CN115851915A - 检测遗传性共济失调致病基因的引物组及方法 - Google Patents
检测遗传性共济失调致病基因的引物组及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115851915A CN115851915A CN202211600245.9A CN202211600245A CN115851915A CN 115851915 A CN115851915 A CN 115851915A CN 202211600245 A CN202211600245 A CN 202211600245A CN 115851915 A CN115851915 A CN 115851915A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- seq
- sequence shown
- detecting
- primer pair
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 208000009415 Spinocerebellar Ataxias Diseases 0.000 title claims abstract description 58
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 208000010112 Spinocerebellar Degenerations Diseases 0.000 title claims abstract description 31
- 201000003636 hereditary ataxia Diseases 0.000 title claims abstract description 31
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title abstract description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 56
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 60
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 27
- 208000002569 Machado-Joseph Disease Diseases 0.000 claims description 25
- 208000036834 Spinocerebellar ataxia type 3 Diseases 0.000 claims description 25
- 201000008163 Dentatorubral pallidoluysian atrophy Diseases 0.000 claims description 23
- 208000024412 Friedreich ataxia Diseases 0.000 claims description 23
- 102000007372 Ataxin-1 Human genes 0.000 claims description 20
- 108010032963 Ataxin-1 Proteins 0.000 claims description 20
- 201000003622 Spinocerebellar ataxia type 2 Diseases 0.000 claims description 20
- 201000003624 spinocerebellar ataxia type 1 Diseases 0.000 claims description 20
- 201000003594 spinocerebellar ataxia type 12 Diseases 0.000 claims description 20
- 201000003629 Spinocerebellar ataxia type 8 Diseases 0.000 claims description 19
- 201000003570 spinocerebellar ataxia type 17 Diseases 0.000 claims description 19
- 201000003498 spinocerebellar ataxia type 36 Diseases 0.000 claims description 19
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 8
- 201000003620 Spinocerebellar ataxia type 6 Diseases 0.000 claims description 8
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 201000003598 spinocerebellar ataxia type 10 Diseases 0.000 claims 6
- 201000003632 spinocerebellar ataxia type 7 Diseases 0.000 claims 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 22
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 102000007371 Ataxin-3 Human genes 0.000 description 18
- 108010032947 Ataxin-3 Proteins 0.000 description 18
- 102000007370 Ataxin2 Human genes 0.000 description 14
- 108010032951 Ataxin2 Proteins 0.000 description 14
- 101000701517 Homo sapiens Putative protein ATXN8OS Proteins 0.000 description 14
- 102000007368 Ataxin-7 Human genes 0.000 description 13
- 108010032953 Ataxin-7 Proteins 0.000 description 13
- 101000603068 Homo sapiens Nucleolar protein 56 Proteins 0.000 description 13
- 102100037052 Nucleolar protein 56 Human genes 0.000 description 13
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 13
- 102100030469 Putative protein ATXN8OS Human genes 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 102000002785 Ataxin-10 Human genes 0.000 description 12
- 108010043914 Ataxin-10 Proteins 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 101150025446 Atn1 gene Proteins 0.000 description 9
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 8
- 206010008025 Cerebellar ataxia Diseases 0.000 description 8
