CN107200718B - 检测dna g-四链体的化合物、方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了化合物、检测DNA G‑四链体的方法、试剂盒及化合物或试剂盒在检测DNA G‑四链体中的用途。所述化合物为式(I)所示的化合物或式(I)所示化合物的盐，R为C2～6烷基或者苯基；R’为C1～6烷基、C1～6烷氧基、氨基、卤素、苯基、C1～6杂环基或者C1～6杂芳基；X为C、O、S、Se或Te原子，其中，所述烷基、苯基、烷氧基、氨基、杂环基或者杂芳基均可任选地被一个或者多个选自烷基、磺酸基或者烷氧基的基团所取代。本发明的化合物具有良好的生物相容性，细胞毒性小，对DNA G‑四链体结构具有较高的选择性，适用于细胞(尤其是活细胞)内DNA G‑四链体的检测，检测的准确性强、灵敏度高、稳定性好且操作简便。

Description

检测DNA G-四链体的化合物、方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及检测DNA G-四链体的化合物、方法及试剂盒。更具体地，本发明涉及化合物、检测DNA G-四链体的方法、试剂盒及化合物或试剂盒在检测DNA G-四链体中的用途。
背景技术
G-四链体是由富含鸟嘌呤碱基的单链DNA在一价阳离子(如K+和Na+)的条件下通过分子间氢键作用形成的一种特殊的DNA二级结构。G-四链体具有平行、反平行和(3+1)杂合型等多种不同的拓扑结构。更重要的是，G-四链体在生物体内具有丰富的生物学功能。计算机模拟计算表明，在人体基因组中大约含有376000个可以形成G-四链体的序列，它们主要位于端粒和一些重要的原癌基因(包括c-myc、VEGF、K-ras、BCl-2、c-kit等)的启动子区。DNA G-四链体在调控这些基因的转录、复制和重组以及保持端粒稳定性方面具有重要作用。
然而，目前检测DNA G-四链体的方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了化合物、检测DNA G-四链体的方法、试剂盒及化合物或试剂盒在检测DNA G-四链体中的用途。本发明的化合物具有良好的生物相容性，细胞毒性小，对DNA G-四链体结构具有较高的选择性，适用于细胞(尤其是活细胞)内DNA G-四链体的检测，检测的准确性强、灵敏度高、稳定性好且操作简便。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
目前，大多探针基本上都无法用于活细胞内DNA G-四链体结构的检测。体内G-四链体的识别和检测存在三个关键性的问题：(1)G-四链体靶点是结构特异性并非序列特异性的，使得传统的核酸检测方法无法使用，需要使用具有结构特异性的检测手段；(2)G-四链体并非单独存在，而是嵌在基因组DNA的双螺旋二级结构之间，因此该检测方法必须仅能识别G-四链体结构而不响应双螺旋结构；(3)G-四链体序列在整个基因组中的含量甚微，几乎被淹没在基因组DNA双螺旋结构的“海洋”中。
目前对细胞内DNA G-四链体的检测主要基于特异性抗体的免疫荧光分析方法和少数小分子荧光探针两类方法：
(1)免疫荧光分析技术：该方法是利用生物学技术合成或筛选能够与G-四链体结构特异性结合的抗体，然后通过免疫荧光分子来检测G-四链体结构。采用抗体检测细胞内DNA G-四链体的存在，具有特异性好、灵敏度高的优点。但这种特异性抗体的筛选难度大、成本高，不容易获得；另外抗体本身是蛋白质大分子，不易通过活细胞的细胞膜，因此在使用时需要对细胞进行固定和通透等处理才能使抗体进入细胞核。这些方面的缺陷极大地限制了基于抗体的免疫荧光分析方法在活细胞中检测DNA G-四链体中的用途。
