CN106282367A - 一种sca致病基因cag三核苷酸重复突变检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明利用琼脂糖凝胶电泳，毛细管电泳及T载体克隆测序的方法对中国人群常见SCA亚型1、2、3、6、7、8、17、DRPLA进行基因诊断。本发明对SCA致病基因CAG三核苷酸重复的突变检测分为3个部分：⑴将病人DNA样本进行琼脂糖凝胶电泳，进行初步诊断；⑵将病人DNA样本进行毛细管电泳，确定CAG三核苷酸重复突变次数，进一步诊断；⑶对于上述步骤中诊断为“患病”的样本相应亚型进行T载体克隆测序，确定致病基因内部结构，并最终确诊。

Description

一种SCA致病基因CAG三核苷酸重复突变检测试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学，诊断医学领域。更具体的说，本发明涉及利用琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳及T载体克隆测序的方法对中国人群常见SCA亚型1、2、3、6、7、8、17、DRPLA进行基因诊断。
背景技术
遗传性脊髓小脑型共济失调(SCA)是一类包括多种亚型共济失调在内的进行性神经系统变性疾病，呈常染色体显性遗传，发病率约为5/10万，占神经系统遗传性疾病的10％-15％。病变部位主要在小脑、脑干、脊髓，病理改变形式主要是神经元细胞脱失和胶质增生。临床表现为小脑性共济失调，伴构音障碍、意向性震颤，眼球活动障碍，锥体束和(或)锥体外系征等。SCA在临床上表现为众多的类型，各型之间常有重叠交叉的症状，临床表现在不同的种族、家系，不同的患者中均不尽相同，致使临床诊断的标准混杂。近年来，国外学者经连锁分析发现SCA在多条染色体区带上存在相关的致病基因，从而肯定了SCA具有高度的遗传异质性，并且提出今后应以基因型作为分型诊断依据。目前，已定位SCAl，SCA2，SCA3，SCA4，SCA5，SCA6，SCA7，SCA8，SCAIO，SCAll，SCAl2，SCAl3等，并克隆了SCAl，2，3，6，7，8，10基因，发现SCAl、2、3、6、7基因的编码区内均含有一段高度多态的、不稳定的CAG三核苷酸重复序列，其异常扩增与致病相关。
正常人基因内的CAG三核苷酸重复由数次至数十次，当重复数超出正常范围时，则导致疾病表型出现。异常扩增的CAG重复数与发病年龄呈负相关，与病情严重程度也有一定关系，且在世代传递中不稳定，可进一步扩增，导致后代发病年龄提早，病情加重，即遗传早现现象。目前，三核苷酸重复的动态突变，作为一种新的致病遗传机理而被提出，但其产生的分子机制及致病机制尚未明确。
目前临床应用上对于SCA致病基因CAG三核苷酸重复突变检测对临床诊断为SCA的患者进行进一步的分子诊断，多仅单用某一方法进行基因诊断，其中聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳，具有高灵敏度的优点，但是其特异度低，也不能确定具体的CAG重复次数。而毛细管电泳虽能在一定的精确度上确定CAG重复次数，但是不能很好的确定突变基因内部结构，其诊断的特异性及灵敏度相对较低。T载体克隆测序则能很好的测定基因内部结构，但由于可能出现的DNA链滑移而不能精确测定CAG重复次数。
SCA1，2，3，6，7，8，17，DRPLA等亚型是中国人群SCA发病率最高的8个亚型，目前的诊断方法多为对单个基因进行逐个的分析，尚无对这8种亚型的专一的诊断试剂盒。
发明内容
所述SCA致病基因CAG三核苷酸重复突变检测试剂盒中含有如下引物，用下述引物对样本DNA扩增，并依次进行琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳和T载体克隆测序检测：
SCA1正向引物：AACTGGAAATGTGGACGTA(SEQ ID NO.1)；
SCA1反向引物：CAACATGGGCAGTCTGAG(SEQ ID NO.2)；
SCA2正向引物：GGGCCCCTCACCATGTCG(SEQ ID NO.3)；
SCA2反向引物：GAGGACGAGGAGACCGAGGAC(SEQ ID NO.4)；
SCA3正向引物：CCAGTGACTACTTTGATTCG(SEQ ID NO.5)；
SCA3反向引物：CTTACCTAGATCACTCCCAA(SEQ ID NO.6)；
SCA6正向引物：CACGTGTCCTATTCCCCTGTGATCC(SEQ ID NO.7)；
SCA6反向引物：TGGGTACCTCCGAGGGCCGCTGGTG(SEQ ID NO.8)；
