CN110606862B - 特异性检测rna g-四链体的铂络合物荧光探针、制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种特异选择性检测活细胞内RNA G‑四链体的铂络合物荧光探针及其制备方法和应用。所述荧光探针其结构式如(I)所示,其中,R为氢,甲基;A‑为PF6 ‑阴离子或氯离子。本发明提供的荧光探针在活细胞内可特异性地识别RNA G‑四链体,检测过程不受其他组分的干扰,可检测RNA G‑四链体的数量、寿命并追踪其在细胞内动态分布;同时所述荧光探针的制备过程简单,结构稳定,便于储存,细胞毒性低,在RNA G‑四链体生物学功能研究上有广阔的应用空间。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光探针,更具体地,涉及一种对活细胞内RNA G-四链体有特异选择性的铂无机络合物的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
核糖核酸(RNA)是分子遗传的中心法则中的关键生物大分子。它肩负着准确地在脱氧核糖核酸(DNA)和蛋白质之间传递遗传信息的重要使命,在后转录阶段起着决定性的调节蛋白表达的作用。近期的研究发现,RNA的二级结构呈多样化,常常是常规的watson-crick碱基对和非常规的碱基配对方式并存。而这些与DNA结构迥异的RNA二级结构,对调控蛋白表达和实现RNA的其他生物功能非常关键。其中,RNA G-四链体在人类癌症和神经性遗传疾病的发病过程中扮演着重要的角色,在相关药物研发上具有巨大的应用前景。
生物信息学研究证实,5成以上的信使RNA(mRNA)带有可形成G-四链体的基因序列,主要集中于5’和3’非翻译区(5’-/3’-UTR)。而且在非编码RNA(ncRNA)中也发现了众多的G-四链体序列。使用生物学方法发现这些区域对蛋白表达,RNA剪接(RNA splicing),端粒的维持和细胞内mRNA传递都有很强的调控功能,甚至还可以调控病毒RNA的合成。生物实验发现5’和3’-UTR形成G-四链体可以对mRNA的翻译能起到30-70%的抑制作用。G-四链体可能通过结合一些蛋白因子和微小RNA(miRNA)来抑制核糖体的形成,从而调控蛋白的表达效率。在内含子序列里的G-四链体可以阻止常规剪接过程,并引发可变剪接过程(alternative splicing)。进而,通过免疫沉淀方法发现了RNA G-四链体主要和核酸解旋酶结合,例如DHX36,hnRNPF和eIF4A。DEAH-box和DEAD-box家族的解旋酶都有高度相似的亚基,可以特异性的识别和结合RNA G-四链体结构。这些酶蛋白通过解旋功能,可以消除RNAG-四链体,提高癌基因蛋白表达。而药物分子可以通过稳定RNA G-四链体,从而抑制癌症生物学指标的水平。
RNA主要存在于细胞质,多以单链无序状态存在,其整体长度也远小于DNA。以RNAG-四链体为底物设计药物分子,不但可以避免DNA底物的各类问题,而且还可以直接干预转录后的蛋白合成步骤。在不改变核酸水平和序列的前提下,直接调控中心法则终端产物的表达水平和生物活性。因此RNA G-四链体比DNA G-四链体更有潜力成为抗癌药物的核酸底物,而且RNA G-四链体与特异识别酶之间的作用也是癌症致病机理和基因编辑等前沿科研领域的研究热点。然而由于RNA的寿命比DNA短的多,总体数量也相对较少,mRNA和ncRNA的复制数目又极其有限,且在细胞质内的分布不固定,致使RNA G-四链体在细胞内的存在时间非常短暂,一般的生物学方法无法捕捉。目前除了使用RNA G-四链体特异结合性的配体进行标记,通过生物物理的手段跟踪标记物之外,尚无其他方法追踪细胞内的G-四链体结构。