(2)少数小分子荧光探针：该方法是在传统G-四链体特异性地有机小分子基础上进行性能的优化和改善，重新设计和开发新型的荧光小分子探针以实现在活细胞内检测G-四链体结构。一般这类荧光小分子需要具备几点特征：1)具有良好的生物相容性，能够进入活细胞的细胞核，而且细胞毒性很小；2)对细胞内的DNA G-四链体结构没有稳定和诱导作用；3)对DNA G-四链体结构具有较高的选择性和灵敏度，而对单链或双链DNA没有响应；4)该小分子与DNA G-四链体结合之后荧光强度显著增加或者荧光寿命显著延长。目前已经被报道的这类探针的代表是DAOTA-M2，该小分子探针能够进入活细胞细胞核，而且在体外与DNA G-四链体作用的荧光寿命明显比单链或双链DNA更长，因此被用于活细胞内DNA G-四链体的检测。但该探针只能通过荧光寿命的手段来检测DNA G-四链体，因为它与G-四链体、RNA、单链DNA和双链DNA作用的荧光强度差异不大。荧光寿命的方法对仪器设备具有较高的要求，而且获取数据需要较长时间，不方便对活细胞内DNA G-四链体结构进行实时、可视化检测。
有鉴于此，发明人经过大量实验，设计合成了一种化合物，该化合物可以作为小分子荧光探针，利用该探针在溶液体系中使用识别和区分DNA G-四链体和其他的寡聚核苷酸构型(如单链DNA、双链DNA、RNA和i-motif等)，并实现了利用该探针在染色体和活细胞水平标记DNA G-四链体结构，通过荧光强度检测手段确定DNA G-四链体含量。本发明的化合物具有良好的生物相容性，细胞毒性小，对DNA G-四链体结构具有较高的选择性，适用于细胞(尤其是活细胞)内DNA G-四链体的检测，检测的准确性强、灵敏度高、稳定性好且操作简便。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种化合物。根据本发明的实施例，所述化合物其为式(I)所示的化合物或式(I)所示化合物的盐：
R为C2～6烷基或者苯基；
R’为氢、C1～6烷基、C1～6烷氧基、氨基、卤素、苯基、C1～6杂环基或者C1～6杂芳基；
X为C、O、S、Se或Te原子，
其中，所述烷基、苯基、烷氧基、氨基、杂环基或者杂芳基均可任选地被一个或者多个选自烷基、磺酸基或者烷氧基的基团所取代。
发明人发现，该化合物能够作为DNA G-四链体识别探针，该探针具有良好的生物相容性，细胞毒性小，对DNA G-四链体结构具有较高的选择性，能够进入活细胞的细胞核，与活细胞内DNA G-四链体作用，可用于细胞(尤其是活细胞)内DNA G-四链体的可视化检测。另外，该化合物的水溶液稳定性好，可长时间储存，能很好保证用途测试效果。而且，利用该化合物检测的准确性强、灵敏度高、稳定性好且操作简便。
根据本发明的实施例，上述化合物还可以进一步具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述R为C2～6烷基或者苯基，所述烷基可任选地被一个或者多个选自烷基的基团所取代。
根据本发明的实施例，所述杂环基或者杂芳基中杂原子分别独立地为N、S或者O原子。
根据本发明的实施例，所述化合物具有式(2)所示的结构：
其中，所述Y为阴离子，优选卤素阴离子。
根据本发明的实施例，所述化合物具有下列之一的结构：
或者
在本发明的另一方面，本发明提出了一种检测DNA G-四链体的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使细胞与前面所述化合物进行接触；以及对所述接触后的细胞进行观察，以便确定所述细胞中DNA G-四链体含量。发明人发现，该化合物具有良好的生物相容性，细胞毒性小，对DNA G-四链体结构具有较高的选择性，适用于细胞(尤其是活细胞)内DNA G-四链体的检测。由此，根据本发明实施例的检测DNA G-四链体的方法准确性强、灵敏度高、稳定性好且操作简便。
根据本发明的实施例，将所述接触后细胞的细胞核进行染色定位处理；以及基于所述细胞核内的荧光强度和荧光亮点的数目，以便确定所述细胞中DNA G-四链体含量。由此，根据本发明实施例的检测DNA G-四链体的方法进一步具有较强的准确性、较高的灵敏度、较好的稳定性或者较简便的操作。
根据本发明的实施例，所述细胞为活细胞。由此，根据本发明实施例的检测DNA G-四链体的方法进一步具有较强的准确性、较高的灵敏度、较好的稳定性或者较简便的操作。
根据本发明的实施例，所述接触是将所述细胞与所述化合物进行共培养1～48小时。由此，根据本发明实施例的检测DNA G-四链体的方法进一步具有较强的准确性、较高的灵敏度、较好的稳定性或者较简便的操作。
