CN111961042B - 用于检测脊sca36基因ggcctg重复序列异常扩增的化合物及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了化合物及其在检测脊髓小脑共济失调疾病中SCA36基因GGCCTG重复序列异常扩增的方法。所述化合物具有式(Ⅰ)所示结构，该化合物对细胞内SCA36基因GGCCTG重复序列异常扩增具有较高的检测特异性及灵敏度，操作简便且稳定性好。

Description

用于检测脊SCA36基因GGCCTG重复序列异常扩增的化合物及 检测方法

技术领域

本发明涉及化学领域，具体地，涉及化合物及其应用，更具体地，涉及检测用于检测脊SCA36基因GGCCTG重复序列异常扩增的化合物及检测方法。

背景技术

脊髓小脑共济失调(Spinocerebelar Ataxia,简写SCA)，又称脊髓小脑萎缩症或脊髓小脑失调症，是一类具有高度临床表型和基因型异质性神经系统退行性疾病。患病率约为8-12/10万，常见于30-40岁间发病，具有遗传早现性的特点，发病后其生存期仅10-20年。

SCA患者通常表现为缓慢进行性小脑综合征，并伴有动眼障碍，构音障碍，子宫发育不良、运动性震颤和，或共济失调步态的各种组合。他们还可能出现色素性视网膜病变，锥体束外运动障碍(帕金森氏症，运动障碍，肌张力障碍，舞蹈病)，锥体束征，皮质症状(癫痫发作，认知障碍/行为症状)，周围神经病变。SCA具有高病死率和高病残率。目前为止，全世界一共发现39种SCA亚型，除SCA24呈常染色体隐性遗传之外，所有的SCA亚型均呈常染色体显性遗传，因而这一类疾病又被称为常染色体显性小脑性共济失调(autosomaldominant cerebellar ataxia，ADCA)。由于SCA遗传亚型之间表型的显着重叠，使得SCA亚型的临床诊断变得复杂。

SCA36基因GGCCTG重复序列异常扩增是这些亚型的其中之一，正常人SCA36基因GGCCTG序列仅有3-14个重复单元，而SCA36基因异常者GGCCTG序列重复扩增可达到几百甚至几千个重复单元。目前对于SCA36基因异常扩增，主要依靠基因测序技术检测，成本很高且缺乏普适性。目前临床多通过发病特征进行推测，极易误诊。因此当前急需简便、有效的产品或方法来进行SCA36基因异常的检验。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了一种有机小分子化合物及利用该化合物对脊髓小脑共济失调疾病中SCA36基因异常扩增进行检测的方法。根据本发明实施例的化合物对SCA36基因异常扩增具有较高的选择性，适用于细胞(尤其是活细胞)内SCA36基因异常扩增的检测，检测的准确性强、灵敏度高、稳定性好且操作简便。

在本发明的一个方面，本发明提供了一种化合物。根据本发明的实施例，该化合物为式(Ⅰ)所示化合物或其立体异构体：

其中，R₁₀和R₁₁独立地为氢、C_1-6的烷基、苯基或烷基取代的苯基；R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉独立地为氢原子、C_1-6的烷基、C_1-6的卤代烷基、C_1-6的烷氧基或卤原子；X₁和X₂独立地为C、O、S、N、Se或Te原子。其中，所述烷基、苯基、烷氧基可任选地被一个或者多个选自烷基、磺酸基或者烷氧基的基团所取代。

发明人发现，该化合物能够作为SCA36基因异常扩增的识别探针，该探针对SCA36基因异常扩增具有较高的选择性，适用于细胞(尤其是活细胞)内SCA36基因异常扩增的检测，检测的准确性强、灵敏度高、稳定性好且操作简便。

根据本发明实施例的化合物在SCA36基因未异常表达的细胞内荧光很弱，在SCA36基因异常扩增表达的细胞内荧光显著增强，根据化合物所表现出的荧光信号变化可以判断细胞内SCA36基因的异常表达。并且，该化合物膜通透性好，不需要对细胞进行固定、通透等处理，在保持细胞活性的条件下对细胞内SCA36基因进行标记检测；同时具有良好的抗光漂白性能，可以实现对细胞样品较长时间有效观测，且不受细胞内pH值的影响。此外，使用该化合物检测时，操作简便、快捷，有望成为检测SCA36基因异常扩增的通用化合物。