SCA7正向引物：TGTTACATTGTAGGAGCGGAA(SEQ ID NO.9)；
SCA7反向引物：CACGACTGTCCCAGCATCACTT(SEQ ID NO.10)；
SCA8正向引物：TTTGAGAAAGGCTTGTGAGGACTGAGAATG(SEQ ID NO.11)；
SCA8反向引物：GGTCCTTCATGTTAGAAAACCTGGCT(SEQ ID NO.12)；
SCA12正向引物：TGCTGGGAAAGAGTCGTG(SEQ ID NO.13)；
SCA12反向引物：CCCAGCGCACTCACCCTC(SEQ ID NO.14)；
SCA17正向引物：ATGCCTTATGGCACTGGACTG(SEQ ID NO.15)；
SCA17反向引物：CTGCTGGGACGTTGACTGCTG(SEQ ID NO.16)；
DRPLA正向引物：TGACCAACAGCAATGCCCATCCAG(SEQ ID NO.17)；
DRPLA反向引物：TCAGAGACCCAGGGAGGGAGACAT(SEQ ID NO.18)。
在使用上述引物对进行毛细管电泳检测时，引物对中正向引物的3’端均加有FAM荧光标记。
SCA1，2，3，6，7，8，17，DRPLA等亚型是中国人群SCA发病率最高的8个亚型，本发明的试剂盒，能对这8种亚型同时进行筛查，筛查步骤为：
(1)将病人DNA样本进行琼脂糖凝胶电泳，进行初步诊断；
(2)将病人DNA样本进行毛细管电泳，进一步诊断；
(3)对于上述步骤中诊断为“患病”的样本相应亚型进行T载体克隆测序，确定CAG三核苷酸重复突变次数。
在上述三步中，只有第二步使用加有荧光标记的引物。在第一步，琼脂糖凝胶电泳中，主要用于PCR扩增目的片段，染色用EB，因此不需要荧光；在第二步，必需要用到荧光引物，主要用于PCR扩增目的片段，荧光信号作为检测信号；在第三步，T载体克隆测序中，主要用于PCR扩增目的片段，条带切胶回收，供构建重组载体用；因此不需要荧光，也不能加荧光信号。
本发明试剂盒是目前国内对上述八种亚型诊断流程最完善的试剂盒，其成本低，技术方法成熟可靠，操作步骤相对简便，易于在临床进行推广，有利于对疾病进行标准化的检测和诊断。本发明融合琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳、T载体克隆测序这三种方法的突变检测试剂盒，能有效提高检测的准确度。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步具体说明。
图1 SCA1毛细管电泳检测结果；
图2 SCA2毛细管电泳检测结果；
图3 SCA3毛细管电泳检测结果；
图4 SCA6毛细管电泳检测结果；
图5 SCA7毛细管电泳检测结果；
图6 SCA8毛细管电泳检测结果；
图7 SCA12毛细管电泳检测结果；
图8 SCA17毛细管电泳检测结果；
图9 DRPLA毛细管电泳检测结果。
具体实施方式
1聚合酶链式反应(PCR)扩增目的条带
1.1PCR体系(25ul)
注：①5*PCR enhancer成分：2.7M甜菜碱，6.7mM DTT,6.7％DMSO,及55ug/ml BSA。
②用于不同亚型检测的琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳及T载体克隆测序的PCR反应体系(除所用引物外)及温度(如下)均一致。
③引物使用规则：不同亚型之间使用不同的引物进行扩增，具体引物序列参见SEQID NO.1—18；应用于琼脂糖凝胶电泳及T载体克隆测序的PCR使用普通的不加荧光的引物，用于毛细管电泳的PCR必须使用带荧光的正向引物或反向引物。
1.2PCR反应温度
2琼脂糖凝胶电泳
2.1试剂与材料
⑴电泳缓冲液(0.5×TBE或1×TBE)
5×TBE(贮存液)：0.45mol/L Tris碱、45mol/L硼酸、0.01mol/L EDTA(高压蒸汽灭菌后室温保存)
⑵载样液
①6×载样液：40％蔗糖、0.25％溴酚蓝；
②2×载样液：13％蔗糖、0.08％溴酚蓝。
⑶10mg/ml溴化乙锭(EB)
100mg EB溶于10ml水中，溶解后避光保存。
⑷电泳仪
⑸水平电泳槽(包括槽、梳子、凝胶成样器、电源线)
⑹透射式紫外照射仪(254nm,366nm)
⑺透明胶带
⑻照相机或凝胶扫描系统
2.2操作步骤
⑴用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。