根据本发明的实施例，所述染色处理是利用59染色剂进行的。由此，根据本发明实施例的检测DNA G-四链体的方法进一步具有较强的准确性、较高的灵敏度、较好的稳定性或者较简便的操作。
根据本发明的实施例，所述荧光强度的测定是利用激光共聚焦仪器进行的，其中，所述激光共聚焦仪器中包括：所述化合物的检测通道以及所述染色剂的检测通道，所述化合物检测通道的激发波长为405nm，收集波长范围为425～525nm；所述染色剂检测通道的激发波长为635nm，收集波长范围为650～750nm。由此，根据本发明实施例的检测DNA G-四链体的方法进一步具有较强的准确性、较高的灵敏度、较好的稳定性或者较简便的操作。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括前面所描述的化合物。由此，利用根据本发明实施例的试剂盒能够有效地检测DNAG-四链体，且检测结果的准确性强、灵敏度高、稳定性好以及操作简便。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述化合物或试剂盒在检测DNA G-四链体中的用途。由此，利用该化合物或者试剂盒能够有效地检测DNA G-四链体，且检测结果的准确性强、灵敏度高、稳定性好以及操作简便。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的检测DNA G-四链体的方法的流程示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的显示了IMT探针标记活细胞Hela细胞的显微镜图(放大倍数100倍)，其中(a)IMT分子与细胞核染料59共同与Hela细胞孵育，标尺：20μm，左侧图为细胞核，右侧图为细胞；(b)只有细胞核染料59与Hela细胞一起孵育，标尺：20μm，左侧图为细胞核，右侧图为细胞；
图3显示了根据本发明一个实施例的显示了IMT探针标记活细胞HUVEC细胞的显微镜图(放大倍数100倍)，其中(a)IMT分子与细胞核染料59共同与HUVEC细胞孵育，标尺：20μm，左侧图为细胞核，右侧图为细胞；(b)只有细胞核染料59与HUVEC细胞一起孵育，标尺为20μm，左侧图为细胞核，右侧图为细胞；以及
图4～9分别显示了根据本发明一个实施例的活细胞Hela细胞的显微镜图(放大倍数100倍)。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
本发明提出了化合物、检测DNA G-四链体的方法、试剂盒及化合物或试剂盒在检测DNA G-四链体中的用途，下面将分别对其进行详细描述。
化合物
在本发明的一个方面，本发明提出了一种化合物。根据本发明的实施例，该化合物其为式(I)所示的化合物或式(I)所示化合物的盐：
R为C2～6烷基或者苯基；
R’为氢、C1～6烷基、C1～6烷氧基、氨基、卤素、苯基、C1～6杂环基或者C1～6杂芳基；
X为C、O、S、Se或Te原子，
其中，所述烷基、苯基、烷氧基、氨基、杂环基或者杂芳基均可任选地被一个或者多个选自烷基、磺酸基或者烷氧基的基团所取代。
发明人发现，该化合物能够作为DNA G-四链体识别探针，该探针具有良好的生物相容性，细胞毒性小，对DNA G-四链体结构具有较高的选择性，能够进入活细胞的细胞核，与活细胞内DNA G-四链体作用，产生可检测信号，可用于细胞(尤其是活细胞)内DNA G-四链体的可视化检测，例如荧光强度检测。另外，该化合物的水溶液稳定性好，可长时间储存，能很好保证用途测试效果。而且，利用该化合物检测的准确性强、灵敏度高、稳定性好且操作简便。然而，其他化合物的检测效果不佳。
需要说明的是，一个连接键连接到中心的环上形成的环体系(如式a所示)代表连接键可以在B环上任何可连接的位置与分子其余部分相连。式a代表B环上任何可能连接的位置均可与分子其余部分相连。
根据本发明的实施例，R为C2～6烷基或者苯基，烷基可任选地被一个或者多个选自烷基的基团所取代。根据本发明的具体实施例，该化合物具有式(2)所示的结构，其中，所述Y为阴离子，优选卤素阴离子。发明人发现，当R为烷基或者苯基时，式(1)所示化合物为阳离子，引入阴离子Y(亦称作反离子)，以保证式(1)所示化合物的盐(式(2)所示化合物)呈电中性，为离子型化合物。