因此,亟待于提供更多观测活细胞内RNA G-四链体的方法,进而获得RNA G-四链体与结合蛋白的作用信息,测量RNA G-四链体的总量,RNA G-四链体折叠/解折叠动态平衡常数等动力学信息。
发明内容
本发明的目的在于针对目前现有技术的不足,提供一种高度特异性检测活细胞内RNA G-四链体的荧光探针。本发明提供的荧光探针在活细胞体内能够高度特异性的识别RNA G-四链体。基于探针络合物特有的光学和结合性质,可以实现对RNA G-四链体的数量,寿命和细胞内动态分布的实时检测,并且其检测不受细胞体内其他生物组分的干扰。
本发明的目的之二在于提供所述的基于铂络合物的RNA G-四链体特异性荧光探针的制备方法。
本发明的目的之三在于提供所述荧光探针在检测活细胞内RNA G-四链体的应用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的:
一种高度特异性检测活细胞内RNA G-四链体的铂络合物荧光探针,其结构如(I)所示:
其中R1为氢。R2为氢,甲基或苯基。A-为PF6 -阴离子或氯离子。
一种上述荧光探针的制备方法,该方法具体为:将配体与铂前体溶解在醇水混合溶剂中进行回流反应,回流反应得到的产物加入过量的饱和六氟磷酸钾溶液沉淀得到如(I)所示铂络合物荧光探针。其中,配体与铂前体的摩尔比大于1;醇水混合溶剂由与水互溶且沸点高于100℃的有机溶剂与水按体积比1:1混合制得;配体为双(1,10-邻菲罗啉-2-基)胺、双(4,7-二甲基-1,10-邻菲罗啉-2-基)胺或双(4,7-二苯基-1,10-邻菲罗啉-2-基)胺的三氟乙酸盐;铂前体为顺式-二氯二二甲基亚砜合铂。饱和六氟磷酸钾溶液与回流反应得到的产物体积比大于1。
进一步地,所述配体与铂前体的总量与醇水混合溶剂的摩尔体积比为0.01mmol/mL,有机溶剂优选为甲醇、乙醇或乙二醇;饱和六氟磷酸钾溶液与回流反应得到的产物体积比优选为5-10。
上述荧光探针在检测细胞内RNA G-四链体的应用。
进一步地,所述荧光探针在检测固定细胞内RNA G-四链体结构,跟踪活细胞内RNAG-四链体运动过程、折叠去折叠动态变化过程或测定细胞内RNA G-四链体的数量和寿命中的应用。
进一步地,所述荧光探针在检测固定细胞内RNA G-四链体结构的应用中,具体操作方法如下:
将细胞进行固定,并用缓冲溶液清洗,再用含权利要求1所述荧光探针的染色剂对固定细胞进行染色;染色完成后用缓冲溶液清洗固定细胞,即可在荧光显微镜下检测固定细胞内RNA G-四链体结构。
进一步地,所述荧光探针跟踪活细胞内RNA G-四链体运动过程、折叠去折叠动态变化过程、测定细胞内RNA G-四链体的数目的应用中,具体操作方法如下:
将上述荧光探针加入到活细胞培养基中,并进行染色。染色结束后将活细胞用培养基溶液清洗,即可在荧光显微镜下跟踪到细胞内RNA G-四链体的运动过程、折叠去折叠动态变化过程;通过成像软件计算细胞内荧光数目即可测得细胞内RNA G-四链体的数目。
进一步地,测定细胞内RNA G-四链体的寿命中的应用中,具体操作方法如下:
(1)将上述荧光探针加入到活细胞培养基中,并进行染色,染色结束后将活细胞用培养基溶液清洗;
(2)在荧光显微镜下对活细胞连续成像1min,对连续成像获得的60帧图像中固定100像素区域进行提取,将每个区域读取为x和y方向上各有100个像素的二维图像,构建细胞内荧光强度的矩阵Mt,p1,p2,其中t表示成像时间,p1和p2用以指示图中坐标。把矩阵中所有正元素的平均设为阈值TON,即TON=〈Mt,p1,p2>0〉,因此,矩阵Mt,p1,p2可以被转换成具有相同大小的二进制状态函数Mt,p1,p2矩阵。