- 101000891654 Homo sapiens TATA-box-binding protein Proteins 0.000 description 8
- 101000935117 Homo sapiens Voltage-dependent P/Q-type calcium channel subunit alpha-1A Proteins 0.000 description 8
- 102100040296 TATA-box-binding protein Human genes 0.000 description 8
- 102100025330 Voltage-dependent P/Q-type calcium channel subunit alpha-1A Human genes 0.000 description 8
- 102000014461 Ataxins Human genes 0.000 description 7
- 108010078286 Ataxins Proteins 0.000 description 7
- 101000915806 Homo sapiens Serine/threonine-protein phosphatase 2A 55 kDa regulatory subunit B beta isoform Proteins 0.000 description 7
- 102100029014 Serine/threonine-protein phosphatase 2A 55 kDa regulatory subunit B beta isoform Human genes 0.000 description 7
- 201000004562 autosomal dominant cerebellar ataxia Diseases 0.000 description 7
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 7
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 3
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 101150074725 Atxn3 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 2
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 101150070808 Atxn10 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000012639 Balance disease Diseases 0.000 description 1
- 206010013887 Dysarthria Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 101150103820 Fxn gene Proteins 0.000 description 1
- 206010017577 Gait disturbance Diseases 0.000 description 1
- 101000666174 Homo sapiens Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 6 Proteins 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 208000016285 Movement disease Diseases 0.000 description 1
- 101150074304 NOP56 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038112 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 6 Human genes 0.000 description 1
- 201000003501 Spinocerebellar ataxia type 35 Diseases 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000002902 bimodal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 210000003591 cerebellar nuclei Anatomy 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000004260 spinocerebellar tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测遗传性共济失调致病基因的引物组及方法，所述引物组包括STD‑PCR引物组和RP‑PCR引物组，本发明只需要两种反应体系，两个反应程序，即可实现12种亚型致病基因的一次性检测，提高了检测效率，降低了不同检测程序的时间成本及仪器使用成本，在临床上具有极其重要的作用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种同时检测遗传性共济失调致病基因的引物组及方法。
背景技术
遗传性共济失调(hereditary ataxia,HA)是一大类具有高度临床和遗传异质性、病死率和病残率较高的遗传性神经系统退行性疾病，约占神经系统遗传性疾病的10％～15％。临床上以小脑共济失调为主要特征，表现为平衡障碍、进行性肢体协调运动障碍、步态不稳、构音障碍、眼球运动障碍等，并可伴有复杂的神经系统损害。
脊髓小脑共济失调(spinal cerebellar ataxias,SCA)是一组常染色体显性遗传性疾病，具有多种亚型。SCA能引起小脑、脊髓小脑束和脑干神经元变性。Friedreich's共济失调(FRDA)是一种罕见的常染色体隐性遗传病，以进行性肌肉自主运动丧失(即共济失调)和心脏扩大为特征，通常在儿童期可以诊断，男女都可以患病。SCA3是汉族人群最常见的SCA亚型，其次依次为SCA1、SCA2和SCA6。中国汉族人常染色体显性遗传性脊髓小脑共济失调3型(SCA3)约占常染色体显性遗传性共济失调半数以上，而SCA1、SCA2、SCA6和SCA7型少见，其他类型如SCA8、SCA12、SCA17和SCA35型，以及齿状核红核苍白球路易体萎缩(DRPLA)等亚型则极为罕见。
SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA8、SCA10、SCA12、SCA17、SCA36、DRPLA、FRDA均由相应致病基因的多核苷酸重复扩增引起。其中，SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA12、SCA17、DRPLA基因被发现是由CAG重复数目增加引起，SCA8则由SCA8基因3’非翻译区CTG重复数目异常增加引起，SCA10由ATXN10基因内含子9的ATTCT重复数目增加引起，SCA36由NOP56基因的第一内含子的GGCCTG重复引起。FRDA是FXN基因突变导致的常染色体隐性遗传病，其第1内含子的GAA重复序列长度决定基因是否正常、前突变或为突变基因。
片段分析(Fragment analysis，FA)是一种分子生物学技术，这里的片段特指以DNA或者cDNA为模板，由PCR过程所产生的，数目不等的核苷酸构成的大小不等的DNA片段，然后进行毛细管电泳，利用荧光检测器对不同片段大小的产物进行识别和区分，通过荧光标记片段与分子量内标的比较获得片段的相对大小。目前常规的共济失调动态突变检测，是针对共济失调的单个致病基因分别设计引物进行PCR扩增，对PCR目标扩增进行片段分析，检测出重复数量。不同的基因因其体系和PCR程序有较大差异，检测效率低，不适合此类疾病多基因筛查。