根据本发明的实施例，R为苯基，苯基被烷基所取代；或者R为烷基，烷基被磺酸基所取代时，式(1)所示化合物呈电中性，无需反离子存在。
根据本发明的实施例，杂环基或者杂芳基中杂原子分别独立地为N、S或者O原子。
根据本发明的实施例，该化合物具有下列之一的结构。发明人发现，相比于其他化合物，下述化合物能够较好地识别和区分DNA G-四链体和其他的寡聚核苷酸构型(如单链DNA、双链DNA、RNA和i-motif等)，并实现了利用该化合物在染色体和活细胞水平标记DNAG-四链体结构，并实现可视化检测。本发明的化合物具有良好的生物相容性，细胞毒性小，对DNA G-四链体结构具有较高的选择性，适用于细胞(尤其是活细胞)内DNA G-四链体的检测，检测的准确性强、灵敏度高、稳定性好且操作简便。
检测DNA G-四链体的方法
在本发明的另一方面，本发明提出了一种检测DNA G-四链体的方法。根据本发明的实施例，参见图1，该方法包括：S100接触以及S200确定DNA G-四链体含量。由此，根据本发明实施例的检测DNA G-四链体的方法准确性强、灵敏度高、稳定性好且操作简便。
根据本发明的实施例，该方法包括：
S100接触
在该步骤中，使细胞与前面所描述的化合物进行接触。
需要说明的是，对于接触方式不作严格限定，可以根据实际需要进行选择。根据本发明的具体实施例，接触是将细胞与化合物进行共孵育1～48小时。具体地，将化合物加入至含有细胞的培养皿中进行共孵育。发明人发现，在此条件下能够使得化合物与细胞内的DNA G-四链体发生特异性结合，便于后续检测。
S200确定DNA G-四链体含量
在该步骤中，对所述接触后的细胞进行观察，以便确定所述细胞中DNA G-四链体含量。
发明人发现，将细胞与化合物接触后，化合物可以进入细胞核，与细胞核的DNA G-四链体结合，使得该化合物产生可检测信号。通过仪器检测该信号，从而能够确定细胞中DNA G-四链体含量。
根据本发明的实施例，该方法进一步包括：将所述接触后细胞的细胞核进行染色定位处理；以及基于所述细胞核内的荧光强度和荧光亮点的数目，以便确定所述细胞中DNAG-四链体含量。DNA G-四链体存在于细胞核，通过对细胞核进行染色定位，便于快速找到细胞核，进而检测到结合有DNA G-四链体的化合物产生的信号，从而能够快速且准确地确定DNA G-四链体含量。
根据本发明的实施例，荧光强度的测定是利用激光共聚焦仪器进行的，其中，激光共聚焦仪器中包括：化合物的检测通道以及染色剂的检测通道，化合物检测通道的激发波长为405nm，收集波长范围为425～525nm；染色剂检测通道的激发波长为635nm，收集波长范围为650～750nm。激光共聚焦显微镜可以用来观察不同的荧光探针分子在细胞内的染色情况，由于化合物在425～525nm波长处能够产生光信号，所以通过化合物检测通道产生的光信号，确定DNA G-四链体含量。若预先对接触后的细胞进行染色定位处理，那么染色剂在650～750nm波长处能够产生光信号，且该光信号与化合物所产生的光信号可以明显区分，不会相互重叠，进而通过染色剂检测通道产生的光信号快速找到细胞核，再通过化合物检测通道产生的光信号确定DNA G-四链体含量。由此，根据本发明实施例的检测DNA G-四链体的方法进一步具有较强的准确性、较高的灵敏度、较好的稳定性或者较简便的操作。
发明人发现，该化合物具有良好的生物相容性，细胞毒性小，对DNA G-四链体结构具有较高的选择性，适用于细胞(尤其是活细胞)内DNAG-四链体的检测。由此，根据本发明实施例的检测DNA G-四链体的方法准确性强、灵敏度高、稳定性好且操作简便。
根据本发明的实施例，细胞为活细胞。发明人发现，现有技术中大多数检测DNAG-四链体的探针都仅能够检测死细胞(固定细胞)，无法检测活细胞中DNA G-四链体。本发明的化合物不仅能够与死细胞中的DNA G-四链体发生特异性结合，还可以与活细胞中的DNAG-四链体特异性结合。由此，根据本发明实施例的检测DNA G-四链体的方法准确性强、灵敏度高、稳定性好且操作简便。