(3)对于荧光成像中的每一个位置,坐标(p1,p2),若St,p1,p2=1,而St-1,p1,p2=St+1,p1,p2=0,说明该RNA G-四链体具有1秒的持续时间,统计出的RNA G-四链体寿命为1秒的总数。
(4)分析矩阵中St+1,p1,p2至St+n,p1,p2连续为1的位点数目,即St+i,p1,p2=1,i=1~n的位点数目,统计出折叠寿命为n秒的RNA G-四链体的总数。
本发明提供的荧光探针具有以下三个特点,从而成为高效的荧光点亮探针。1)该探针分子中存在氢键的给体和受体,探针分子与溶剂分子结合形成氢键网络使络合物本身的荧光淬灭。当探针分子与RNA G-四链体特异性结合后,RNA G-四链体隔断络合物和溶液分子的氢键网络,恢复荧光信号;2)该探针分子与RNA G-四链体特异性结合后,自身振动和内旋被限制,从而降低了探针荧光由热量消散途径损失,进而增强荧光强度;3)该探针分子在三线态的激发态可以与溶液中的氧气发生能量交换,产生单线态氧,淬灭荧光。RNA G-四链体可以部分阻挡溶液氧气与探针分子的接触,降低探针分子与氧气的能量交换,提高荧光效率。
三个荧光探针都和RNA G-四链体有高度特异性的结合,结合强度在微摩尔级别。同时三个络合物在等当量情况下,对RNA G-四链体没有明显的稳定作用。RNA G-四链体在结合了本发明中的铂络合物后,其变质温度和圆二光谱图都没有呈现明显的变化。因此这三个络合物分子并不是RNA G-四链体的强稳定型配体,与RNA G-四链体结合后不会干扰其解链和折叠过程。
本发明中的三个探针分子可特异性地检测RNA G-四链体。在溶液环境中加入RNAG-四链体后,探针分子于580nm附近呈现强荧光信号。而相同条件下,对其他各类RNA分子和二级结构则没有响应。本发明中的三个探针分子在活细胞内也可对RNA G-四链体实现特异性响应。其荧光位点面积和强度可以用来测定活细胞内RNA G-四链体的数量。共聚焦显微镜下连续成像1分钟后荧光位点的持续时间可用于测定RNA G-四链体在活细胞体内的寿命,进而表征RNA G-四链体的动态折叠过程。
与现有技术相比,本发明具有以下优点和有益效果:
1.此发明是第一例基于无机化合物,对RNA G-四链体具有高度特异识别性的荧光点亮型探针。
2.此发明中的荧光探针斯托克斯位移大,避免了发射光谱和激发光谱的重叠,抗干扰能力强,信噪比高,有利于荧光信号的检测。
3.此发明中的探针不是RNA G-四链体的强稳定型结合分子。与现有G-四链体特异性配体相比,本发明涉及的探针分子不会促进细胞内RNA G-四链体的形成,能有效地避免假阳信号,同时也不会阻碍RNA G-四链体的动态折叠,可以实现对活细胞内RNA G-四链体动态折叠的实时观测。
4.此发明中的荧光探针具有荧光激发态寿命长的特点。其寿命可达传统有机化合物探针的千倍以上,可应用于具有时间分辨功能的成像和光谱检测方法,例如时间分辨发射光谱(Time Resolved Emission Spectra,TRES)。
5.此发明提供的探针细胞渗透性强,无需辅助剂即可进入细胞。同时探针的细胞毒性低。在实际测量中,能够使用远高于现有探针分子的高试剂浓度,能够实现对微量RNAG-四链体的动态二级结构的观测。
6.相对于常见的RNA G-四链体有机荧光染料,此发明中的探针具有更高的荧光量子效率和光稳定性(图8),可以用于活细胞中长时间连续地荧光光学成像观测,实现对细胞内RNA G-四链体的数量和寿命同步跟踪检测。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明;