因此，有必要提供一种能同时检测共济失调多种致病基因的方法。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种检测遗传性共济失调致病基因的引物组、试剂盒及方法。
实现上述发明目的的技术方案包括如下。
本发明的第一方面，提供了一种检测遗传性共济失调致病基因的引物组，包括：STD-PCR引物组和RP-PCR引物组；
其中，所述STD-PCR引物组包括：
检测SCA1亚型的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物；
检测SCA2亚型的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物；
检测SCA3亚型的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID NO.5所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物；
检测SCA6亚型的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID NO.7所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物；
检测SCA7亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.9所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.10所示的反向引物；
检测SCA8亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.11所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.12所示的反向引物；
检测SCA10亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.13所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.14所示的反向引物；
检测SCA12亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.15所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.16所示的反向引物；
检测DRPLA亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.17所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.18所示的反向引物；
检测FRDA亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.19所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.20所示的反向引物；
检测SCA17亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.21所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.22所示的反向引物；
检测SCA36亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.23所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.24所示的反向引物；
所述RP-PCR引物组包括：
检测SCA1亚型的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID NO.27所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.28所示的反向引物；
检测SCA2亚型的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID NO.29所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.30所示的反向引物；
检测SCA3亚型的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID NO.31所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.32所示的反向引物；
检测SCA6亚型的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID NO.33所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.34所示的反向引物；
检测SCA7亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.35所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.36所示的反向引物；
检测SCA8亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.37所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.38所示的反向引物；
检测SCA10亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.39所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.40所示的反向引物；
检测SCA12亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.41所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.42所示的反向引物；
检测SCA17亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.43所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.44所示的反向引物；
检测DRPLA亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.45所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.46所示的反向引物；
检测SCA36亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.47所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.48所示的反向引物；
检测FRDA亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.49所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.50所示的反向引物。
本发明的第二方面，提供了一种检测遗传性共济失调致病基因的试剂盒，包括上述检测遗传性共济失调致病基因的引物组。
本发明的第三方面，提供了一种检测遗传性共济失调致病基因的方法，包括以下步骤：以待测样本的DNA为模板，先进行STD-PCR检测，针对单等位基因及阳性样本再进行RP-PCR检测。
在本发明中，根据遗传性共济失调12种亚型的致病基因，分别设计了STD-PCR和RP-PCR的特异性扩增引物组，并通过大量实验后，设计了针对不同亚型致病基因STD-PCR检测和RP-PCR检测的反应体系和反应程序，只需要两种反应体系，两个反应程序，即可实现12种亚型致病基因的一次性检测，提高了检测效率，降低了不同检测程序的时间成本及仪器使用成本，在临床上具有极其重要的作用。