⑵称量所需agarose粉末于锥形瓶中，加入电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。
⑶待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右，尽量避免气泡产生，若有气泡，马上用吸管吸出。
⑷凝胶凝固后，小心拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。
⑸加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1～2mm，小心向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA标准大小样品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。
⑹盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳，在0.8％的agarose中，溴酚蓝位于300bp DNA位置。
⑺切断电源，取出凝胶，放入0.5μg/ml的EB水溶液中染色10～15分钟。
⑻将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。
3回收纯化PCR产物
⑴干净的解剖刀从琼脂糖胶上将目的片断切下；
⑵称重，1体积的凝胶(100mg—100μl)中加入3倍体积的QG Buffer,回收柱的最大容量是400mg；
⑶50度水温孵育10分钟，或凝胶完全溶解，混合物的颜色应和QG Buffer的颜色一致；
⑷加与凝胶等体积的异丙醇，混匀，此步不离心；
⑸将样品转入柱子中，13000rpm离心1分钟；
⑹弃洗出液；
⑺加入0.5ml QG Buffer,离心1分钟；
⑻加入0.75ml PE Buffer洗脱,离心1分钟；
⑼弃洗出液，再离心1分钟,将柱子转移至干净的1.5ml的EP管中,加水离心1分钟。
运用T载体克隆测序对CAG/CAA异常重复次数测定
1、回收PCR产物与pGEM-T载体连接
参见pGEM-T说明书，按以下配比配制反应体系：
将上述溶液混匀，然后将其离心至管底，16℃水浴过夜连接。
2、连接产物的转化
⑴取一灭菌的50ml离心管，加入10ml LB培养基，接种100μl(1：100)初级JM109菌液；
⑵固定于摇床上250rpm，37℃振荡培养(摇至OD为0.4)；
⑶3000rpm，4℃离心，10min；
⑷吸去上清，在沉淀中加入10ml冰上预冷的0.1M CaCl2溶液，重悬菌液，冰上孵育30min；
⑸3000rpm，4℃离心，10min；
⑹吸去上清，在沉淀中加入600μl冰上预冷的0.1M CaCl2溶液，重悬菌液，插于冰上备用。
3、转化
⑴吸取连接产物5μl加入1.5ml微量离心管中，然后加入100μl制备好的感受态，混匀后插入冰上孵育30min；
⑵于42℃水浴中热激90sec，之后立即在冰上冷却5min；
⑶加入600μl无抗性液体LB培养基，固定于摇床上180rpm，37℃振荡培养50min；
⑷然后13000rpm离心1min，吸去上层培养基，用中tip吸残留的100μl无抗性液体LB培养基打散JM109细菌，再将JM109细菌铺于含A+(60μg/ml)的固体LB培养皿[培养基预先铺有IPTG(200g/ml，8μl)和X-gal(20mg/ml，8μl)]上培养过夜。
4、挑选克隆
次日在蓝白筛选明显的固体LB培养皿上挑选白色克隆5个，接种在加有3ml含A+液体培养基的15ml离心管中，在摇床上振荡培养(250rpm，37℃)8h，然后分别取1.5ml菌液用手工法抽提质粒；
⑴将菌液加入1.5ml离心管中，13000rpm，离心1分钟；
⑵加入200μl溶液R1(含RNA酶)，用枪打匀；
⑶加入200μl溶液R2，颠倒几次，静置4分钟，加入200μl溶液R3，颠倒几次，冰上孵育5分钟；
⑷13000rpm，离心10分钟，取上清，加入饱和酚300μl、三氯甲烷300μl，混匀；
⑸13000rpm，离心10分钟，取上层液体，加入600μl三氯甲烷，混匀；
⑹13000rpm，离心10分钟，取上层液体，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，混匀；
⑺13000rpm，4℃离心15分钟，倒去液体，吸干后加入75％乙醇洗一次，倒掉，在干燥箱中风干，用20μl水溶解。
5、鉴定克隆
单酶切(PVUⅡ)检测证实阳性克隆
将上述溶液混匀，然后将其离心至管底，37℃培养箱反应1h；取3μl反应产物与1μl6×中性载样缓冲液混合后，上样于6％中性聚丙烯酰胺胶，300V电泳40分钟，银染观察结果。