图1是铂荧光探针1-3的化学结构图。
图2是铂荧光探针1的单晶结构图。
图3是溶液环境中,荧光探针1中滴加不同RNA样品的荧光光谱图。其中荧光探针浓度为1μM,RNA样品浓度为20μM。
图4是经荧光探针1与细胞核染料Hoechst 33258着色的固定HeLa细胞(A)以及上述样品经RNase A(B)和DNase 1(C)处理后的激光共聚焦显微成像。
图5是经荧光探针1和G-四链体抗体BG4染色的固定HeLa细胞的激光共聚焦显微成像(A),其中细胞核由Hoechst 33258着色;使用活Hela细胞并添加不同浓度的BRACO19(B)和PhenDC3(C)到上述体系后的激光共聚焦显微成像及其荧光发光强度(D和E)。
图6是荧光探针1对癌细胞和正常细胞荧光成像的荧光强度。
图7是HeLa和CHO细胞中,RNA G-四链体动态折叠结构的实时追踪。在60s的观测时间内,RNA G-四链体折叠结构在(B)CHO、HeLa(C)MCF 10A、MCF-7及(D)MRC-5、A549细胞内寿命的直方图。
图8是荧光探针1与噻唑橙作为G-四链体荧光探针的光稳定性比较。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及特征优势更易于明白,下面结合附图和具体实施方式,给予详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
下述实施例中,total RNA可购自Takara Bio USA,其他RNA序列可购自Sigma-Aldrich,HeLa细胞、CHO细胞、MCF-7细胞、MCF 10A细胞、A549细胞、MRC-5细胞可购自ATCC。但不限于此。
实施例1:铂无机络合物探针1-3的合成
将双(1,10-邻菲罗啉-2-基)胺三氟乙酸盐(24.5mg,0.05mmol)与顺式-二氯二二甲基亚砜合铂(II)(20.9mg,0.05mmol)混合,溶解在5mL乙二醇和水的混合溶液中(体积比1:1)。将混合物在125℃下搅拌回流1.5小时后,加入5-10当量的饱和六氟磷酸钾溶液,得到橙色沉淀物。过滤后,依次用水、冷甲醇和乙醚洗涤沉淀(每种溶剂3×10mL),得到橙色的铂配合物1(32.5mg,76%)。ESI-MS(MeOH)m/z:567.44(calc 568.10 for C24H16N5Pt)。室温下,将丙酮缓慢扩散到铂配合物1的二甲基亚砜饱和溶液中得到橙色针状晶体。X射线单晶衍射实验结果显示荧光探针1结晶于单斜晶系的P21/c空间群,其晶体学数据列于表1。荧光探针2和3的合成方法与1相似。按照上述合成路线,使用双(4,7-二甲基-1,10-邻菲罗啉-2-基)胺和双(4,7-二苯基-1,10-邻菲罗啉-2-基)胺的三氟乙酸盐作为有机配体与顺式-二氯二二甲基亚砜合铂(II)1:1反应即可得到铂配合物2和3,产率分别为61%和52%。ESI-MS(MeOH)m/z:623.59(calc 624.16 for C28H23N5Pt,荧光探针2)和ESI-MS(MeOH)m/z:871.80(calc 872.22 for C48H31N5Pt,荧光探针3)。
本发明的荧光探针均为基于新型邻菲罗啉配体的铂络合物,单晶衍射结果(表1)表明:络合物的形状和尺寸都高度类似RNA G-四链体中由四个鸟嘌呤形成的G-四分体(quartet)结构(图2)。
表1荧光探针1的晶体学数据表
实施例2:以无机络合物1为代表,检测铂探针对RNA G-四链体的体外识别功能。
测试所用的RNA序列如下:
TERRA:5’-uaggguuagggu-3’