附图说明
图1为本发明实施例3中对SCA1、SCA2、SCA3和SCA6的STD-PCR检测结果。
图2为本发明实施例3中对SCA7、SCA8、SCA10和SCA12的STD-PCR检测结果。
图3为本发明实施例3中对SCA17、SCA36、DRPLA和FRDA的STD-PCR检测结果。
图4为本发明实施例3中对SCA1、SCA2、SCA3和SCA6的RP-PCR检测结果。
图5为本发明实施例3中对SCA7、SCA8、SCA10和SCA12的RP-PCR检测结果。
图6为本发明实施例3中对SCA17、SCA36、DRPLA和FRDA的RP-PCR检测结果。
图7为本发明实施例4中ATN1基因STD-PCR特异性引物BLAST结果图。
图8为本发明实施例4中ATN1基因的STD-PCR毛细管电泳结果图。
图9为本发明实施例4中ATN1基因RP-PCR特异性引物BLAST结果图。
图10为本发明实施例4中ATN1基因的RP-PCR毛细管电泳结果图。
图11为本发明试验例1中采用不同的引物进行STD-PCR扩增的结果变化图。
图12为本发明试验例2中采用不同的RP-PCR反应体系对SCA12亚型进行RP-PCR扩增的结果。
图13为本发明试验例2中采用不同的RP-PCR反应体系对SCA3亚型进行RP-PCR扩增的结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
在本发明中的其中一些实施例中，公开了一种遗传性共济失调12种亚型的致病基因的STD-PCR和RP-PCR的特异性扩增引物组(分别为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.24和SEQIDNO.27～SEQ ID NO.50)，所述特异性扩增引物组可以特异性扩增对应致病基因的重复片段，包含(CAG)n、(CTA)n(CTG)n、(CAG/CAA)n、(GAA)n、(ATTCT)n、(GGCCTG)n。其中，在针对12种亚型的致病基因RP-PCR的引物设计中，引入了一组通用引物CE-UniF(SEQ ID NO.25)和CE-UniR(SEQ ID NO.26)，即所有RP-PCR引物对的正向引物均加上通用引物CE-UniF，所有RP-PCR引物对的反向引物均加上通用引物CE-UniR。因此，只需将通用引物的5’端加上荧光修饰，即可通用于12种亚型的RP-PCR扩增，不需要对每一种亚型的引物对都进行荧光修饰，可大大节约引物成本，且通用引物能起到放大扩增效率的作用。
在其中一些实施例中，所述引物对的正向引物上均标记有荧光素。
在其中一些实施例中，所述荧光素为FAM。
在其中一些实施例中，所述引物组还包括针对FRDA亚型检测的内参基因引物组，所述内参基因引物组包括：序列如SEQ ID NO.51所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.52所示的反向引物。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种检测遗传性共济失调致病基因的试剂盒，所述试剂盒包括上述一种检测遗传性共济失调致病基因的引物组。
在其中一些实施例中，所述引物组的各条引物的工作浓度均为1pmol/ul～10pmol/ul。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种检测遗传性共济失调致病基因的方法，包括以下步骤：以待测样本的DNA为模板，先进行STD-PCR检测，针对单等位基因及阳性样本再进行RP-PCR检测。即：首先采用STD-PCR方法进行验证，即通过在重复区域的两侧设计引物进行扩增，检测目的片段的长度。理论上，扩增片段的长度减去非重复区的长度即为重复片段长度，除以重复碱基数即重复数。经STD-PCR只检测到一条峰时，再采用RP-PCR方法进一步确认是否存在超长重复片段的存在，从而确保结果的准确性。RP-PCR的原理为：将反向引物设计在致病基因的重复序列部分，然后进行杂交，各种大小不一的序列在重复引物PCR反应中会被扩增出来，如果重复数量增加了，一个明显的PCR产物轮廓(梯形轮廓)会在峰图中出现。
在其中一些实施例中，所述STD-PCR检测的反应体系包括：针对SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA8、SCA10、SCA12、SCA17、DRPLA、FRDA亚型的反应体系包括Master Mix 12.5n、ddH2O 5.5n、正向引物2.5n、反向引物2.5n、DNA模板2n；以及针对SCA7、SCA36的反应体系包括Phanta Max Master Mix12.5n、ddH2O 5.5n、正向引物2.5n、反向引物2.5n、DNA模板2n。
在其中一些实施例中，所述RP-PCR检测的反应体系包括：针对SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA8、SCA10、SCA17、SCA36、FRDA、DRPLA亚型的反应体系包括Master Mix12.5n、GC enhancer 2.5n、ddH2O 3n、正向引物1.25n、反向引物1.25n、通用引物F1.25n、通用引物R1.25n、DNA模板2n；以及针对SCA12亚型的反应体系包括Master Mix 12.5n、GCenhancer 2.5n、ddH2O 3n、甘油1.5n、正向引物2.5n、反向引物2.5、DNA模板2n。
在其中一些实施例中，所述STD-PCR检测的反应程序包括：针对SCA1、SCA6亚型的反应程序包括98℃3min；98℃10s,72℃1min，30cyc；72℃5min；25℃infinite；，以及针对SCA2、SCA3、SCA7、SCA8、SCA10、SCA12、SCA17、SCA36、DRPLA、FRDA亚型的反应程序包括98℃3min；98℃10s,65℃30s,72℃1min，30cyc；72℃5min；25℃infinite。
在其中一些实施例中，所述RP-PCR检测的反应程序包括：针对SCA3、SCA8、SCA12亚型的反应程序包括：95℃10min；95℃30s,60℃30s,72℃1min，35cyc；72℃7min；25℃infinite；以及针对SCA1、SCA2、SCA6、SCA7、SCA10、SCA17、SCA36、FRDA、DRPLA亚型的反应程序包括：98℃3min；98℃10s,58℃30s,72℃1min，10cyc；98℃10s,72℃1min，10cyc；98℃30s,46℃30s,72℃1min，30cyc；72℃5min；25℃infinite。
针对12种亚型的致病基因的检测，只需要设计两种反应体系，两个反应程序，即可实现12种亚型致病基因的一次性检测，提高了检测效率，降低了不同检测程序的时间成本及仪器使用成本，在临床上具有极其重要的作用。
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1同时检测遗传性共济失调12种亚型致病基因的引物对
在本实施例中，针对遗传性共济失调疾病12种亚型的致病基因，分别设计了STD-PCR引物对、RP-PCR引物对以及内参基因引物对(AF4-X3，仅用于FRDA亚型检测，用于排除由于基因太长导致检测失败)。其中，RP-PCR引物对均加上通用引物接头(即CE-UniF和CE-UniR)，只需将通用引物的5’端加上FAM修饰，即可通用于12种亚型的RP-PCR扩增，不需要对每一种亚型的引物对都进行荧光修饰，可大大节约引物成本，且通用引物能起到放大扩增效率的作用。
具体的引物序列信息如表1所示。
表1同时检测遗传学共济失调12种亚型致病基因的引物对
实施例2同时检测遗传性共济失调12种亚型致病基因的方法
