骤后不进行抗原修复。
实验结果：
实验结果如附图(9)，在相同光照强度下，不进行抗原修复时平均荧光强度值较低，与不加药物的对照组接近。以上结果表明本发明公开的肿瘤药敏检测方法在石蜡切片上应用时，抗原修复的情况下实验结果明显优于不进行抗原修复的实验结果。
5.去甲基伊马替尼探针与CD117蛋白在GIST-882实体瘤冷冻切片上的共定位实验
实验方法(流程如附图6)：
新鲜GIST实体瘤组织按常规方法制作冷冻切片。冰冻切片室温晾干15分钟，PBS洗3次，每次3分钟。其余步骤参考实验4.1(除去实验4.1的脱蜡、复水和抗原修复步骤)。
流程中，(B):取肿瘤组织按常规方法分别制作石蜡切片,石蜡切片按常规方法脱蜡、复水，使用微波炉进行抗原修复，自然冷却至室温后封闭，打孔。加药物探针共孵育1h,37℃，紫外光照1h,加入点击反应工作液，点击反应2h，封片，利用激光共聚焦显微镜和成像软件观察荧光强度及分布。(A):除不进行抗原修复外，其余步骤和(B)相同。(C):取新鲜肿瘤组织按常规方法制作冰冻切片，然后封闭，打孔，后面步骤同(B)。
实验结果：
实验结果如附图(10)所示，绿色荧光图像为CD117抗体与细胞作用成的图像，红色荧光图像为去甲基伊马替尼探针与细胞作用成的图像。从图中可以看出两者的重叠程度较高，皮尔森相关系数高达0.78以上。以上实验结果表明，在冷冻组织切片上去甲基伊马替尼探针仍具有伊马替尼药物的活性，与伊马替尼药物的作用靶点CD 117蛋白结合，具有靶向性和特异性，亦可以通过化学荧光的平均荧光强值来判断药物对肿瘤组织的敏感程度。以上结果表明，本发明提供的基于抗肿瘤药物荧光探针及肿瘤组织切片的肿瘤药敏的检测方法在肿瘤组织冷冻切片上亦可以很好的反应出肿瘤组织对药物的敏感性，可以作为潜在的临床肿瘤药敏检测方法。
6.抗肿瘤药物荧光探针在人GIST组织芯片上作为一种药敏检测方法和独立临床病理指标的研究
实验方法：见4.2。
实验结果：
去甲基伊马替尼探针及CD117蛋白在人GIST组织芯片上进行染色，通过荧光成像仪拍摄各个组织点的荧光强度，并逐个统计各个组织点的强度值，分别得到CD117抗体的荧光强度和去甲基伊马替尼探针的荧光强度，并进行相关性分析。CD117蛋白为胃肠道间质瘤临床诊断的“金指标”，CD117阳性程度可以反映肿瘤的恶性程度。实验结果表明(图11)：在肿瘤组织芯片上，去甲基伊马替尼荧光探针染色后的荧光强度与其靶点蛋白CD117免疫荧光染色的荧光强度基本吻合。统计荧光强度值并做统计学回归分析(图12-A)结果表明：去甲基伊马替尼探针荧光强度和CD117蛋白免疫荧光强度呈正相关，结果具有统计学意义。说明本发明可以作为独立的药敏检测方法，同时可以作为潜在的独立临床病理指标。又进一步和组织芯片点病人的生存期及病理分级进行关联(图12-B)，发现去甲基伊马替尼探针荧光强度高的病人，生存期相对较短，而去甲基伊马替尼探针荧光强度低的病人，生存期相对较长。结果显示以伊马替尼探针荧光强度作为临床病理指标对病人恶性程度的判断准确性要高于以CD117强度判断恶性程度。
综上所述：本发明利用作用靶点明确的抗肿瘤药物伊马替尼作为实施例，在不改变其药效的情况下进行改造，做成去甲基伊马替尼探针，合成的探针包括炔基基团，光敏基团。通过MTT方法检测了去甲基伊马替尼探针和去甲基伊马替的IC50，以决定去甲基伊马替尼探针的工作液浓度。取新鲜GIST-882实体瘤组织制作成石蜡切片，按照常规方法对石蜡切片脱蜡复水，热修复使蛋白复性，药物探针工作液与其共孵育，采用365nm紫外灯照射，进行点击反应，使药物探针上连接上荧光基团；同时进行了去甲基伊马替尼探针与免疫荧光的共定位实验，结果表明抗肿瘤药物分子荧光探针在肿瘤组织切片上具有很好的靶向性和特异性。并且在冷冻切片对该方法进行了更进一步的验证。
通过在组织芯片上将去甲基伊马替尼荧光探针的荧光强度和CD117蛋白荧光强度进行统计学分析，结果表明去甲基伊马替尼荧光探针的荧光强度与CD117免疫荧光强度基本吻合，进一步统计荧光强度值并做统计学回归分析，表明去甲基伊马替尼探针荧光强度和CD117蛋白免疫荧光强度呈正相关，结果具有统计学意义。说明本发明可以作为独立的药敏检测方法，同时可以作为潜在的独立临床病理指标。又进一步和组织芯片点病人的生存期进行关联，发现去甲基伊马替尼探针荧光强度高的病人，生存期相对较短，而伊马替尼探针荧光强度低的病人，生存期相对较长。以去甲基伊马替尼探针荧光强度作为临床病理指标对病人恶性程度的判断准确性要高于以CD117强度判断恶性程度。
综合上述实验结果，我们发明的基于抗肿瘤药物荧光探针和肿瘤组织切片的方法能作为肿瘤体外药敏检测的新方法和独立的作为一种临床的病理指标。

Claims (11)

1.基于药物探针及组织切片的体外药物敏感性检测方法，其特征在于：该方法首先设计合成药物探针，利用抗肿瘤药物探针工作液与肿瘤组织切片进行共孵育，使药物探针与靶点蛋白结合，然后通过点击反应或非点击反应将荧光报告基团引入到抗肿瘤药物上，随后利用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察染色的荧光强度和分布特征，判断该组织对药物的敏感程度。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述药物探针在组织上的染色具有明显的组织特异性；所述药物探针为伊马替尼药物荧光探针，伊马替尼药物荧光探针与胃肠间质瘤的恶性程度正相关，不仅可以反应出肿瘤组织对药物的敏感程度，还可以作为独立的诊断和预后标志物，用于病理诊断。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述药物包括伊马替尼、吉非替尼、索拉非尼、甲氨蝶呤、依托泊苷、三苯氧胺等研发中及已上市的药物。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述合成的药物探针应包含炔基基团，或炔基基团和光敏基团如羰基、双吖丙啶基团、二苯甲酮基团等。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述荧光报告基团应包含荧光基团及叠氮基团，可以与药物探针发生点击反应或非点击反应。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述药物探针的合成应保留原药物的作用效果及靶点结合活性。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述肿瘤组织切片，包括石蜡切片和冰冻切片，还可包括组织芯片、多病例切片等高通量病理标本。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述石蜡切片，经过脱蜡、复水处理后进行抗原修复。
9.根据权利要求7或8所述的检测方法，其特征在于：所述石蜡切片经过抗原修复的部分探针的染色结果明显优于没有进行抗原修复的结果。
10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述冰冻切片直接与探针工作液进行共孵育然后进行后续的操作；最佳共孵育时间为0.1-2h。
11.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：还可用于回顾性研究，其可采用组织芯片、多病例切片等高通量病理标本。
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