KR101156719B1 - 병원성 대장균 검출방법 및 검출세트 - Google Patents

병원성 대장균 검출방법 및 검출세트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 병원성 대장균 검출방법 및 검출세트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 멀티플렉스 PCR 방법에 의한 5종의 병원성 대장균을 동시에 신속 정확하게 검출하는 방법 및 상기 방법을 실시하기 용이한 검출 키트에 관한 것이다.

Description

병원성 대장균 검출방법 및 검출세트{METHOD OF DETECTING ENTEROVIRULENT ESCHERICHIA COLI AND DETECTION SET}
본 발명은 병원성 대장균 검출방법 및 검출세트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 멀티플렉스 PCR로 병원성 대장균 종류를 신속, 정확하게 검출할 수 있는 방법 및 검출세트에 관한 것이다.
설사병은 개발도상국의 어린아이들의 높은 사망률을 보이는 심각성을 갖는 질병인데 설사병을 일으키는 가장 빈번한 세균은 병원성 대장균으로 알려져 있다 (Nataro, J.P. and Kaper, J.B., 1998).
1940년대부터 비병원성 대장균과 혈청형이 다른 병원성 대장균이 밝혀지기 시작했는데 지금까지 그 병원 인자와 발병 기작에 따라 장출혈성 대장균 (enterohemorrhagic E. coli, EHEC), 장관병원성 대장균 (enteropathogenic E. coli, EPEC), 장관독소원성 대장균 (enterotoxigenic E. coli, ETEC), 장관부착성대장균 (enteroaggregative E. coli, EAEC), 장관조직침입성 대장균 (enteroinvasive E. coli, EIEC) 등 5 종류로 분류된다. 그 중에서도 장관출혈성대장균 감염증은 주로 미국과 일본을 비롯한 선진국에서 발생하는 식품매개성 질환으로서 합병증인 용혈성 요독 증후군을 일으켜 심한 경우 사망에 이르는 질환이다.
병원성 대장균은 환자의 검체에서 동정하고 분리할 때 비병원성 대장균과 구분이 어려워서 고전적인 생화학적인 방법으로는 힘든 면이 있다. 따라서 독소유전자를 검출하는 PCR 방법이나 항원-항체반응을 이용한 면역학적인 방법이 주로 사용되고 있다. 하지만 면역학적인 방법은 비용이 많이 든다는 단점이 있어서 주로 PCR 방법을 많이 사용하고 있다.
각 병원성 대장균에는 고유의 병인 독소를 함유하고 있다. 각각의 단일 독소를 PCR로 검출할 수 있는 방법은 개발이 잘 되어 있지만 여러 종을 검출하는 데 많은 시간과 비용이 들 수밖에 없다.
일예로, 대한민국 특허공개 제2002-0090257호는 대장균 O-157:H7, O-20과 같은 장관출혈성 대장균(EHEC) 및 O-28과 같은 장독소원성 대장균(ETEC)에 의해 유발되는 장염유발 대장균, 비병원성 대장균 및 수계오염지표가 되는 대장균군의 동시검출하기 위한 멀티플렉스 PCR용 프라이머들, 및 이를 포함하는 키트를 개시하고 있다.
그러나, 상기 특허에 개시된 멀티플렉스 PCR용 프라이머를 이용하더라도 장관출혈성 대장균(EHEC), 장독소원성 대장균(ETEC)의 검출은 가능하나, 장관병원성 대장균(EPEC), 장관부착성 대장균(EAEC), 장관조직침입성 대장균(EIEC)의 동시 검출은 어렵다.
따라서, 위의 다섯 가지 종의 병원성 대장균의 독소 유전자를 환자 검체로부터 한 번에 검출할 수 있는 PCR 방법을 개발한다면 일선에서 근무하는 보건 검사실에서의 노동력과 비용을 크게 절감할 수 있을 것이다.
따라서, 병원성 대장균 종류를 신속 정확하게 한 번에 검출할 수 있는 효율적인 방법이 필요한 실정이다.