采用实施例1的引物组，利用STD-PCR反应体系和STD-PCR反应程序进行STD-PCR扩增，当STD-PCR出现单峰时，利用RP-PCR反应体系和RP-PCR反应程序进行RP-PCR扩增，再对结果进行分析，实现同时检测遗传性共济失调12种亚型致病基因。在本实施例中，STD-PCR扩增采用NEB公司产品Q5TM热启动超保真2X Master Mix，货号M0494L；TP-PCR扩增采用ABI公司产品AmpliTaq Gold 360Master Mix，货号4398881；分子量标准采用ABI公司产品GeneScanTM 500LIZTM Size Standard，货号4322682。
1、反应体系
(1)、STD-PCR反应体系
适用于SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA8、SCA10、SCA12、SCA17、DRPLA、FRDA的STD-PCR反应体系如表2所示，适用于SCA7、SCA36的STD-PCR反应体系如表3所示。
表2
表3
(2)、RP-PCR反应体系
适用于SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA8、SCA10、SCA17、SCA36、FRDA、DRPLA的RP-PCR反应体系如表4所示，适用于SCA12的RP-PCR反应体系如表5所示。
表4
表5
2、反应程序
STD-PCR和RP-PCR反应程序如表5所示。
表5
3、结果分析
(1)、STD-PCR结果分析
根据软件分析得出标本的片段大小后，与已知重复数标本比较，获得相差的bp数，如样本A的等位基因大小为222bp，已知样本等位基因大小分别为201bp及363bp，可将222bp减去201bp得出21bp，计算得出CAG重复数为7次，已知标本的201bp及363bp重复数分别为14次及72次，代入201bp片段的重复数得到样本A的重复次数为14+7＝21次重复代入363bp片段的重复数得到样本A的重复次数为72+7＝79次重复。对于如何选择哪个等位基因作为参考，可按就近原则。
(2)、RP-PCR结果分析
RP-PCR得出的结果不必要计算重复数，如STD-PCR只检测到单个等位基因，RP-PCR会有两种检测结果，一是提示该样本只有一个等位基因，即纯合子，结果按照STD-PCR结果报告；二是有阳性峰出现，按照RP-PCR结果报告。
实施例3利用实施例2的检测方法进行临床检测
采用实施例2的方法，对1例临床怀疑为共济失调患者的12种亚型致病基因进行检测。结果如图1～3和图4～6所示。
从图1中的C可知，在STD-PCR检测时，发现SCA3 ATXN3基因出现了阳性峰，其他11个基因未出现阳性峰。经计算，SCA3 ATXN3基因CAG重复次数为72次，属于全突变范围，符合SCA3的基因突变特征。
RP-PCR结果(图4中的C)显示，检测到两个峰群的存在，并在第一峰群到第二阳性峰群间存在阶梯状连续峰。说明重复引物存在多个连续的结合位点，得到有效的扩增产物峰图，其结果符合STD阳性结果的判断。
实施例4本发明方法的方法学验证
本实施例中所使用的样本均来源于广州金域医学检验中心临床基因组中心实验室检测过且结果明确的样本。质粒订购于生工生物工程(上海)股份有限公司。以检测DRPLA亚型为例，来验证本发明方法的方法学。
采用实施例2的方法检测来源于EDTA抗凝外周血的DNA样本的DRPLA亚型，检测结果采用GENEMAPPERID V5.0进行分析，根据扩增片段大小，计算ATN1基因中的CAG重复数。CAG重复数据判断标准如表6。
表6
| 正常 | 全突变 | 备注 |
| 6～35 | ≥48 | 最终CAG重复数以原方法检测到的重复数为准 |
空白对照：为无模板对照，与样本平行实验，每批次1个；
阳性质控：采用确定为重复数≥48的样本，与样本DNA平行实验，每批次1个；
阴性质控：采用确定为重复数≤34的样本，与样本DNA平行实验，每批次1个。
(1)、引物特异性
ATN1基因STD-PCR特异性引物于UCSC中进行Blast，引物扩增片段位于长度为186bp(见图7)，无其它同源基因。PCR扩增产物，经毛细管电泳后，峰图如图8，峰图清楚，无非特殊性扩增峰。
ATN1基因TP-PCR特异性引物于UCSC中进行Blast，引物扩增最短片段长度为70bp(见图9)，无其它同源基因。PCR扩增产物，经毛细管电泳后，峰图如图10，峰图清楚，无非特殊性扩增峰。
(2)、CAG重复数计算方法
所有样本CAG结果均已知，因为存在电泳峰偏移的情况出现，在确认其它参数前，先行建立CAG计算公式，STD-PCR和RP-PCR的方法分别如表7和表8所示。
表7
计算公式：Repeats ofCAG＝(检测片段大小-135.46)/3
表8
计算公式：Repeats ofCAG＝(检测片段大小-84.07)/3
备注：应用STD-PCR技术检测基因，如检测到两个正常范围的Allele，则可根据STD-PCR计算公式得CAG重复数；如仅检测到一个Allele，则可通过TP-PCR技术进一步研究，由TP-PCR计算公式得CAG重复数。
(3)、检测特异性
检测特异性定义为阴性符合率(CAG重复数在正常范围内)。
共对22例样本(包含2个阳性质粒)进行检测，其中ATN1基因检测阴性样本为20例(如表9所示)，与广州中心实验室结果一致。本检测的检测特异性＝真阴性/(真阴性+假阳性)＝100％。
表9
备注：因计算公式会存在偏差，明显的正常和异常结果可采用，而处于GrayZone区域的样本，在日常检测过程中，以Sanger测序法辅助CAG重复数的判断。
(4)、检测灵敏度
检测灵敏度定义为阳性符合率(CAG重复数在正常范围内)。
共对22例样本(包含2个阳性质粒)进行检测，其中ATN1基因检测阳性质粒2个(如表10所示)，
与理论重复数及测序结果一致。本检测的检测灵敏度＝真阳性/(真阳性+假阴性)＝100％。
表10
| 实验编号 | 已知CAG结果 | 本次CAG计算 | 结果 | 是否通过 | 备注 |
| DRPLA-PC-60 | 60 | 60 | 全突变 | 是 | 无 |
| DRPLA-PC-75 | 74 | 74 | 全突变 | 是 | 无 |
(5)、检测准确度
检测准确度定义为不同实验室及不同方法检测结果的一致性。
共对22例样本(包含2个阳性质粒)进行STD-PCR及TP-PCR检测，20例阴性样本的检测结果均与广州中心实验室结果一致，2个阳性质粒检测结果与测序结果一致，且STD-PCR检测结果与TP-PCR检测结果一致，如表11所示。本检测的准确度为100％。
表11
试验例1STD-PCR的引物的优化
引物测试初期，引物不添加荧光修饰，均采用Qsep100全自动核酸蛋白分析系统检验设计引物是否有效扩增，是否存在非特异扩增。确认引物扩增只存在单峰或者双峰的情况下，对扩增产物进行sanger测序，比对扩增区域，最终确定引物可用后再添加荧光修饰。
以检测SCA36亚型的引物对为例，将反向引物ACGCAACCTCAGCGTCTGCC替换为ATCTAGAGCTTTCCAGGCCC(SEQ ID NO.24)，STD-PCR扩增结果变化如图11所示。从图11可知，扩增区域由chr20:2633352+2633458/107bp(hg19)更改为chr20:2633352+2633709/
358bp(hg19)，扩增峰图由多峰转变为单峰及双峰。
试验例2反应体系和反应程序的优化
由于12种遗传性共济失调疾病类型的相关致病基因序列本身具有不一样的特性，对反应体系及扩增程序的要求不同，经过多次验证优化后，筛选出12种亚型的最佳反应体系和扩增程序。
1、以SCA12亚型的RP-PCR反应体系为例进行说明，优化前后的反应体系如表12所示。
表12
采用表12的反应体系，按照实施例2的反应程序进行扩增后，结果如图12所示，从图12可知，采用优化后的反应体系(额外添加1.5μl甘油作为增强剂)扩增后的主峰更明显，非特异扩增峰减少(图12中的A为优化后的峰图，B为优化前的峰图)。
2、以SCA3亚型的RP-PCR反应程序及反应体系为例进行说明。优化了反应体系(3个反应体系，如表13所示)，同时将预变性温度由95℃提高至98℃，优化前后的结果如图13所示。