需要说明的是，对于染色处理所需要的染色剂的种类不作严格限定，可以根据实际需要进行选择，只要能够实现对细胞核进行染色，使其便于后续检测中观察即可。根据本发明的实施例，染色处理是利用59染色剂进行的。59染色剂是一种可用于染活细胞细胞核的染料，因为其激发波长和发射波长范围可以与本发明的化合物区分开来，所以选择用其来染活细胞细胞核，从而提高检测结果的准确性。
试剂盒
在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前面所描述的化合物。由此，利用根据本发明实施例的试剂盒能够有效地检测DNA G-四链体，且检测结果的准确性强、灵敏度高、稳定性好以及操作简便。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对化合物所描述的特征和优点，同样适用于该试剂盒，在此不再赘述。
用途
在本发明的又一方面，本发明提出了前面化合物或试剂盒在检测DNA G-四链体中的用途。由此，利用该化合物或者试剂盒能够有效地检测DNA G-四链体，且检测结果的准确性强、灵敏度高、稳定性好以及操作简便。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对化合物和试剂盒所描述的特征和优点，同样适用于该化合物或试剂盒在检测DNA G-四链体中的用途，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
在该实施例中，按照下列方法合成式(3)所示化合物(简称IMT)：
1)合成T1化合物
将1.396g(8.5mmol)2-氨基-6-甲基苯并噻唑和2.73g(12.75mmol)4-甲基苯磺酸异丙酯加入到密封管中150℃加热反应13h。得到的粗产物用乙酸乙酯悬浮，然后用乙醚清洗两次。得到的固体沉淀物通过丙酮重结晶进行进一步分离纯化，最终得到1.2g灰白色的T1化合物，产率40％。T1化合物的1H-NMR(400MHz,DMSO)δ9.88(2H,s)7.80-7.78(2H d)7.48-7.46(2H d)7.35-7.33(2H d)7.11-7.09(2H d)2.38(3H s)2.28(3H s)1.60-1.59(6Hd)；ESI-MS正离子峰在m/z＝207.0位置,计算的结果是[M+]＝207.3，实验和计算结果基本是一致的。
2)合成T2化合物
向47mL质量分数50％的KOH溶液和50mL乙二醇的混合溶液中加入1.3g T1化合物，反应混合物在氮气保护的环境中200℃加热回流24h，然后在空气中继续搅拌反应24h。反应混合物冷却至室温，用饱和的NH4Cl溶液稀释，接着用CH2Cl2进行萃取。得到的有机相用Na2SO4来干燥，然后过滤。过滤得到的液体旋干，得到的产物通过硅胶色谱柱进行进一步分离纯化，梯度分离的条件是乙酸乙酯在石油醚中的比例是0％～2％，得到472.9mg黄色油状T2化合物，产率77.1％。T2化合物的1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.05-7.01(4H,t)6.53-6.51(2H d)3.57-3.54(2H m)2.41(6H s)1.12-1.11(12H d)；ESI-MS正离子峰在m/z＝361.3位置，计算的结果是[M+]＝361.6，实验和计算结果基本是一致的。
3)合成T3化合物：
将107.1mg的步骤二得到的T2化合物和4.7mL干燥的乙醇在0℃的冰水浴中搅拌15min，然后加入224mg的NaBH4固体。混合物在室温下搅拌反应8h。将反应混合体系旋干，将剩余的残留物用乙酸乙酯悬浮，倾倒入冷水中。有机层用水洗，然后用Na2SO4干燥。最后，过滤除去Na2SO4，溶剂旋蒸干，得到107mg粗产物T3化合物。ESI-MS正离子峰在m/z＝181.0位置，计算的结果是[M+]＝181.1，实验和计算结果基本是一致的。
4)合成式(3)所示化合物：