6、测序
用QIAprep Spin抽提阳性克隆质粒
⑴将约5-10ml菌液以3000rpm，室温离心10分钟，去上清，收集沉淀，沉淀用250μlP1溶液重悬，将重悬的菌液转入一新的1.5ml离心管；
⑵加入250μl P2溶液，轻轻颠倒4-6次，加入350μl N3溶液，轻轻颠倒4-6次；
⑶10000rpm，离心10分钟，将上清转移至Spin柱中，10000rpm离心1分钟，倒掉洗出液；
⑷用500μl PB溶液洗Spin柱，10000rpm离心1分钟，倒掉洗出，加入750μl PE溶液，10000rpm离心1分钟，倒掉洗出液；
⑸再次以10000rpm离心1分钟，去掉Spin柱上残留的溶液，加入20μl无菌水至Spin柱中央，静置5分钟；
⑹10000rpm离心1分钟，收集洗出液，测OD值。以T7、SP6通用引物为测序引物，对所提质粒进行测序，部分患者CAG/CAA重复次数通过8％含7m/L尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳后与分子质量标准以及已知重复次数的片段对比后估算获得。
7、正常对照者CAG/CAA重复次数测定
PCR反应条件以及体系同上，各SCA亚型基因CAG/CAA重复序列的PCR产物在ABIPRISM3100型遗传分析仪上进行毛细管电泳及片段长度自动分析，分子量标准为GS-400，同时取已知CAG/CAA重复次数的样品作为内对照。用Genotyper 2.5进行分析。CAG/CAA重复次数＝(片段长度-内对照长度)/3+内对照重复次数。
结果
该样本共检测临床常见的SCA1、2、3、6、7、8、12、17、DRPLA等常见常染色体显性遗传共济失调的亚型，所有样本CAG重复次数均处于正常范围(见表1)，建议结合临床进一步分析。
表1
最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.一种SCA致病基因CAG三核苷酸重复突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如下引物，用下述引物对样本DNA扩增，并依次进行琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳和T载体克隆测序检测：
SCA1正向引物：AACTGGAAATGTGGACGTA；
SCA1反向引物：CAACATGGGCAGTCTGAG；
SCA2正向引物：GGGCCCCTCACCATGTCG；
SCA2反向引物：GAGGACGAGGAGACCGAGGAC；
SCA3正向引物：CCAGTGACTACTTTGATTCG；
SCA3反向引物：CTTACCTAGATCACTCCCAA；
SCA6正向引物：CACGTGTCCTATTCCCCTGTGATCC；
SCA6反向引物：TGGGTACCTCCGAGGGCCGCTGGTG；
SCA7正向引物：TGTTACATTGTAGGAGCGGAA；
SCA7反向引物：CACGACTGTCCCAGCATCACTT；
SCA8正向引物：TTTGAGAAAGGCTTGTGAGGACTGAGAATG；
SCA8反向引物：GGTCCTTCATGTTAGAAAACCTGGCT；
SCA12正向引物：TGCTGGGAAAGAGTCGTG；
SCA12反向引物：CCCAGCGCACTCACCCTC；
SCA17正向引物：ATGCCTTATGGCACTGGACTG；
SCA17反向引物：CTGCTGGGACGTTGACTGCTG；
DRPLA正向引物：TGACCAACAGCAATGCCCATCCAG；
DRPLA反向引物：TCAGAGACCCAGGGAGGGAGACAT；
在使用上述引物对进行毛细管电泳检测时，引物对中正向引物的3’端均加有FAM荧光标记。
2.权利要求1所述试剂盒检测SCA致病基因CAG三核苷酸重复突变的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)用试剂盒中的引物对对样本DNA扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；
(2)用试剂盒中的引物对对样本DNA扩增后进行毛细管电泳检测分析；
(3)试剂盒中的引物对对样本DNA扩增后进行T载体克隆测序测序分析；用试剂盒引物对进行毛细管电泳检测时，引物对中正向引物的3’端均加有FAM荧光标记。
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