表13
从图13结果可知，体系1较体系2峰图更高，更清晰。体系1较体系3，目标峰更清晰，无明显拖尾，不会造成假阳性结果(图13中的上中下图依次为体系1、体系2、体系3)。因此，对SCA3亚型的RP-PCR检测来说，体系1是最适反应体系。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种检测遗传性共济失调致病基因的引物组，其特征在于，包括：STD-PCR引物组和RP-PCR引物组；
其中，所述STD-PCR引物组包括：
检测SCA1亚型的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物；
检测SCA2亚型的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物；
检测SCA3亚型的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID NO.5所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物；
检测SCA6亚型的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID NO.7所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物；
检测SCA7亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.9所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.10所示的反向引物；
检测SCA8亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.11所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.12所示的反向引物；
检测SCA10亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.13所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.14所示的反向引物；
检测SCA12亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.15所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.16所示的反向引物；
检测DRPLA亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.17所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.18所示的反向引物；
检测FRDA亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.19所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.20所示的反向引物；
检测SCA17亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.21所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.22所示的反向引物；
检测SCA36亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.23所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.24所示的反向引物；
所述RP-PCR引物组包括：
检测SCA1亚型的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID NO.27所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.28所示的反向引物；
检测SCA2亚型的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID NO.29所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.30所示的反向引物；
检测SCA3亚型的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID NO.31所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.32所示的反向引物；
检测SCA6亚型的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID NO.33所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.34所示的反向引物；
检测SCA7亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.35所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.36所示的反向引物；
检测SCA8亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.37所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.38所示的反向引物；
检测SCA10亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.39所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.40所示的反向引物；
检测SCA12亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.41所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.42所示的反向引物；
检测SCA17亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.43所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.44所示的反向引物；
检测DRPLA亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.45所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.46所示的反向引物；
检测SCA36亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.47所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.48所示的反向引物；
检测FRDA亚型的引物对，所述引物对包括：序列如SEQ ID NO.49所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.50所示的反向引物。
2.根据权利要求1所述的检测遗传性共济失调致病基因的引物组，其特征在于，所述引物组还包括内参基因引物组，所述内参基因引物组包括：序列如SEQ ID NO.51所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.52所示的反向引物。
3.根据权利要求1所述的检测遗传性共济失调致病基因的引物组，其特征在于，所述引物组的正向引物上均标记有荧光素；和/或所述荧光素为FAM。