EBNA1:5’-ggggcaggagcaggagga-3’
ssRNA:5’-gggaaggccagggaaucuuccc-3’
tRNA:牛肝转移核糖核酸
total RNA:人体HeLa细胞的总核糖核酸
TERRA与EBNA1为RNA G-四链体折叠结构,由其对应序列的单链在95℃加热5min后缓慢退火至室温而得。
以络合物1为测试荧光探针,将其溶解于DMSO中,配制成2mM的溶液a,再用10mM磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液(pH=7.4)将溶液a稀释到1μM浓度(溶液b)用于体外识别功能探测。
分别向b溶液中加入上述浓度为20μM的RNA溶液,检测荧光探针1中加入不同RNA序列前后的荧光谱图,计算并比较对应荧光的量子产率。测试结果如图3所示,量子产率如表2中所列。
表2荧光探针1加入不同RNA样品后的量子产率(Φem)
测试结果表明,铂探针1自身荧光信号很弱,加入RNA G-四链体结构后产生明显的荧光点亮效应,溶液在580nm处发射出很强的荧光信号,其荧光量子产率高达0.366;而加入单链和双链RNA结构所发射的荧光信号则弱很多,其荧光量子产率仅为G-四链体结构时的六十分之一。由此说明,铂探针1可以实现体外RNA G-四链体的特异性识别。此外,加入小牛肝脏的tRNA或人HeLa细胞总RNA提取液,铂探针1都没有产生明显的荧光点亮效应。进一步证实铂探针1特异性识别RNA G-四链体结构,同时也排除了后续细胞实验中可能存在的干扰信号。
实施例3:以无机络合物1为代表,测试铂探针对固定细胞内RNA G-四链体的特异性识别性能。
步骤一:将HeLa细胞(人宫颈癌细胞)接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,放置在37℃,5%CO2气氛的细胞培养箱内培养。待细胞铺满瓶底的80%时,用0.25%的胰蛋白酶消化细胞,取4×104个细胞接种到含有1mL培养基的成像培养皿中,培养24h。
步骤二:吸出培养皿中的培养基,用PBS缓冲液冲洗三次以除去游离的培养基成分。加入含有4%多聚甲醛的PBS缓冲液,在室温下静置15min,固定细胞。
步骤三:吸出培养皿中的多聚甲醛/PBS溶液,用PBS缓冲液冲洗三次。加入含有0.5%TritonX-100的PBS缓冲液,将培养皿置于37℃的培养箱30min,渗透细胞。吸出TritonX-100的PBS缓冲液,再用PBS缓冲液冲洗三次。
步骤四:取5μM的铂探针1与1μg mL-1Hoechst 33258的混合溶液加入到步骤三处理好的细胞中,将培养皿置于37℃的培养箱20min。吸出上述混合溶液,再用PBS缓冲液冲洗三次,进行荧光成像,结果如图4A所示。
步骤五:取120U mL-1的DNase I加入到步骤三处理好的细胞中,将培养皿置于37℃的培养箱3h。吸出溶液,再用PBS缓冲液冲洗三次。取5μM的铂探针1与1μg mL-1Hoechst33258的混合溶液加入培养皿中,于37℃孵育20min后,吸出混合液,用PBS冲洗三次,进行荧光成像,结果如图4C所示。
步骤六:取100μg mL-1的RNase A加入到步骤三处理好的细胞中,将培养皿置于37℃的培养箱3h。吸出溶液,用PBS冲洗三次。取5μM的铂探针1与1μg mL-1Hoechst 33258的混合溶液加入培养皿中,于37℃孵育20min后,吸出混合液,再用PBS冲洗三次,进行荧光成像,结果如图4B所示。