根据本发明的实施例，所述烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基。

根据本发明的实施例，所述烷基取代的苯基为甲基苯基或二甲基苯基。

根据本发明的实施例，所述卤代烷基为一氟甲烷、二氟甲烷、三氟甲烷、一溴甲烷、二溴甲烷或三溴甲烷；

根据本发明的实施例，所述烷氧基为甲氧基、乙氧基或丙氧基。

根据本发明的实施例，所述卤原子为氟、氯、溴或碘。

根据本发明的实施例，该化合物具有下列之一的结构。发明人发现，相比于其他化合物，下述化合物能够较好地识别和区分SCA36基因异常表达细胞与正常细胞，并实现了利用该化合物在活细胞水平进行可视化检测，检测的准确性强、稳定性好且操作简便。

在本发明的第二方面，本发明提出了所述化合物在检测SCA36基因GGCCTG重复序列异常扩增的用途。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种检测细胞内SCA36基因GGCCTG重复序列异常扩增的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：S100接触以及S200确定SCA36基因是否异常表达。由此，根据本发明实施例的检测SCA36基因异常表达的方法可直接用于判断待测细胞中SCA36基因GGCCTG重复序列是否存在异常扩增，以用于科研，判断结果准确性高，方法稳定性好且操作简便。另外，该检测结果也为脊髓小脑共济失调的临床检测提供了依据。

根据本发明的实施例，该方法包括：

S100接触

在该步骤中，使细胞与前面所描述的化合物进行接触。需要说明的是，对于接触方式不作严格限定，可以根据实际需要进行选择。根据本发明的具体实施例，接触是将细胞与化合物进行共孵育1～48小时。具体地，将化合物加入至含有待测细胞的培养皿中进行共孵育。发明人发现，在此条件下能够使得化合物与细胞内的SCA36基因表达产物充分结合，便于后续检测。

S200确定SCA36基因是否异常表达

在该步骤中，对所述接触后的细胞进行观察，以便确定所述细胞中SCA36基因是否异常表达。

发明人发现，将细胞与化合物接触后，化合物可以进入细胞，与细胞内的SCA36基因异常扩增所形成核酸四螺旋结构簇结合，使得该化合物产生可检测信号。通过仪器检测该信号，从而能够确定细胞中SCA36基因是否异常表达。

根据本发明的实施例，该方法进一步包括：将所述接触后的细胞进行染色处理；以及基于所述细胞内的荧光强度，以便确定所述细胞中SCA36基因是否异常表达。SCA36基因表达产物存在于细胞质中，通过对细胞进行染色，以便检测到结合SCA36基因表达产物的化合物产生的信号，从而能够快速且准确地确定SCA36基因是否异常表达。

根据本发明的实施例，荧光强度的测定是利用激光共聚焦仪器进行的，其中，激光共聚焦仪器中包括：化合物的检测通道以及白光检测通道，化合物检测通道的激发波长为488nm，收集波长范围为490～550nm。激光共聚焦显微镜可以用来观察不同的化合物分子在细胞内的染色情况，由于化合物在490～550nm波长处能够产生光信号，所以通过化合物检测通道产生的光信号强弱，确定SCA36基因是否异常表达。由此，根据本发明实施例的检测SCA36基因是否异常表达的方法具有较强的准确性、较高的灵敏度、较好的稳定性或者较简便的操作。

发明人发现，该化合物对SCA36基因GGCCTG重复序列异常扩增具有较高的选择性，适用于细胞(尤其是活细胞)内SCA36异常基因的检测，检测的准确性高、稳定性好且操作简便。

附图说明

图1是根据本发明实施例的化合物(1)的¹H-NMR谱；

图2是根据本发明实施例的化合物(2)的质谱；

图3是根据本发明实施例的化合物(1)标记的染色结果；

图4是根据本发明实施例的化合物(2)标记的染色结果；以及

图5是根据本发明实施例的化合物(3)标记的染色结果。

具体实施方式

在此需要说明的是，对于式(I)的化合物，其制备方法可以参考Hamer,F.M.TheChemistry of Heterocyclic Compounds.The Cyanine Dyes and RelatedCompounds.Interscience Publishers,New York-London,1964和Ficken,G.E.TheChemistry of Synthetic Dyes.Cyanine Dyes.Academic Press,1971中记载的合成路线，也可以使用本领域熟知的其他方法来制备。