4.权利要求1～3任一项所述的引物组在制备检测遗传性共济失调致病基因的试剂盒中的应用。
5.一种检测遗传性共济失调致病基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的检测遗传性共济失调致病基因的引物组。
6.根据权利要求5所述的检测遗传性共济失调致病基因的试剂盒，其特征在于，所述引物组的工作浓度均为1pmol～10pmol。
7.一种检测遗传性共济失调致病基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测样本的DNA为模板，先进行STD-PCR检测，针对单等位基因及阳性样本再进行RP-PCR检测。
8.根据权利要求7所述的检测遗传性共济失调致病基因的方法，其特征在于，所述STD-PCR检测的反应体系包括：针对SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA8、SCA10、SCA12、SCA17、DRPLA、FRDA亚型的反应体系包括MasterMix12.5n、ddH2O5.5n、正向引物2.5n、反向引物2.5n、DNA模板2n；针对SCA7、SCA36的反应体系包括PhantaMaxMasterMix12.5n、ddH2O5.5n、正向引物2.5n、反向引物2.5n、DNA模板2n；和/或所述RP-PCR检测的反应体系包括：针对SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA8、SCA10、SCA17、SCA36、FRDA、DRPLA亚型的RP-PCR反应体系包括MasterMix12.5n、GCenhancer2.5n、ddH2O3n、正向引物1.25n、反向引物1.25n、通用引物F1.25n、通用引物R1.25n、DNA模板2n；针对SCA12亚型的RP-PCR反应体系包括MasterMix12.5n、GCenhancer2.5n、ddH2O3n、甘油1.5n、正向引物2.5n、反向引物2.5、DNA模板2n。
9.根据权利要求8所述的检测遗传性共济失调致病基因的方法，其特征在于，所述通用引物F的序列如SEQ ID NO.25所示，所述通用引物R的序列如SEQ ID NO.26所示。
10.根据权利要求8所述的检测遗传性共济失调致病基因的方法，其特征在于，所述STD-PCR检测的反应程序包括：针对SCA1、SCA6亚型的反应程序包括98℃3min；98℃10s,72℃1min，30cyc；72℃5min；25℃infinite；针对SCA2、SCA3、SCA7、SCA8、SCA10、SCA12、SCA17、SCA36，DRPLA，FRDA亚型的反应程序包括98℃3min；98℃10s,65℃30s,72℃1min，30cyc；72℃5min；25℃infinite；和/或，所述RP-PCR检测的反应程序包括：针对SCA3、SCA8、SCA12亚型的RP-PCR反应程序包括95℃10min；95℃30s,60℃30s,72℃1min，35cyc；72℃7min；25℃infinite；针对SCA1、SCA2、SCA6、SCA7、SCA10、SCA17、SCA36，FRDA，DRPLA亚型的RP-PCR反应程序包括98℃3min；98℃10s,58℃30s,72℃1min，10cyc；98℃10s,72℃1min，10cyc；98℃30s,46℃30s,72℃1min，30cyc；72℃5min；25℃infinite。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211600245.9A CN115851915A (zh) | 2022-12-13 | 2022-12-13 | 检测遗传性共济失调致病基因的引物组及方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211600245.9A CN115851915A (zh) | 2022-12-13 | 2022-12-13 | 检测遗传性共济失调致病基因的引物组及方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115851915A true CN115851915A (zh) | 2023-03-28 |
Family
ID=85672560
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211600245.9A Pending CN115851915A (zh) | 2022-12-13 | 2022-12-13 | 检测遗传性共济失调致病基因的引物组及方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115851915A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117683876A (zh) * | 2023-12-15 | 2024-03-12 | 杭州金诺医学检验实验室有限公司 | 基于多重荧光TP-PCR和毛细管电泳技术检测SCAs9亚型的引物组、方法及其应用 |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1251616A (zh) * | 1997-01-07 | 2000-04-26 | 研究发展基金会 | 大规模鉴定疾病基因型的方法和6型脊髓小脑共济失调的诊断试验 |
| CN101595227A (zh) * | 2006-10-05 | 2009-12-02 | 奎斯特诊断投资公司 | 核酸大小检测方法 |
| CN103966332A (zh) * | 2014-05-19 | 2014-08-06 | 复旦大学 | 一组检测ctg重复序列的引物及其检测试剂盒 |
| CN105349662A (zh) * | 2015-11-27 | 2016-02-24 | 首都医科大学宣武医院 | 检测sca致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒 |
| CN106282367A (zh) * | 2016-09-12 | 2017-01-04 | 中南大学湘雅医院 | 一种sca致病基因cag三核苷酸重复突变检测试剂盒 |
| CN111961042A (zh) * | 2020-07-23 | 2020-11-20 | 中国科学院化学研究所 | 用于检测脊sca36基因ggcctg重复序列异常扩增的化合物及检测方法 |
| CN113046434A (zh) * | 2021-04-12 | 2021-06-29 | 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） | 用于sca亚型基因检测的引物对、试剂盒及检测方法 |
| CN114317719A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-04-12 | 苏州贝康医疗器械有限公司 | 用于检测脊髓小脑共济失调动态突变的试剂盒、方法和装置 |
| CN115216537A (zh) * | 2022-08-22 | 2022-10-21 | 迈基诺（重庆）基因科技有限责任公司 | 检测atxn10基因attct重复序列动态突变的引物组、试剂盒及方法 |
-
2022
- 2022-12-13 CN CN202211600245.9A patent/CN115851915A/zh active Pending
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1251616A (zh) * | 1997-01-07 | 2000-04-26 | 研究发展基金会 | 大规模鉴定疾病基因型的方法和6型脊髓小脑共济失调的诊断试验 |
| CN101595227A (zh) * | 2006-10-05 | 2009-12-02 | 奎斯特诊断投资公司 | 核酸大小检测方法 |