步骤七:取含有5%牛血清白蛋白的PBS缓冲液加入到步骤三处理好的细胞中,将培养皿置于37℃的培养箱中,封闭细胞1h。吸出溶液,用PBS冲洗三次。加入G-四链体抗体-BG4,于37℃孵育2h,用PBS冲洗三次后,加入抗His-Tag抗体继续37℃孵育2h,再用PBS冲洗三次后,然后加入Alexa 647标记的二抗在37℃下继续孵育1h,用PBS冲洗三次。取5μM的铂探针1加入培养皿中,于37℃孵育20min后,吸出混合液,再用PBS冲洗三次,进行铂探针1与BG4抗体荧光共成像,结果如图5A所示。
从图4A可以看到,固定的HeLa细胞经铂探针1染色后,在细胞核和细胞质中都显示出多处独立的强荧光点。然而,分别用DNase I和RNase A处理后,对应的细胞核和细胞质中荧光信号消失(图4B和4C)。这意味着所观测到的固定细胞中的荧光信号来自铂探针1与细胞内RNA二级结构的结合。此外,如图5A所示,铂探针1与G-四链体特异性抗体(BG4)共成像的结果显示,二者的荧光信号能够很好的重叠,从而证实了无机络合物1作为荧光探针,能够特异性地靶向细胞质中的RNA G-四链体结构。
实施例4:以无机络合物1为代表,测试铂探针对活细胞内RNA G-四链体的特异性识别性能
步骤一:取4×104个HeLa细胞接种到含有1mL 10%胎牛血清的DMEM培养基中,将成像培养皿置于37℃,5%CO2气氛的细胞培养箱内培养24h。
步骤二:吸出培养基,加入含有5μM的铂探针1和不同浓度的BRACO19或PhenDC3(0,5,10和20μM)的DMEM培养基,继续孵育24h。
步骤三:吸出步骤二中的溶液,用PBS冲洗三次。取含有1μg mL-1Hoechst 33258的DMEM培养基加入培养皿中,继续孵育3h。
步骤四:吸出步骤三中的溶液,用PBS冲洗三次。向培养皿中加入FluoroBriteDMEM培养基,进行荧光成像,结果如图5B和5C所示。
如图5B和5C所示,铂探针1与两种已知的G-四链体强稳定剂的细胞内竞争试验显示,随着任意一种G-四链体稳定剂浓度的增加,细胞内荧光点数目和强度呈明显下降。当稳定剂的浓度为铂探针1的四倍时,过量的竞争性结合导致荧光点几乎完全消失(图5D和5E)。这一反相关性表明铂探针1与已知的候选药物在RNA G-四链体上具有相同的结合位点,进一步确认了荧光探针无机络合物1能够特异地选择性识别活细胞中的RNA G-四链体结构。
实施例5:以无机络合物1为代表,利用本专利提供的荧光探针探索癌细胞和正常细胞内RNA G-四链体的数量和折叠动力学的区别。
步骤一:取4×104个HeLa细胞(人宫颈癌细胞)接种到含有1mL 10%胎牛血清的DMEM培养基中,将成像培养皿置于37℃,5%CO2气氛的细胞培养箱内培养24h。
步骤二:取4×104个CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)接种到含有1mL 10%胎牛血清的DMEM/Ham’s F-12培养基中,将成像培养皿置于37℃,5%CO2气氛的细胞培养箱内培养24h。
步骤三:取4×104个MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)接种到含有1mL 10%胎牛血清的DMEM培养基中,将成像培养皿置于37℃,5%CO2气氛的细胞培养箱内培养24h。
步骤四:取4×104个MCF 10A细胞(人正常乳腺上皮细胞)接种到含有1mL 10%胎牛血清,0.5‰氢化可的松,1‰胰岛素和2‰表皮生长因子的DMEM/Ham’s F-12培养基中,将成像培养皿置于37℃,5%CO2气氛的细胞培养箱内培养24h。
步骤五:取4×104个A549细胞(人肺癌细胞)接种到含有1mL 10%胎牛血清的DMEM培养基中,将成像培养皿置于37℃,5%CO2气氛的细胞培养箱内培养24h。