대한민국 특허공개 제2002-0090257호
이에 본 발명자들은 실시간 PCR을 이용하여 병원성 대장균 종류를 검출할 수 있는 방법 및 키트에 대하여 다각적 연구를 수행하던 중, 하나의 검사 반응물에서 8종의 독소 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 확립하게 되었으며, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.
상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명의 해결하고자 하는 과제는 병원성 대장균 종류를 정확하고 신속하게 검출할 수 있는 검출세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 병원성 대장균 종류를 정확하게 판단할 수 있는 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 과제는 사용이 용이하며, 단시간에 신속 정확하게 다섯 가지 병원성 대장균 종류를 검출할 수 있는 검출키트를 제공하는 것이다.
상기 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 장출혈성 대장균 검출용 프라이머 쌍; (2) 서열번호 5 내지 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 장관독소원성 대장균 검출용 프라이머 쌍; (3) 서열번호 9 내지 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 장관병원성 대장균 검출용 프라이머 쌍; (4) 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 장관부착성 대장균 검출용 프라이머 쌍; 및 (5) 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 장관조직 침입성 대장균 검출용 프라이머 쌍을 포함하는, 병원성 대장균을 멀티플렉스 PCR로 검출하기 위한 병원성 대장균 검출세트를 제공한다.
또한 본 발명은 시료로부터 추출한 DNA를 제1항의 검출세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR로 증폭하는 단계; 및
상기 멀티플렉스 PCR 증폭 산물을 전기영동장치를 통해 확인하여 독소 유전자를 검출하고 병원성 대장균 종류를 판단하는 단계를 포함하는 병원성 대장균 검출방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 병원성 대장균 검출세트를 포함하는, 병원성 대장균 검출키트를 제공한다.
본 발명의 병원성 대장균 검출세트 및 검출방법은 멀티플렉스 PCR 방법에 의해 다섯 가지 병원성 대장균 종류를 동시에 신속 정확하게 판단할 수 있다. 따라서, 8종의 독소형을 검사하는 시간을 절반 이하로 단축하여 시간, 비용 그리고 노동력을 크게 단축하는 효과가 있다.
도 1 내지 도 8은 본 발명에 따른 병원성 대장균 검출세트의 검출한계를 측정하기 위해 실시한 멀티플렉스 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 병원성 대장균 검출세트의 정확도를 알아보기 위해 수행한 독소 유전자를 함유한 양성 균주 E. coli O157와 8종의 음성 균주에 대한 멀티플렉스 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에 따른 병원성 대장균 검출세트를 이용하여 실제 설사 환자의 대변 검체를 대상으로 멀티플렉스 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 5가지 종류의 병원성 대장균이 갖는 8가지 독소형 유전자를 8쌍의 프라이머 조합을 이용한 멀티플렉스 PCR을 통해 특이적으로 증폭시키고, PCR 산물의 크기를 분석함으로써, 병원성 대장균의 종류를 검출하는 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 8가지 독소형 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 검출세트로 하여, 병원성 대장균 종류 확인에 필요한 과정을 현저하게 단축시킨 신속 정확한 방법이다.
이러한 본 발명의 병원성 대장균 검출세트의 상세한 사항은 하기 표 1과 같다.