向185mg T3化合物和8.2mL干燥的MeCN混合体系中加入388mg(2.11mmol)的4-二甲氨基苯甲酰氯，混合物在室温下搅拌反应18h。反应混合体系用是水稀释，产物用CH2Cl2萃取。有机层用Na2SO4干燥，然后过滤除去Na2SO4。将滤液旋干，得到的产物通过硅胶色谱柱进行进一步分离纯化，梯度分离的条件是甲醇在CH2Cl2中的比例是0％～4％，得到15mg黄色粉末状式(3)所示化合物，产率4.3％。式(3)所示化合物的1H-NMR(400MHz,CDOD)δ8.30-8.28(H,d)8.00(1H s)7.19-7.17(3H d)6.96-6.94(2H d)3.12(6H s)2.54(3H,s)1.84-1.82(6Hd)；ESI-MS正离子峰在m/z＝311.2位置,计算的结果是[M+]＝311.16，实验和计算结果基本是一致的。
实施例2
在该实施例中，按照下列方法对活细胞系Hela的DNA G-四链体结构进行检测。
1)活细胞培养
宫颈癌(Hela)细胞在包含10％胎牛血清(FBS)和1％100U/mL双抗的DMEM培养基、在5％CO2、37℃条件下培养48h。
2)配制探针溶液
将合成的IMT分子溶在甲醇中配成1M母液，然后用水稀释成500μM的探针溶液。
3)对活细胞进行染色
细胞在共聚焦培养皿中生长24h，加入2μM的探针溶液与细胞共同培养2h。除去细胞培养液，用PBS(pH 7.4)缓冲液溶液洗涤细胞三次，然后用59细胞核染料对细胞核进行共染。
图2显示了IMT探针标记活细胞Hela细胞的染色结果。可以看出，图(a)中IMT标记的细胞核中出现均匀的荧光亮点，而对照的图(b)中没有加IMT，细胞核中没有荧光亮点，说明IMT在细胞核中特异性地与DNA G-四链体作用，产生可检测信号。
4)激光共聚焦显微镜观察
在型号为OLYMPUS FV1000-IX81的激光共聚焦仪器观察细胞染色情况，在100×油镜下使用。第一个通道：IMT探针分子通道，激发波长405nm，收集波长范围425～525nm；第二个通道：59细胞核染料通道，激发波长635nm，收集波长范围650～750nm。
第一个通道观察到是IMT探针分子的染色结果，第二个通道观察到的是活细胞细胞核染料59的染色结果。第一个通道观察到了均匀的荧光亮点，代表的是探针分子IMT与细胞核内DNA G-四链体作用的结果；第二个通道内位置标记处的是细胞核的位置。
基于细胞核内荧光强度和荧光亮点数量的，以便对细胞内DNA G-四链体含量进行定性分析。
实施例3
在该实施例中对活细胞系人类脐带血内皮细胞(HUVEC)中的DNA G-四链体结构进行检测。
1)活细胞培养
HUVEC在包含10％胎牛血清(FBS)和1％100U/mL双抗的DMEM培养基、在5％CO2、37℃条件下培养48h。
2)配制探针溶液
将合成的IMT分子溶在甲醇中配成1M母液，然后用水稀释成500μM的探针溶液。
3)对活细胞进行染色
细胞在共聚焦培养皿中生长12h，加入10μM的IMT分子与细胞共同培养48h。除去细胞培养液，用PBS(pH 7.4)缓冲液溶液洗涤细胞三次，然后用59细胞核染料对细胞核进行共染。
图3IMT探针标记活细胞HUVEC细胞的染色结果。可以看出，图(a)IMT标记的细胞核中出现均匀的荧光亮点，而对照的图(b)中没有加IMT，作用细胞核中没有荧光亮点，说明IMT在细胞核中特异性地与DNA G-四链体作用。
4)激光共聚焦显微镜观察
在型号为OLYMPUS FV1000-IX81的激光共聚焦仪器观察细胞染色情况，在100×油镜下使用。第一个通道：IMT探针分子通道，激发波长405nm，收集波长范围425-525nm；第二个通道：59细胞核染料通道，激发波长635nm，收集波长范围650-750nm。
第一个通道观察到是IMT探针分子的染色结果，第二个通道观察到的是活细胞细胞核染料59的染色结果。第一个通道观察到了均匀的荧光亮点，代表的是探针分子IMT与细胞核内DNA G-四链体作用的结果；第二个通道内位置标记处的是细胞核的位置。
实施例4
在该实施例中，按照实施例2的方法对活细胞系Hela的DNA G-四链体结构进行检测，区别在于，将IMT替换为下式所示化合物，下式所示化合物的合成方式参照实施例1。
图4显示了上式所示化合物标记活细胞Hela细胞的细胞核染色结果。可以看出，细胞核中出现均匀的荧光亮点，进而能够通过该光信号确定细胞的DNA G-四链体含量。
实施例5