步骤六:取4×104个MRC-5细胞(人胚肺细胞)接种到含有1mL 10%胎牛血清的EMEM培养基中,将成像培养皿置于37℃,5%CO2气氛的细胞培养箱内培养24h。
步骤七:吸出步骤一到六中的培养基,分别加入含有5μM的铂探针1的培养基,继续孵育24h。
步骤八:吸出步骤七中的溶液,用PBS冲洗三次。取含有1μg mL-1Hoechst 33258的各自培养基加入成像培养皿中,继续孵育3h。
步骤九:吸出步骤八中的溶液,用PBS冲洗三次。向各培养皿中加入FluoroBriteDMEM培养基。利用ZEISS LSM 800激光共聚焦显微镜对各细胞荧光成像,并用Volocity 6.3软件进行细胞内荧光数目和强度分析。结果如图6所示。
步骤十:以1秒的间隔对上述六种细胞连续成像1分钟,利用ZEN 2.3软件对60帧图像中固定区域(100像素×100像素)进行提取,将每个区域读取为x和y方向上各有100个像素的二维图像,用以构建细胞内荧光强度的矩阵Mt,p1,p2,其中t表示成像时间,p1和p2用以指示图中坐标。把矩阵中所有正元素的平均设为阈值,即TON=〈Mt,p1,p2>0〉,用以消除铂探针1在各细胞系中荧光强度的显著差异。因此,矩阵Mt,p1,p2可以被转换成具有相同大小的二进制状态函数St,p1,p2矩阵。
对于荧光成像中的每一个位置,坐标(p1,p2),如果St,p1,p2=1,而St-1,p1,p2=St+1,p1,p2=0,这样的RNA G-四链体具有1秒的持续时间,并将统计出的St,p1,p2稳定性为1s的总数设置为频率计数。同样的,对持续时间较长(矩阵中St+1,p1,p2至St+n,p1,p2连续为1的位点数目,即St+i,p1,p2=1,i=1~n的位点数目,统计出折叠寿命为n秒的RNA G-四链体的总数。)的RNA G-四链体进行类似的技术分析和绘制,得到各细胞系中RNA G-四链体的折叠动力学寿命的直方图(图7)。
如图7所示,在上述六种细胞系中,都观测到了不同强度和数目的荧光点。铂探针1的荧光点在三种正常细胞系(CHO,MCF 10A和MRC-5)中的数目和强度小于其所对应的癌细胞系(HeLa,MCF-7和A549)。其中,HeLa细胞中的荧光点数目和强度约为CHO细胞的60倍之多。这表明癌细胞中的RNA G-四链体的数目远多于对应的体细胞。此外,以HeLa细胞和CHO细胞为例,对这些荧光信号进行60秒持续观测结果显示,无论是在正常细胞还是癌细胞系中,这些荧光点都不是静止的,而是不停地快速闪烁,表明RNA G-四链体在活细胞中是以动态折叠和解折叠的形式存在(图7A)。如图7B所示,CHO细胞中95%的RNA G-四链体荧光点不会出现在两帧时间相邻的图像中,这表明健康细胞中的RNA G-四链体大多在1秒内解折叠,而HeLa细胞中40%的荧光点可以持续出现超过1秒,最长可达7秒。同时,其他两个细胞对照组也展现出了与之类似的现象(图7C和7D),虽然正常细胞中的荧光信号低于癌细胞,但RNAG-四链体折叠在体细胞(MCF 10A和MRC-5)中折叠与解折叠的活跃度明显高于对应的癌细胞(MCF-7和A549)。
上述实验结果表明,本发明所述的铂荧光探针具有特异性识别活细胞内RNA G-四链体的功能,并能够用于追踪RNA G-四链体在癌细胞系和正常细胞系中的实时分布情况。癌细胞中RNA G-四链体荧光信号的数量、强度较高,但折叠与解折叠的动态过程较为缓慢,揭示了RNA G-四链体的数量和折叠动力学与其生物学功能和致病机理相关。