병원성
대장균 종류		 서열번호 독소
유전자		 명명 염기서열 크기 (bp)
EHEC 1 stx2 EC-vt2_2-F TAC CAC TCT GCA ACG TGT CG 297
2 EC-vt2_2-R CGA TAC TCC GGA AGC ACA TT
3 stx1 EC-vt1_2-F CGT CTT TAC TGA TGA TTG ATA GTG GC 637
4 EC-vt1_2-R CGC GAT GCA TGA TGA TGA C
ETEC 5 st ET-ST_(C)-F TTC GCT CAG GAT GCT AAA CCA 167
6 ST-148R TTA ATA GCA CCC GGT ACA AGC AGG
7 lt ET - LT -F GTA CTT CGA TAG AGG AAC TCA AAT GAA TAT 530
8 ET - LT -R ATT CTG GGT CTC CTC ATT ACA AGT ATC
EPEC 9 eaeA eaeA 220F CGG CGA TTA CGC GAA AGA 248
10 eaeA 220R CCT AAA TTT GCC GTA AAG CGG
11 bfpA EP-bfpA(400)-F3 AGA ATG CTA TTT CAG AAG TAA TGA GCG 400
12 EC-bfpA-R TTA CAT GCA GTT GCC GCT TC
EAEC 13 aggR EC-aggR-F3 TTA AAA TAA GTC AAR AAT TGT TTT GGT GTT A 715
14 EC-aggR-R3 ATT ATA AAA ATT AAC AAT ATC AGA ATA CAT CAG TAC AC
EIEC 15 ipaH Sh-ipF1 CCT TTT CCG CGT TCC TTG A 104
16 Sh-ipR3 CAG CAG CAA CAG CGA AAG AC
본 발명에 따른 8쌍의 프라이머 조합은 하나의 PCR 반응물에서, 즉 동일한 PCR 조건하에서 각 프라이머쌍을 별도의 PCR 반응물에서 PCR할 경우와 동일하게, 균일한 PCR 증폭 결과를 형성할 수 있도록 특별히 고안된 것이며, 각각의 프라이머 쌍은 서로 다른 크기로 PCR 산물을 증폭하도록 고안된 것이다. 따라서, 증폭된 PCR 산물 크기를 확인함으로써 증폭에 작용한 프라이머 쌍을 쉽게 알 수 있으며, 상기 프라이머가 타겟으로 하는 독소 유전자형을 파악하여, 병원성 대장균 종류를 용이하게 식별할 수 있다.
본 발명의 검출방법은 병원성 대장균이 오염되었을 것으로 예상되는 시료에 적용할 수 있다. 일예로, 사람의 대변, 식품이나 물 등 환경 검체도 가능하며, 이에 한정되는 것이다.
검출을 위한 DNA 추출은 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있고, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있다.
본 발명의 검출방법에 있어, 멀티플렉스 PCR 반응 조건은 통상적인 조건을 취할 수 있다. 일예로 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 10분간 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 30초), 결합(annealing, 58℃에서 30초), 중합(polymerization, 72℃에서 1분)을 총 35회 반복한 후, 최종적으로 중합단계를 72 ℃에서 5분 동안 실시하는 조건을 취할 수 있다.
다음으로, 멀티플렉스 PCR 증폭 산물의 크기를 분석함으로써 각각의 독소 유전자형 존재 여부를 판정한다. 증폭 산물의 크기 분석은 예컨대 아가로즈 젤 또는 아크릴아미드 젤을 이용한 전기영동에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 병원성 대장균 검출세트 및 이를 이용한 검출방법을 통해, 5종의 병원성 대장균 종류를 각각 식별할 수 있다.
구체적인 식별 방법은 다음과 같다.
(1) 장출혈성 대장균(EHEC): 프라이머 쌍 EC-vt1_2-F, EC-vt1_2-R, EC-vt2_2-F, 및 EC-vt2_2-R에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장출혈성 대장균으로 판정한다.
(2) 장관독소원성 대장균(ETEC): 프라이머 쌍 ET-ST_(C)-F, ST-148R, ET-LT-F, 및 ET-LT-R에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장관독소원성 대장균으로 판정한다.
(3) 장관병원성 대장균(EPEC): 프라이머 쌍 eaeA 220F, eaeA 220R, EP-bfpa(400)-F3, 및 EC-bfpA-R에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장관병원성 대장균으로 판정한다.
(4) 장관부착성 대장균(EAEC) : 프라이머 쌍 DK50, DK1412, DK17-1, DK34, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 동진1벼로 판정한다.
(5) 장관조직 침입성 대장균(EIEC) : 프라이머 쌍 Sh-ipF1 및 Sh-ipR3에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 장관조직 침입성 대장균으로 판정한다.
또한, 본 발명은 상기 병원성 대장균 검출세트를 포함하는 병원성 대장균 검출키트를 제공한다. 이때 검출세트의 프라이머 쌍은 하나의 반응 용기, 스트립 또는 마이크로플레이트에 패키징될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법으로 패키징된다.