在该实施例中，按照实施例2的方法对活细胞系Hela的DNA G-四链体结构进行检测，区别在于，将IMT替换为下式所示化合物，下式所示化合物的合成方式参照实施例1。
图5显示了上式所示化合物标记活细胞Hela细胞的细胞核染色结果。可以看出，细胞核中出现均匀的荧光亮点，进而能够通过该光信号确定细胞的DNAG-四链体含量。
实施例6
在该实施例中，按照实施例2的方法对活细胞系Hela的DNA G-四链体结构进行检测，区别在于，将IMT替换为下式所示化合物，下式所示化合物的合成方式参照实施例1。
图6显示了上式所示化合物标记活细胞Hela细胞的细胞核染色结果。可以看出，细胞核中出现均匀的荧光亮点，进而能够通过该光信号确定细胞的DNA G-四链体含量。
实施例7
在该实施例中，按照实施例2的方法对活细胞系Hela的DNA G-四链体结构进行检测，区别在于，将IMT替换为下式所示化合物，下式所示化合物的合成方式参照实施例1。
图7显示了上式所示化合物标记活细胞Hela细胞的细胞核染色结果。可以看出，细胞核中出现均匀的荧光亮点，进而能够通过该光信号确定细胞的DNA G-四链体含量。
实施例8
在该实施例中，按照实施例2的方法对活细胞系Hela的DNA G-四链体结构进行检测，区别在于，将IMT替换为下式所示化合物，下式所示化合物的合成方式参照实施例1。
图8显示了上式所示化合物标记活细胞Hela细胞的细胞核染色结果。可以看出，细胞核中出现均匀的荧光亮点，进而能够通过该光信号确定细胞的DNA G-四链体含量。
对比例1
在该对比例中，按照实施例2的方法对活细胞系Hela的DNA G-四链体结构进行检测，区别在于，将IMT替换为下式所示化合物，下式所示化合物的合成方式参照实施例1。
图9显示了上式所示化合物标记活细胞Hela细胞的细胞核染色结果。可以看出，荧光标记主要集中在核仁上，即该化合物主要分散于核仁上，检测的结果主要是核仁上的DNAG-四链体含量。但是，DNA G-四链体是均匀分布于细胞核内，故利用该化合物无法准确地确定细胞内的全部DNA G-四链体含量，检测结果偏低。本发明的化合物能够均匀分散于细胞核内，结合各处的DNA G-四链体，从而能够准确地确定细胞内的DNA G-四链体含量。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种化合物，其特征在于，具有下列之一的结构：
2.一种检测DNA G-四链体的方法，其特征在于，包括：
使细胞与权利要求1所述化合物进行接触；以及
对所述接触后的细胞进行观察，以便确定所述细胞中DNA G-四链体含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，进一步包括：
将所述接触后细胞的细胞核进行染色定位处理；以及
基于所述细胞核内的荧光强度和荧光亮点的数目，以便确定所述细胞中DNA G-四链体含量。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述细胞为活细胞。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述接触是将所述细胞与所述化合物共孵育1～48小时。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述染色处理是利用59染色剂进行的。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述荧光强度的测定是利用激光共聚焦仪器进行的，
其中，所述激光共聚焦仪器中包括：所述化合物的检测通道以及所述染色剂的检测通道，
所述化合物检测通道的激发波长为405nm，收集波长范围为425～525nm；
所述染色剂检测通道的激发波长为635nm，收集波长范围为650～750nm。
8.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的化合物。
9.权利要求1所述化合物或权利要求8所述试剂盒在检测DNA G-四链体中的用途。
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