图8是是荧光探针1与噻唑橙作为G-四链体荧光探针的光稳定性比较,结果表明相对于常见的RNA G-四链体有机荧光染料,此发明中的探针具有更高的荧光量子效率和光稳定性,可以用于活细胞中长时间连续地荧光光学成像观测,实现对细胞内RNA G-四链体的数量和寿命同步跟踪检测。
Claims (8)
2.一种权利要求1所述荧光探针的制备方法,其特征在于,该方法具体为:将配体与铂前体溶解在醇水混合溶剂中进行回流反应,回流反应得到的产物加入过量的饱和六氟磷酸钾溶液沉淀得到如(I)所示铂络合物荧光探针;其中,配体与铂前体的摩尔比大于1;醇水混合溶剂由与水互溶且沸点高于100℃的有机溶剂与水按体积比1:1混合制得;配体为双(1,10-邻菲罗啉-2-基)胺、双(4,7-二甲基-1,10-邻菲罗啉-2-基)胺或双(4,7-二苯基-1,10-邻菲罗啉-2-基)胺的三氟乙酸盐;铂前体为顺式-二氯二二甲基亚砜合铂;饱和六氟磷酸钾溶液与回流反应得到的产物体积比大于1。
3.根据权利要求2所述荧光探针的制备方法,其特征在于,所述配体与铂前体的总量与醇水混合溶剂的摩尔体积比为0.01mmol/mL,有机溶剂优选为甲醇、乙醇或乙二醇;饱和六氟磷酸钾溶液与回流反应得到的产物体积比优选为5-10。
4.权利要求1所述荧光探针在检测细胞内RNA G-四链体的应用。
5.根据权利要求4所述应用,其特征在于,所述荧光探针在检测固定细胞内RNA G-四链体结构,跟踪活细胞内RNA G-四链体运动过程、折叠去折叠动态变化过程或测定细胞内RNAG-四链体的数量和寿命中的应用。
6.根据权利要求5所述应用,其特征在于,所述荧光探针在检测固定细胞内RNA G-四链体结构的应用中,具体操作方法如下:
将细胞进行固定,并用缓冲溶液清洗,再用含权利要求1所述荧光探针的染色剂对固定细胞进行染色;染色完成后用缓冲溶液清洗固定细胞,即可在荧光显微镜下检测固定细胞内RNA G-四链体结构。
7.根据权利要求5所述应用,其特征在于,所述荧光探针跟踪活细胞内RNA G-四链体运动过程、折叠去折叠动态变化过程、测定细胞内RNA G-四链体的数量的应用中,具体操作方法如下:
将权利要求1所述荧光探针加入到活细胞培养基中,并进行染色;染色结束后将活细胞用培养基溶液清洗,即可在荧光显微镜下跟踪到细胞内RNA G-四链体的运动过程、折叠去折叠动态变化过程;通过成像软件计算细胞内荧光数量即可测得细胞内RNA G-四链体的数量。
8.根据权利要求5所述应用,其特征在于,测定细胞内RNA G-四链体的寿命中的应用中,具体操作方法如下:
(1)将权利要求1所述荧光探针加入到活细胞培养基中,并进行染色,染色结束后将活细胞用培养基溶液清洗;
(2)在荧光显微镜下对活细胞连续成像1min,对连续成像获得的60帧图像中固定100像素区域进行提取,将每个区域读取为x和y方向上各有100个像素的二维图像,构建细胞内荧光强度的矩阵Mt,p1,p2,其中t表示成像时间,p1和p2用以指示图中坐标;把矩阵中所有正元素的平均设为阈值TON,即TON=〈Mt,p1,p2>0〉,因此,矩阵Mt,p1,p2可以被转换成具有相同大小的二进制状态函数Mt,p1,p2矩阵;
(3)对于荧光成像中的每一个位置,坐标(p1,p2),若St,p1,p2=1,而St-1,p1,p2=St+1,p1,p2=0,说明该RNA G-四链体具有1秒的持续时间,统计出的RNA G-四链体寿命为1秒的总数;
(4)分析矩阵中St+1,p1,p2至St+n,p1,p2连续为1的位点数目,即St+i,p1,p2=1,i=1~n的位点数目,统计出折叠寿命为n秒的RNA G-四链体的总数。
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