본 발명의 키트는 택 중합효소(Taq polymerase), MgCl2를 포함한 반응 완충액, dNTP 및 안정화제(stabilizer)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있으며, 그 외에도 당업계에 공지된 다른 시약을 추가적으로 포함할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 병원성대장균 특이적 프라이머 제조
1-1. 프라이머 제조
병원성대장균의 독소 유전자형을 비교하여 특이적 프라이머를 개발하였다. 각 병원성대장균의 독소 유전자는 정출혈성대장균의 쉬가독소 (stx1과 stx2), 장관병원성대장균의 intimine (eaeA) 과 bundle-forming pili (bfpA), 장관독소원성대장균의 내열성독소(st) 와 이열성독소 (lt), 장관부착성대장균의 집적인자 (aggR), 마지막으로 장관조직침입성대장균의 조직침입인자 (ipaH) 등이 있다. 각 독소형에 따른 염기서열의 비교에 사용된 염기서열 자료는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/에서 얻었다. 또한 각 유전자의 염기서열 비교를 위해 http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html 의 프로그램을 이용하여 각 독소형에 따른 유전자의 차이를 확인하여 병원성대장균 검출을 위한 특이 프라이머를 제작하였다. 각 독소형에 따른 프라이머의 정보와 멀티플레스 구성은 상기 표 1에 나타내었다.
1-2: DNA 추출
배양액 1 ml를 1.5 ml 튜브에 조심스럽게 옮겼다. 12,000 rpm으로 3분 이상 5분 이하로 원심분리를 진행하였다. 원심분리 후 상층을 조심스럽게 제거하였다. 멸균 증류수 1 ml를 넣고 강하게 흔들어 튜브 바닥에 있는 미생물을 풀어주었다. 12,000 rpm으로 3분 동안 원심 분리 후 상층액을 버렸다. 멸균 증류수를 1 ml을 넣고 강하게 혼합하여 튜브 바닥에 있는 미생물을 풀어주었다. 12,000 rpm으로 3분 원심 분리하였다. 상층액을 조심스럽게 제거한 후 0.2 ml의 멸균 증류수를 넣고, 95~100℃로 10 분간 가열하였다. 이때 튜브 뚜껑이 열리지 않게 조심하였다. 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 PCR 반응에 이용하였다.
실시예 2: Multiplex PCR primer 의 민감도 측정
PCR 반응에 사용된 DNA 중합 효소는 (주)코젠바이오텍 PowerAmpTM 2X premix (Cat. No. T0001)을 이용하였다㎕. 반응액 조제 성분은 아래 표 2와 같다.
성분 부피(㎕)
2X premix 10
Primer mixture 2
template 5
DW 3
Total 20
상기와 같이 준비된 반응 혼합물을 95℃, 10분 → [95℃, 30초 → 58℃, 30초 → 72℃, 1분] 35회 반복 → 72℃, 5분 반응시켜 PCR을 수행하였다.
상기 실시예 1에서 제조된 프라이머세트의 민감도를 측정하기 위해, 각 독소 유전자를 플라즈미드 형태로 클로닝하여 각 독소 유전자를 10 배 단위로 희석하여 민감도를 확인하였다. 그 결과는 도 1 내지 8에 나타내었다.
도 1 내지 도 8을 참조하면, EIEC의 ipaH 독소 유전자는 3.29*104 copies 까지의 검출한계를 나타내고, ETEC 독소 유전자 검출에 이용된 st 와 lt 독소 유전자는 각각 2.77*104 copies와 8.74*102 copies의 검출한계를 보였다. EPEC의 독소 유전자 eaeA와 bfpA 의 검출한계는 각각 1.87*104 copies와 1.01*102 copies이다. EHEC 의 독소 유전자인 stx2와 stx1의 검출한계는 각각 1.56*104 copies와 7.27*102 copies 이 검출한계를 보였다. EAEC 독소유전자 aggR의 검출한계는 6.48*102 로 ㄴ나타났다. 본 발명에서 제조된 멀티플렉스의 검출한계는 위와 같이 대략 104 ~ 102 개의 copies에서 검출한계를 보였다.