根据本发明的实施例，式(I)的化合物具有如下所示的结构：

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1、化合物(1)～(6)的合成方法如下所示，其中，反应比例以及纯化方法采用本领域常规比例或常规纯化方法即可。另外，发明人通过对各化合物的氢谱、碳谱和/或质谱数据进行分析，确认上述化合物的结构无误，其中，化合物(1)的¹H-NMR谱和化合物(2)的质谱分别参考图1和图2所示。

实施例2

在该实施例中，利用化合物(1)按照下列方法对含有SCA36基因异常扩增表达和正常细胞进行检测。

1)配制化合物溶液

将合成的化合物(1)溶在DMSO中，稀释成250μM的化合物溶液。

2)对活细胞进行染色

细胞在共聚焦培养皿中生长24-48h，加入2μM的化合物(1)溶液与细胞共同培养2h。除去细胞培养液，用PBS(pH 7.4)缓冲液溶液洗涤细胞三次待测。

3)激光共聚焦显微镜观察

在型号为OLYMPUS FV1000-IX81的激光共聚焦仪器观察细胞染色情况，在100×油镜下使用。第一个通道：化合物(1)检测通道，激发波长488nm，收集波长范围490～550nm；第二个通道：白光通道，观察到的是活细胞状态。

图3显示了化合物(1)标记的染色结果，其中图(a)是正常细胞荧光成像图，图(b)是SCA36基因异常表达细胞荧光成像图，图(b)荧光显著高于图(a)，说明化合物(1)能够识别SCA36基因异常表达。

实施例3

在该实施例中，利用化合物(2)按照下列方法对含有SCA36基因异常扩增表达细胞和正常细胞进行检测。

1)配制化合物溶液

将合成的化合物(2)溶在DMSO中稀释成250μM的化合物溶液。

2)对活细胞进行染色

细胞在共聚焦培养皿中生长24-48h，加入2μM的化合物(2)溶液与细胞共同培养2h。除去细胞培养液，用PBS(pH 7.4)缓冲液溶液洗涤细胞三次待测。

3)激光共聚焦显微镜观察

在型号为OLYMPUS FV1000-IX81的激光共聚焦仪器观察细胞染色情况，在100×油镜下使用。第一个通道：化合物(2)检测通道，激发波长488nm，收集波长范围490～550nm；第二个通道：白光通道，观察到的是活细胞状态。

图4显示了化合物(2)标记的染色结果，其中图(a)是正常细胞荧光成像图，图(b)是SCA36基因异常表达细胞荧光成像图，图(b)荧光显著高于图(a)，说明化合物(2)能够识别SCA36基因异常表达。

实施例4

在该实施例中，利用化合物(3)按照下列方法对含有SCA36基因异常扩增表达细胞和正常细胞进行检测。

1)配制化合物溶液

将合成的化合物(3)溶在DMSO中稀释成250μM的化合物溶液。

2)对活细胞进行染色

细胞在共聚焦培养皿中生长24-48h，加入2μM的化合物(3)溶液与细胞共同培养2h。除去细胞培养液，用PBS(pH 7.4)缓冲液溶液洗涤细胞三次待测。

3)激光共聚焦显微镜观察

在型号为OLYMPUS FV1000-IX81的激光共聚焦仪器观察细胞染色情况，在100×油镜下使用。第一个通道：化合物(3)检测通道，激发波长488nm，收集波长范围490～550nm；第二个通道：白光通道，观察到的是活细胞状态。

图5显示了化合物(3)标记的染色结果，其中图(a)是正常细胞荧光成像图，图(b)是SCA36基因异常表达细胞荧光成像图，图(b)荧光显著高于图(a)，说明化合物(3)能够识别SCA36基因异常表达。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (3)

1.一种化合物， 其特征在于，具有下列之一的结构：

2.具有下列之一结构的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于检测SCA36基因GGCCTG重复序列异常扩增，

3.具有下列之一结构的化合物在制备探针中的用途，所述探针用于检测细胞内SCA36基因GGCCTG重复序列异常扩增，其特征在于，包括：

将所述探针与待测细胞接触；以及

对所述接触后的细胞进行荧光信号检测；

其中，相比于接触前，接触后的细胞出现增强的荧光信号，是所述待测细胞内SCA36基因GGCCTG重复序列异常扩增的指示，

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