| CN103966332A (zh) * | 2014-05-19 | 2014-08-06 | 复旦大学 | 一组检测ctg重复序列的引物及其检测试剂盒 |
| CN105349662A (zh) * | 2015-11-27 | 2016-02-24 | 首都医科大学宣武医院 | 检测sca致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒 |
| CN106282367A (zh) * | 2016-09-12 | 2017-01-04 | 中南大学湘雅医院 | 一种sca致病基因cag三核苷酸重复突变检测试剂盒 |
| CN111961042A (zh) * | 2020-07-23 | 2020-11-20 | 中国科学院化学研究所 | 用于检测脊sca36基因ggcctg重复序列异常扩增的化合物及检测方法 |
| CN113046434A (zh) * | 2021-04-12 | 2021-06-29 | 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） | 用于sca亚型基因检测的引物对、试剂盒及检测方法 |
| CN114317719A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-04-12 | 苏州贝康医疗器械有限公司 | 用于检测脊髓小脑共济失调动态突变的试剂盒、方法和装置 |
| CN115216537A (zh) * | 2022-08-22 | 2022-10-21 | 迈基诺（重庆）基因科技有限责任公司 | 检测atxn10基因attct重复序列动态突变的引物组、试剂盒及方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CLAUDIA CAGNOLI等: "Detection of large pathogenic expansions in FRDA1, SCA10, and SCA12 genes using a simple fluorescent repeat-primed PCR assay", J MOL DIAGN., vol. 6, no. 2, 31 May 2004 (2004-05-31), pages 97 * |
| WIOLETTA KRYSA等: "Rapid detection of large expansions in progressive myoclonus epilepsy type 1, myotonic dystrophy type 2 and spinocerebellar ataxia type 8", NEUROL NEUROCHIR POL., vol. 46, no. 2, 30 April 2012 (2012-04-30), pages 1 - 2 * |
| 易继财主编: "基因工程原理与实验", vol. 978, 30 September 2020, 北京：中国农业大学出版社, pages: 68 * |
| 李松林等: "遗传性脊髓小脑共济失调的发病机制及临床表型", 河南大学学报（医学版）, vol. 37, no. 4, 30 December 2018 (2018-12-30), pages 1 * |
| 邬剑军等: "小脑共济失调的过去、现在和未来", 中国临床神经科学, vol. 14, no. 6, 20 November 2006 (2006-11-20), pages 6 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117683876A (zh) * | 2023-12-15 | 2024-03-12 | 杭州金诺医学检验实验室有限公司 | 基于多重荧光TP-PCR和毛细管电泳技术检测SCAs9亚型的引物组、方法及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114085903B (zh) | 检测线粒体3243a＞g突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法 | |
| CN111020031A (zh) | 序列特异性阻断剂结合特定pcr程序检测肿瘤基因突变的方法 | |
| CN115851915A (zh) | 检测遗传性共济失调致病基因的引物组及方法 | |
| Oh et al. | A digital PCR-based protocol to detect and quantify RNA editing events at hotspots | |
| Bonnal et al. | Reliable resequencing of the human dystrophin locus by universal long polymerase chain reaction and massive pyrosequencing | |
| CN102424833A (zh) | 多基因突变位点的实时pcr基因检测芯片及其检测方法 | |
| CN113930485B (zh) | 一种检测基因拷贝数变异的试剂及其应用 | |
| CN103088135B (zh) | 一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变荧光pcr熔解曲线检测试剂盒 | |
| CN116004775A (zh) | 一种人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物、试剂盒及方法 | |
| CN113151419B (zh) | 脊髓性肌萎缩症检测方法 | |
| JPH06508524A (ja) | アンギオテンシンｉ変換酵素の遺伝的多形性の試験手段及び方法 | |
| KR20110126076A (ko) | 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법 | |
| Jang et al. | Multiplex genotyping of cytokine gene SNPs using fluorescence bead array | |
| CN106868128B (zh) | 一组辅助诊断乳腺癌的生物标记物及其应用 | |
| CN110612355B (zh) | 用于定量pcr扩增的组合物及其应用 | |
| US8304184B2 (en) | Genotyping using multiple variant-specific primer pools | |
| CN108018285B (zh) | 一种超敏感引物及其设计方法和应用 | |
| CN111690738B (zh) | 检测pou3f4基因的成套试剂及试剂盒 | |
| CN113549674B (zh) | 一种检测样本中目标序列整合和突变的方法及其引物的设计方法和试剂盒 | |
| JP3779600B2 (ja) | Ｐｃｒ用プライマーおよびｐｃｒ用プライマーの塩基配列決定法 | |
| CN107267645A (zh) | 用于检测mthfr基因多态性的引物对、探针及试剂盒 | |
| CN114807437B (zh) | 一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量pcr检测试剂盒 | |
| CN113151595B (zh) | 用于检测hcv 6型耐药突变基因的扩增引物、检测方法及应用 | |
| KR20180033911A (ko) | 표적 핵산 또는 유전적 변이를 다중 검출하는 방법 | |
| WO2024119481A1 (zh) | 一种快速制备多重pcr测序文库的方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |