CN105441539A - 一种同时检测12种腹泻病原菌的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种同时检测12种腹泻病原菌的试剂盒及其应用，属于多重PCR检测技术领域。本发明的试剂盒含有分别针对12种常见腹泻病原菌的特异性嵌合引物和一对内参引物，特异性嵌合引物对的核苷酸序列分别如SEQ？ID？NO.1-32所示。本发明试剂盒通过设置多重PCR体系，优化反应条件，经单管一次PCR、琼脂糖电泳分析产物长度实现了对12种腹泻病原菌的准确检测。本发明的试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，适合对临床腹泻样本中常见病原菌的初筛和腹泻病的流行病学调查，具有良好的应用前景。

Description

一种同时检测12种腹泻病原菌的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及多重PCR检测技术领域，特别是涉及同时检测10种腹泻病原菌的方法和检测试剂盒及其应用。
背景技术
感染性腹泻病是一种常见病，发病率高，尤其在儿童中，造成了巨大的疾病负担。约10％-40％的感染性腹泻是由细菌性病原体引起，包括致病性大肠杆菌、志贺菌、沙门菌、弧菌和弯曲菌等。细菌分离培养是感染实验室诊断的金标准，但是操作繁琐、耗时很长、阳性率低，且操作人员的经验对结果的影响较大。核酸检测目前在病原检测中发挥了越来越重要的作用，尤其PCR为基础的技术，因操作简便、耗时短、阳性率高等优势，得到广泛的重视。普通的PCR为基础的检测体系，一般一个反应中只能检测1-3个靶标。要在更广范围内筛查病原体，就需要进行多个反应，相应增加了检测人员的工作量、提高了检测成本。能够同时检测多个靶标的多重PCR技术，是多病原筛查的可选手段之一。但是多重PCR技术经常难以获得满意的效果，主要问题表现在：(1)可容纳的反应数有限：一般情况下PCR产物以凝胶电泳进行分析，而普通凝胶电泳的区分能力差(100bp以上)，为使不同靶标的扩增产物能够明确区分，一个反应中能容纳的条带数会相对较少；(2)随着反应数的增加，体系中的引物相应增加，更易产生引物二聚体和其它非特异性扩增，影响检测的灵敏性和特异性；(3)反应体系中如果同时发生两个以上靶标的扩增，可能会因为靶基因特性的不同、引物组成不同或PCR试剂间的相互作用，造成不同靶基因扩增效率不一致也就是偏爱扩增这一问题，从而导致假阴性结果的出现。为弥补普通PCR技术的缺陷，本发明参考GenomeLabGeXP平台的扩增策略，为常见致腹泻病原菌设计了一个多重PCR检测体系。
GenomeLabGeXP多重基因表达遗传分析系统由美国BeckmanCoulter公司和Altheatechnologies公司研发，是主要用于研究多基因表达定量分析的技术平台。其核心技术是多重PCR扩增。整个反应体系中包含两种引物，一种是由基因特异性引物和通用引物组成的低浓度的嵌合引物，另外一种是游离于体系中的高浓度的通用引物。反应起始阶段，扩增由嵌合引物引发；随嵌合引物的消耗，体系中游离的通用引物在整个PCR中其主要作用。这种通用引物引发扩增的策略，有助于克服多重PCR扩增过程中的扩增偏爱性问题，并有利于维持样品中不同靶基因的比例。通用引物5’末端标记有荧光；对PCR产物进行毛细管电泳，根据所携带的荧光信号判断条带的位置和大小，进行多重定量检测。根据有关文献报道，GeXP平台已广泛用于药物毒力机制研究、拟南芥与铁吸收相关多基因表达调控、癌症早期诊断研究、免疫治疗、小鼠学习和记忆相关基因表达的多重定量分析等。在病原检测领域，此平台曾用于建立呼吸道病毒、肠道病毒、脑炎相关虫媒病毒的检测，而在细菌性病原体的检测方面研究较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测12种腹泻病原菌的多重PCR方法；本发明的目的还在于提供一种同时检测12种腹泻病原菌的试剂盒及其应用，以简化腹泻病原筛查的过程，提高病原菌的检出率。
为实现上述目的，通过查阅OIE、国标、行标和相关文献，确定12种常见腹泻病病原的致病基因或种属特异性基因，即大肠杆菌EPEC的bfpA基因、eaeA基因，大肠杆菌ETEC的elt基因、stp基因、sth基因，大肠杆菌EHEC的stx1、stx2基因，大肠杆菌EAEC的aggR基因，大肠杆菌EIEC的virA基因，志贺氏菌的virA基因，沙门氏菌的ompC基因，空肠弯曲菌的hipO基因，结肠弯曲菌的ceuE基因，霍乱弧菌的ompW基因，副溶血弧菌的toxR基因，小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因。查阅文献与各种资料，引用现有的或自行设计针对以上基因的引物序列。进行引物设计时，在GenBank数据库下载相关核酸序列，利用DNAStar、PrimerPremier5.0等软件选取其中保守区域设计引物。除一般的引物设计原则外，根据以下标准筛选出15对引物：(1)扩增产物大小在100bp-500bp之间；(2)不同扩增产物大小相差5bp以上。并将SEQIDNO.31-32所示的内参引物分别嵌合入上述15对特异性引物的5’端，得到15对特异性嵌合引物，核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-30所示。由此，本发明首先提供了一种同时检测上述12种腹泻病原菌的特异性嵌合引物对组合，包括以下引物对：
用于检测肠致病性大肠杆菌(enteropathogenicE.coli)EPEC的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1-2、SEQIDNO.3-4所示；
用于检测肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigenicE.coli)ETEC的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.5-6、SEQIDNO.7-8、SEQIDNO.9-10所示；
用于检测肠出血性大肠杆菌(enterohaemorrhagicE.coli)EHEC的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.11-12、SEQIDNO.13-14所示；
用于检测肠聚集性大肠杆菌(enteroaggregativeE.coli)EAEC的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.15-16所示；
用于检测肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasiveE.coli)EIEC和志贺氏菌(Shigellaspp)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.17-18所示；
用于检测沙门氏菌(Salmonellaspp)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.19-20所示；
用于检测空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.21-22所示；
用于检测结肠弯曲菌(Campylobactercoli)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.23-24所示；
用于检测霍乱弧菌(Vibriocholerae)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.25-26所示；
用于检测副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.27-28所示；
用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.29-30所示。
本发明提供了上述特异性嵌合引物对组合在制备同时检测12种腹泻病原菌试剂盒中的用途。
本发明提供一种内参引物在与上述特异性嵌合引物对组合配合使用在制备检测12种腹泻病原菌试剂盒中的应用，所述内参引物的核苷酸序列如SEQIDNO.31-32所示。
本发明提供一种检测试剂盒，含有上述的特异性嵌合引物对组合和一对内参引物，所述内参引物的核苷酸序列如SEQIDNO.31-32所示。
进一步地，本发明的检测试剂盒其工作程序包括以下步骤：
(1)提取待测样品的核酸；
(2)用本发明上述特异性嵌合引物对组合和SEQIDNO.31-32所示的内参引物，对样品DNA进行单管一次多重PCR反应；PCR产物电泳检测，可根据如下目的产物的片段大小判断样品中含有的病原菌种类，
若PCR产物片段为369bp和/或274bp，则为大肠杆菌EPEC；
若PCR产物片段为485bp和/或214bp和/或191，则为大肠杆菌ETEC；
若PCR产物片段为225bp和/或465bp，则为大肠杆菌EHEC；
若PCR产物片段为299bp，则为大肠杆菌EAEC；
若PCR产物片段为260bp，则为大肠杆菌EIEC或志贺氏菌；
若PCR产物片段为249bp，则为沙门氏菌；
若PCR产物片段为389bp，则为空肠弯曲菌；
若PCR产物片段为424bp，则为结肠弯曲菌；
若PCR产物片段为354bp，则为霍乱弧菌；
若PCR产物片段为413bp，则为副溶血弧菌；
若PCR产物片段为396bp，则为小肠结肠炎耶尔森氏菌。
本发明的试剂盒中，多重PCR反应各引物在引物预混液(10×)及PCR反应液中的浓度分别为：
本发明试剂盒的多重PCR反应条件为：95℃预变性15min；
95℃30s，58-62℃90s，72℃60s，5个循环；
95℃30s，64-68℃90s，72℃60s，5个循环；
95℃30s，54-56℃90s，72℃60s，30个循环；
72℃延伸3min；
上述热循环的升降温度为2.5℃/s。
本发明试剂盒的多重PCR反应体系为：QiagenMultiplexPCRMasterMix(Qiagen,Hilden,Germany)10μl，引物预混液(10×)2μl，内对照质粒pMD18T-IAC(104-105copies/μl)1μl，样本核酸2μl，去离子水5μl，总反应液体积为20μl。
本发明试剂盒的多重PCR结果以具有高分辨率的毛细管电泳设备进行分析，例如，在QIAxcel设备上以DNAHighResolutionkit进行片段分析，DNAAlignmentMarker15bp/600bp和sizemarker25bp/500bp用来确定片段大小。
本发明试剂盒还含有内对照质粒pMD18T-IAC104-105拷贝。
所述内对照质粒pMD18T-IAC为全基因合成的核酸片段(GenBank号FJ357008.1，参考文献DeerDM,LampelKA,González-EscalonaN.2010.AversatileinternalcontrolforuseasDNAinreal-timePCRandasRNAinreal-timereversetranscriptionPCRassays.LettApplMicrobiol50:366-372.)克隆到载体质粒pMD18-T而制备。
本发明借鉴GeXP平台的引物策略设计一套引物用于病原菌的检测；对扩增产物的分析，本发明可使用任何高分辨率(条带大小差异5bp以上可以区分)的电泳技术，此处以QIAxcel设备应用DNAHighResolutionkit为例进行说明。
在GeXP平台建立的检测方法，所查阅到的所有文献均采用通用引物对F:5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’；R:5’-GTACGACTCACTATAGGGA-3’。但是在本发明的研究过程中发现，这对通用引物用于肠道细菌检测时，由于其与肠道细菌的核酸序列有一定同源性，容易导致非特异性条带的产生，影响对结果的正确判断。本发明通过筛选新的通用引物，获得了稳定的扩增效果。
本发明针对12种腹泻病原菌设计的检测其毒力基因或种属特异性基因的特异性嵌合引物，避免了引物自身形成二级结构，避免了错配及非特异性片段出现；多重PCR体系中，设计引物序列时，还考虑到使上下游引物的TM值尽可能地接近、每种扩增产物大小在100bp-500bp之间且大小相差5bp以上。采用低浓度的特异性嵌合引物与高浓度的通用引物相结合的扩增策略，能极大降低多重PCR中存在的扩增偏爱性的影响，使结果更可靠。
本发明通过设置多重不对称PCR体系，优化反应体系的配置、PCR反应的温度、时间等，实现了对12种腹泻病原菌的准确检测。本发明在单个PCR扩增体系中可以同时检测15个靶标，覆盖了12类常见腹泻病原菌，使病原菌的筛查更简便、更广谱；以全自动毛细管电泳分析扩增产物，结果更易于判断；加入PCR扩增内对照，可识别样本中扩增抑制因素导致的假阴性。本发明的试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，对临床腹泻样本中常见病原菌的初筛和腹泻病的流行病学调查，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为仅含有一种靶基因的标准质粒为模板时，本发明的16重PCR体系扩增产物的QIAxcel毛细管电泳图。各泳道条带大小与对应的靶基因分别为，泳道1，369bp，EPEC的bfpA基因；泳道2，274bp，EPEC的eaeA基因；泳道3，485bp，ETEC的elt基因；泳道4，214bp，ETEC的stp基因；泳道5，191bp，ETEC的sth基因；泳道6，225bp，EHEC的stx1基因；泳道7，465bp，EHEC的stx2基因；泳道8，299bp，EAEC的aggR基因；泳道9，260bp，EIEC或志贺氏菌的virA基因；泳道10，249bp，沙门菌的ompC基因；泳道11，389bp，结肠弯曲菌的ceuE基因；泳道12，424bp，空肠弯曲菌的hipO基因；泳道13，396bp，小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因；泳道14，354bp，霍乱弧菌的ompW基因；泳道15，413bp，副溶血弧菌的toxR基因。
图2为致泻性大肠杆菌的菌株核酸为模板时，16重PCR体系扩增产物的QIAxcel毛细管电泳图。各泳道条带大小与对应的菌株模板分别为，泳道1，299bp(aggR阳性)，模板为EAEC；泳道2，485bp(elt阳性)，214bp(stp阳性)，191bp(sth阳性)；模板为ETEC；泳道3，369bp(bfpA阳性)，274bp(eaeA阳性)；模板为EPEC；泳道4，260bp(virA阳性)；模板为EIEC；泳道5，465bp(stx2阳性)，274bp(eaeA阳性)，225bp(stx1阳性)；模板为EHEC；泳道6，分子量marker。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
实施例1特异性嵌合引物的设计
通过查阅OIE、国标、行标和相关文献，确定12种常见腹泻病病原的致病基因或种属特异性基因，即大肠杆菌EPEC的bfpA基因、eaeA基因，大肠杆菌ETEC的elt基因、stp基因、sth基因，大肠杆菌EHEC的stx1、stx2基因，大肠杆菌EAEC的aggR基因，大肠杆菌EIEC的virA基因，志贺氏菌的virA基因，沙门氏菌的ompC基因，空肠弯曲菌的hipO基因，结肠弯曲菌的ceuE基因，霍乱弧菌的ompW基因，副溶血弧菌的toxR基因，小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因。查阅文献与各种资料，引用现有的或自行设计针对以上基因的引物序列。进行引物设计时，在GenBank数据库下载相关核酸序列，利用DNAStar、PrimerPremier5.0等软件选取其中保守区域设计引物。除一般的引物设计原则外，根据以下标准筛选出15对引物：(1)扩增产物大小在100bp-500bp之间；(2)不同扩增产物大小相差9bp以上。并将SEQIDNO.31-32所示的内参引物分别嵌合入上述15对特异性引物的5’端，得到15对特异性嵌合引物，核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-30所示。由此，本发明首先提供了一种同时检测上述12种腹泻病原菌的特异性嵌合引物对组合，序列如表1。表1中引物从上到下分别对应序列表中的SEQIDNO.1-32。
表1引物序列
注：f*是指在特异性引物的5’段连接内参引物IAC-f的序列得到特异性嵌合上游引物，r*是指在特异性引物的5’段连接内参引物IAC-r的序列特异性嵌合下游引物。
在GeXP平台建立的检测方法，所查阅到的所有文献均采用通用引物对F:5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’；R:5’-GTACGACTCACTATAGGGA-3’。但是在本发明的研究过程中发现，这对通用引物用于肠道细菌检测时，由于其与肠道细菌的核酸序列有一定同源性，容易导致非特异性条带的产生，影响对结果的正确判断。本发明通过选择其它的通用引物，获得了稳定的扩增效果。
引物是多重PCR的关键因素，本发明在设计引物时，(1)首先应该在保守性高的核苷酸片段中选择特异性较高的引物，但本发明设计引物的同时，不仅考虑了每种腹泻病原之间的高度保守区，且保守区中能同时代表腹泻病原的特异性片段，而且还必需保证每段高度保守区之间的特异性，这样不同的腹泻病原片段才易区分开。
(2)避免引物之间形成二级结构，例如自身发夹结构、上下游引物之间或者是引物与探针之间形成二聚体，同时引物避免与靶基因错配，如果一个引物与靶基因多个地方结合，会造成非特异性片段出现。
(3)引物的3’端必需保持高度保守，在退火过程中，引物的3’端是开始延伸的地方，这样才能进行最大效率的复制。
(4)Tm值为设计引物的重要决定因素，为引物的最佳退火温度提供参考数据，上下游引物的Tm值应可能的接近，同时考虑到12种腹泻病原的所有上下游引物Tm值最多不能超过10℃，为多重PCR做准备。
(5)由于同时检测的病原较多，每种腹泻病原都需设计1对或多对引物，还要避免15对引物之间、引物对与模板之间、内参引物与特异性嵌合引物之间、内参引物与不同PCR产物之间的交叉反应，最终从中筛选出表1中的最佳引物对组合。
实施例2同时检测12种腹泻病原菌的多重PCR检测体系的建立
1、多重PCR检测模板的制备
(1)标准质粒的构建：以特异性嵌合引物的3’端部分(即嵌合引物序列去除通用引物序列后的部分)扩增相应病原菌的核酸DNA，扩增产物连接载体质粒pMD19-TSimple，以E.ColiJM109为宿主菌，构建标准质粒。针对15个检测靶标，共构建15种标准质粒。
(2)标准质粒的提取与浓度测定：以QIAprepSpinMiniprepKit(Qiagen,Hilden,Germany)自携带标准质粒的宿主菌培养物中提取质粒；以超微量分光光度计NanoDropND-1000对核酸溶液进行浓度测定。
(3)标准质粒拷贝数的计算：每微升质粒溶液中含有的质粒拷贝数为：(6.02×1023)×(ng/μl×10-9)/(质粒碱基数×660)。
(4)标准质粒倍比稀释物的制备：根据各标准质粒的浓度，以去离子水将标准质粒按10倍比例进行倍比稀释，制备100-108拷贝/μl的溶液。
2、多重PCR体系的优化
(1)对特异性嵌合引物以及内参引物的浓度进行优化。首先采用特异性嵌合引物各50nM、内参引物500nM的浓度对标准质粒的系列稀释物进行扩增和检测；在Qiaxcel毛细管电泳中，根据sizemarker的大小和浓度对扩增产物的大小、产量进行定量。对于灵敏性较低、PCR产物的产量明显低于其它靶标的引物，上调其浓度；对于灵敏性高、PCR产物产量较高的引物，下调其浓度。通过多次尝试和对比，最终确定PCR反应液中15对特异性嵌合引物和1对内参引物的浓度见表1。
表1
(2)对热循环参数进行优化。首先按照QiagenMultiplexPCRMasterMix的使用说明，设置多重PCR反应条件为：95℃预变性15min；95℃30s，60℃90s，72℃60s，40个循环；72℃延伸3min。为促进特异性引物与模板的结合，将热循环的升降温度速度设置为2.5℃/s。对标准质粒检测中发现，有时会有非特异性条带产生；为提高扩增的特异性，减少特异性嵌合引物与非模板序列的结合，采取了temperatureswitchPCR的方式，采用三个退火温度，分别用于特异性嵌合引物3’端部分与模板的退火、特异性嵌合引物全长与模板的退火、内参引物与模板的退火。第一和第二阶段的退火温度较高，有利于提高引物与模板结合的特异性，减少非特异性扩增；第三阶段的退火温度较低，有利于提高PCR产物的产量，提高检测灵敏性。
在引物浓度优化过程中，采用的热循环参数为：
95℃预变性15min；
95℃30s，60℃90s，72℃60s，5个循环；
95℃30s，65℃90s，72℃60s，5个循环；
95℃30s，55℃90s，72℃60s，30个循环；
72℃延伸3min。
确定引物浓度后，本发明对比了多种退火温度的结果，发现在以下温度范围内，扩增结果没有明显差异：
95℃预变性15min；
95℃30s，58-62℃90s，72℃60s，40个循环；
95℃30s，64-68℃90s，72℃60s，5个循环；
95℃30s，54-56℃90s，72℃60s，30个循环；
72℃延伸3min；
3、多重PCR体系的建立
本发明的试剂盒中，多重PCR反应各引物在引物预混液(10×)及PCR反应液中的浓度分别见表2：
表2
本发明试剂盒的多重PCR反应体系为：QiagenMultiplexPCRMasterMix(Qiagen,Hilden,Germany)10μl，引物预混液(10×)2μl，内对照质粒pMD18T-IAC(104-105copies/μl)1μl，样本核酸2μl，去离子水5μl，总反应液体积为20μl。
本发明试剂盒的多重PCR反应条件为：95℃预变性15min；
95℃30s，58-62℃90s，72℃60s，5个循环；
95℃30s，64-68℃90s，72℃60s，5个循环；
95℃30s，54-56℃90s，72℃60s，30个循环；
72℃延伸3min；
上述热循环的升降温度为2.5℃/s。
4、检测结果的判定
如图1所示，多重PCR扩增产物在QIAxcel设备上以DNAHighResolutionkit进行片段分析，DNAAlignmentMarker15bp/600bp和sizemarker25bp/500bp用来确定片段大小。各泳道条带大小与对应的靶基因分别为，泳道1，369bp，EPEC的bfpA基因；泳道2，274bp，EPEC的eaeA基因；泳道3，485bp，ETEC的elt基因；泳道4，214bp，ETEC的stp基因；泳道5，191bp，ETEC的sth基因；泳道6，225bp，EHEC的stx1基因；泳道7，465bp，EHEC的stx2基因；泳道8，299bp，EAEC的aggR基因；泳道9，260bp，EIEC或志贺氏菌的virA基因；泳道10，249bp，沙门菌的ompC基因；泳道11，389bp，结肠弯曲菌的ceuE基因；泳道12，424bp，空肠弯曲菌的hipO基因；泳道13，396bp，小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因；泳道14，354bp，霍乱弧菌的ompW基因；泳道15，413bp，副溶血弧菌的toxR基因。
实施例3同时检测12种腹泻病原菌的多重PCR的特性验证
1、特异性实验
279个菌株用于验证本发明的特异性，包括属于本发明检测范围的207株菌：43株霍乱弧菌、20株副溶血弧菌、6株空肠弯曲菌、6株结肠弯曲菌、24株沙门菌、10株志贺氏菌、5株EIEC、19株EAEC、26株EPEC、45株ETEC和2株EHEC；不属于本发明检测范围的72株菌：40株非致病性大肠杆菌、18株气单胞菌、6株拟态弧菌、6株河弧菌、1株创伤弧菌和1株迟缓爱德华菌。对于霍乱弧菌、副溶血弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、沙门菌、EIEC&志贺菌和EAEC，除内参对照条带(145bp)之外，只有一个电泳条带被检测到，且条带大小与设计的扩增产物大小相符。26株EPEC，3株EHEC和45株ETEC均有1-3个扩增产物被检测到，符合相应病原菌的检出标准。72株不属于本发明检测范围的菌株，均只有内参对照145bp条带产生。
如图2所示，为致泻性大肠杆菌的菌株核酸为模板时，16重PCR体系扩增产物的QIAxcel毛细管电泳图。
2、灵敏度实验
将携带靶基因的标准质粒系列稀释液(100-108拷贝/μl)作为模板，以16重PCR体系进行检测，发现16重PCR体系对每种靶标基因的检测灵敏度为：对靶标基因空肠弯曲菌ceuE、结肠弯曲菌hipO、副溶血弧菌toxR和EHEC的stx2，灵敏度为5000拷贝/反应；对其它靶标基因的灵敏度为500拷贝/反应。
3、准确性实验
对上述特异性实验中使用的菌株，用现有技术已报道的上述各菌株的单重荧光PCR体系进行检测，检测结果与本发明的结果一致。说明本发明同时检测12种腹泻病原菌的方法准确度高，达到100％。
实施例4同时检测12种腹泻病原菌的方法的临床应用
自江苏无锡的医院门诊采集有腹泻症状患者的粪便样本共243份，每份取200mg，在MagNAPureLC2.0设备(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN)以MagNAPureLCTotalNucleicAcidIsolationKit提取核酸，或手工以QIAmpStoolMiniKit提取核酸。两种方法都以50μl洗脱液洗脱核酸。扩增内对照的模板质粒pMD18T-IAC为全基因合成200bp的DNA片段并连接到载体pMD18-T而获得。
采用实施例2建立的多重PCR方法，PCR反应体系：20μlPCR反应体系中含有QiagenMultiplexPCRMasterMix(Qiagen,Hilden,Germany)10μl，内对照质粒pMD18T-IAC2×104copies，模板2μl。靶标特异性嵌合引物和通用引物(内参引物)按照实施例2中优化后的工作终浓度，PCR扩增条件参见实施例2优化后的条件，即95℃预变性15min；95℃30s，60℃90s，72℃60s，5个循环；95℃30s，65℃90s，72℃60s，5个循环；95℃30s，54℃90s，72℃60s，30个循环；72℃延伸3min，热循环的升降温速度(rampspeed)设置为2.5℃/s。
凝胶电泳：在QIAxcel设备上以DNAHighResolutionkit(Qiagen,Hilden,Germany)进行片段分析。DNAAlignmentMarker15bp/600bp和sizemarker25bp/500bp(Qiagen,Hilden,Germany)用来确定片段大小。
判定方法：根据条带的大小判断靶标是否存在。如果扩增内对照条带(145bp)与靶标条带全部没有出现，体系中存在扩增抑制因素，为假阴性结果。
检测结果：所有样本均有扩增条带出现(内参对照阳性和/或靶标基因阳性)，未发现扩增抑制因素。其中，
15个样本出现191bp条带，判定为ETEC阳性(sth阳性)；
5个样本出现485bp条带，判定为ETEC阳性(elt阳性)；
7个样本出现274bp条带，判定为EPEC阳性(eaeA阳性)；
4个样本出现299bp条带，判定为EAEC阳性(aggR阳性)；
3个样本出现225bp条带，判定为EHEC阳性(stx1阳性)；
3个样本出现260bp条带，判定为EIEC或志贺氏菌阳性(virA阳性)；
2个样本出现424bp条带，判定为空肠弯曲菌阳性(hipO阳性)；
1个样本出现249bp条带，判定为沙门菌阳性(ompC阳性)。
阳性样本中，有6个样本同时2-3个靶标基因阳性，分别为：
2个样本ETEC阳性(sth&elt均阳性)；
1个样本ETEC阳性(sth&elt阳性)和EPEC阳性(eaeA阳性)；
1个样本EPEC阳性(eaeA阳性)、EIEC或志贺菌阳性(virA阳性)；
1个样本EPEC阳性(eaeA阳性)和EAEC阳性(aggR阳性)；
1个样本EAEC阳性(aggR阳性)和ETEC阳性(sth阳性)。
对出现靶标基因扩增条带的样本，以现有技术已报道的上述各菌株的PCR体系进行检测，发现结果一致。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种同时检测12种腹泻病原菌的特异性嵌合引物对组合，其特征在于，含有以下引物对：
用于检测肠致病性大肠杆菌(enteropathogenicEscherichiacoli)EPEC的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1-2、SEQIDNO.3-4所示；
用于检测肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigenicE.coli)ETEC的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.5-6、SEQIDNO.7-8、SEQIDNO.9-10所示；
用于检测肠出血性大肠杆菌(enterohaemorrhagicE.coli)EHEC的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.11-12、SEQIDNO.13-14所示；
用于检测肠聚集性大肠杆菌(enteroaggregativeE.coli)EAEC的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.15-16所示；
用于检测肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasiveE.coli)EIEC和志贺氏菌(Shigellaspp)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.17-18所示；
用于检测沙门氏菌(Salmonellaspp)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.19-20所示；
用于检测空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.21-22所示；
用于检测结肠弯曲菌(Campylobactercoli)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.23-24所示；
用于检测霍乱弧菌(Vibriocholerae)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.25-26所示；
用于检测副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.27-28所示；
用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.29-30所示。
2.权利要求1所述的特异性嵌合引物对组合在制备同时检测12种腹泻病原菌试剂盒中的用途。
3.一种内参引物在与权利要求1所述的特异性嵌合引物对组合配合使用在制备检测12种腹泻病原菌试剂盒中的应用，所述内参引物的核苷酸序列如SEQIDNO.31-32所示。
4.一种检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的特异性嵌合引物对组合和一对内参引物，所述内参引物的核苷酸序列如SEQIDNO.31-32所示。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序包括以下步骤：
(1)提取待测样品的核酸；
(2)用权利要求1所述的特异性嵌合引物对组合和SEQIDNO.31-32所示的内参引物，对样品DNA进行单管一次多重PCR反应；PCR产物经电泳检测，可根据如下目的产物的片段大小判断样品中含有的病原菌种类，
若PCR产物片段为369bp和/或274bp，则为大肠杆菌EPEC；
若PCR产物片段为485bp和/或214bp和/或191，则为大肠杆菌ETEC；
若PCR产物片段为225bp和/或465bp，则为大肠杆菌EHEC；
若PCR产物片段为299bp，则为大肠杆菌EAEC；
若PCR产物片段为260bp，则为大肠杆菌EIEC或志贺氏菌；
若PCR产物片段为249bp，则为沙门氏菌；
若PCR产物片段为389bp，则为空肠弯曲菌；
若PCR产物片段为424bp，则为结肠弯曲菌；
若PCR产物片段为354bp，则为霍乱弧菌；
若PCR产物片段为413bp，则为副溶血弧菌；
若PCR产物片段为396bp，则为小肠结肠炎耶尔森氏菌。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR反应，各引物在引物预混液及PCR反应液中的浓度分别为：
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，多重PCR反应条件为：95℃预变性15min；
95℃30s，58-62℃90s，72℃60s，5个循环；
95℃30s，64-68℃90s，72℃60s，5个循环；
95℃30s，54-56℃90s，72℃60s，30个循环；
72℃延伸3min；
上述热循环的升降温度为2.5℃/s。
8.如权利要求4-7任一所述的试剂盒，其多重PCR结果以具有高分辨率的毛细管电泳设备进行分析。
9.如权利要求4-7任一所述的试剂盒，还含有内对照质粒pMD18T-IAC104-105拷贝。
10.权利要求4-9任一所述的试剂盒在检测腹泻病原菌中的应用。
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