실시예 3: Multiplex PCR primer 의 정확도 판정
상기 실시예 1에서 제조된 병원성 대장균 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트를 이용하여 병원성 대장균 E. coli O157과 음성대조군으로 병원성 대장균 이외의 미생물과 반응하여 정확도를 확인하였다. 이때 사용한 음성대조군은 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클로스트리듐 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 비브리오 파라해모리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 그리고 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 이었다.
도 9는 본 발명에 따른 병원성 대장균 검출세트의 정확도를 알아보기 위해 수행한 독소 유전자를 함유한 양성 균주 E. coli O157와 8종의 음성 균주에 대한 멀티플렉스 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 레인 3번의 E. coli O157의 독소 유전자인 stx1와 stx2의 증폭을 확인하였고, 다음 음성대조군에서는 검출되지 않아 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트가 특정 독소 유전자만 특이적으로 증폭함을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 임상의 대변검체 DNA 상에서의 병원성대장균 검출능 확인
실제 환자의 대변 검체를 이용하여 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트의 병원성 대장균 검출능을 검사하였다.
도 10은 본 발명에 따른 병원성 대장균 검출세트를 이용하여 실제 설사 환자의 대변 검체를 대상으로 멀티플렉스 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 10을 참조하면, 12개의 대변 검체(unknown sample)에 들어있는 병원성 대장균의 독소 유전자에 대한 특이적인 밴드를 확인할 수 있었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

  1. (1) 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 장출혈성 대장균 검출용 프라이머 쌍;
    (2) 서열번호 5 내지 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 장관독소원성 대장균 검출용 프라이머 쌍;
    (3) 서열번호 9 내지 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 장관병원성 대장균 검출용 프라이머 쌍;
    (4) 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 장관부착성 대장균 검출용 프라이머 쌍; 및
    (5) 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 장관조직 침입성 대장균 검출용 프라이머 쌍
    을 포함하는, 병원성 대장균을 멀티플렉스 PCR로 검출하기 위한 병원성 대장균 검출세트.
  2. 시료로부터 추출한 DNA를 제1항의 검출세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR로 증폭하는 단계; 및
    상기 멀티플렉스 PCR 증폭 산물을 전기영동장치를 통해 확인하여 독소 유전자를 검출하고 병원성 대장균 종류를 판단하는 단계
    를 포함하는 병원성 대장균 검출방법.
  3. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 병원성 대장균을 검출하는 제1항의 검출세트, 반응완충액, dNTP 및 DNA 중합효소를 포함하는 병원성 대장균 검출키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 검출세트는 하나의 반응 용기, 스트립(strip) 또는 마이크로플레이트에 패키징 되는 것을 특징으로 하는 병원성 대장균 검출키트.
KR1020110107959A 2011-10-21 2011-10-21 병원성 대장균 검출방법 및 검출세트 KR101156719B1 (ko)

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KR1020110107959A KR101156719B1 (ko) 2011-10-21 2011-10-21 병원성 대장균 검출방법 및 검출세트

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KR102027157B1 (ko) * 2019-03-21 2019-10-01 티엔에스(주) 장관병원성 대장균 (Enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)과 장관조직 침입성 대장균 (Enteroinvasive Escherichia coli, EIEC) screening이 가능한 검출용 primer 및 PNA probe와 이를 이용한 대장균 Real-time multiplex PCR 검출 방법
KR20200025330A (ko) 2018-08-30 2020-03-10 이옥재 서로 다른 배양 환경이 조성되는 배양공간을 구비한 배양조
KR20200059762A (ko) 2018-11-21 2020-05-29 경희대학교 산학협력단 LT, ST 타겟 유전자를 통해 장독소원성 대장균 (ETEC)을 신속검출할 수 있는 Singleplex Real-Time PCR 키트의 개발
KR20200059763A (ko) 2018-11-21 2020-05-29 경희대학교 산학협력단 jkp, bfpA 타겟 유전자를 통해 장병원성 대장균 (EPEC)을 신속검출할 수 있는 Singleplex Real-Time PCR 키트의 개발
KR20200059764A (ko) 2018-11-21 2020-05-29 경희대학교 산학협력단 pCVD 타겟 유전자를 통해 장관흡착성 대장균 (EAEC)을 신속검출할 수 있는 Singleplex Real-Time PCR 키트의 개발

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