CN116219041A - 鸭肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌双重荧光pcr检测引物探针组、试剂盒及其应用 - Google Patents

鸭肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌双重荧光pcr检测引物探针组、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明具体涉及一种鸭肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌双重荧光PCR检测引物探针组、试剂盒及其应用，属于动物检疫技术领域。本发明通过对肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌全基因组序列进行比对分析，筛选出肠炎沙门氏菌lyg D基因特异性片Sdf I和鼠伤寒沙门氏菌特异性基因STM4497作为鉴别靶标，并设计特异性引物与探针。本发明设计合成的引物探针，具有快速、灵敏、特异性强、稳定性好，且不易污染。肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌双重荧光PCR检测方法的成功建立有助于增强对养鸭过程中沙门氏菌的检测力度。对于从源头控制疫病，进而制定有效的防控措施。

Description

鸭肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌双重荧光PCR检测引物探 针组、试剂盒及其应用
技术领域
本发明具体涉及一种鸭肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌双重荧光PCR检测引物探针组、试剂盒及其应用，属于动物检疫技术领域。
背景技术
鸭沙门氏菌病是肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和鸭沙门氏菌等引起的疾病的总称。各种日龄的鸭都能感染，主要发生于雏鸭，可造成大批死亡。山东省是养鸭大省，随着规模化养鸭场中，集约化不断提高，养殖密度越来越大，导致鸭群沙门氏菌感染持续上升。鸭群一旦暴发该病，可迅速传播蔓延，对养鸭业危害巨大。因此，鸭源沙门氏菌的污染情况应得到高度关注。
而肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌是养鸭场中分离率最高的血清型。不同血清型沙门氏菌的致病性、感染宿主范围和对象不同，实验室以及诊疗机构对沙门氏菌血清型的鉴定对疾病的治疗尤为重要。多重PCR方法除兼具快速与灵敏的优势外还具有通量高的优点，其基本原理是，在同一个反应体系中加入多对扩增引物，同时对多对特异基因进行扩增，它可以同时检测多对致病基因，这种检测方法的优点是可以节省检测时间，减少检测成本。但是目前，多重PCR检测过程中，多个靶点之间扩增条件不兼容，且各对引物的最佳PCR条件也不尽相同，实际操作过程中的扩增效果和实际扩增的片段数目往往不尽如人意，容易出现假阳性以及当样品中致病菌含量较低时出现的假阴性等问题，从而影响最终的检测结果。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种能够同时对鸭肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌双重荧光PCR检测引物探针组，本发明建立的多重荧光PCR检测技术，不仅继承了多重PCR的优点，还进一步提高了检测的灵敏度，能够避免因样品中的杂质较多，出现的假阳性以及当样品中致病菌含量较低时出现的假阴性问题，进一步保障了检测结果的准确。
本发明还提供了一种含有上述引物探针组的试剂盒，为快速鉴别肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌提供一种简便方法。本发明的试剂盒具有特异性强、敏感性高等优点。
本发明的另一目的为提供了一种上述试剂盒的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种鸭肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌双重荧光PCR检测引物探针组，所述引物探针序列为：
肠炎沙门氏菌上游引物 SE-F如SEQ ID NO.1所示：
5’ - TTGATGTGGTTGGTTCGTCACT - 3’；
肠炎沙门氏菌下游引物 SE-R如SEQ ID NO.2所示：
5’- CGAATGGTGAGCAGACAACAGG - 3’；
肠炎沙门氏菌探针 SE-P如SEQ ID NO.3所示：
5’ FAM - CAGCGAGCATGTTCTGGAAAGCCT - BHQ1 3’；
鼠伤寒沙门氏菌上游引物 ST-F如SEQ ID NO.4所示：
5’ – AAAGGACCACAAGTTCGC - 3’；
鼠伤寒沙门氏菌下游引物 ST-R如SEQ ID NO.5所示：
5’ – CAAATAACCCACGTTCAGT - 3’；
鼠伤寒沙门氏菌探针 ST-P如SEQ ID NO.6所示：
5’HEX- CACCTCAACATCTTTCAGATCATCGTC - BHQ1 3’。
本发明还提供了一种含有上述引物探针组的试剂盒，包括以下成分：荧光PCR反应液、Taq DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照。
进一步的，所述荧光PCR反应液由1.5体积浓度为10 μmol/L的肠炎沙门氏菌上游引物、1.5体积浓度为10 μmol/L的肠炎沙门氏菌下游引物、0.5体积浓度为10 μmol/L的肠炎沙门氏菌探针；1体积浓度为10 μmol/L鼠伤寒沙门氏菌上游引物、1体积浓度为10 μmol/L的鼠伤寒沙门氏菌下游引物、0.3体积浓度为10 μmol/L的鼠伤寒沙门氏菌探针；10体积2×缓冲液、2体积浓度为25 mmol/L的MgCl2、2体积浓度为2.5 mmol/L的dNTP和0.2体积焦碳酸二乙酯处理水组成。
进一步的，所述Taq DNA聚合酶的浓度为5 U/μL。
进一步的，所述阴性对照为高压灭菌过的焦碳酸二乙酯处理水；所述阳性对照为肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌鉴别靶标的DNA片段。
进一步的，所述阳性对照肠炎沙门氏菌的鉴别靶标为lyg D基因特异性片Sdf I；所述鼠伤寒沙门氏菌的鉴别靶标为特异性基因STM4497。
本发明还提供了一种上述试剂盒在检测鸭肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌中的应用，包括以下步骤：
（1）在反应管中加入荧光PCR反应液和Taq DNA 聚合酶，再加入待测样品核酸，同时设置阳性及阴性对照管，盖紧管帽，离心，放入荧光PCR检测仪内进行荧光PCR反应；
（2）结果读取。
进一步的，步骤（1）中，所述双重荧光定量PCR反应的具体参数为：第一阶段预变性，50 ℃/2 min；第二阶段95 ℃/3 min；第三阶段95 ℃/15 s，60℃/30 sec，共40个循环；荧光收集在第三阶段每次循环的60℃延伸时进行。
进一步的，步骤（2）中，具体为：
阴性：
两个检测通道均无Ct值，且无特征性扩增曲线，表明样品中无肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌；
阳性：
如仅FAM检测通道出现特征性扩增曲线，且Ct值≤36，而HEX/VIC检测通道无Ct值并且无扩增曲线，表示样本中存在肠炎沙门氏菌；
如仅HEX/VIC检测通道出现特征性扩增曲线，且Ct值≤36，而FAM检测通道无Ct值并且无扩增曲线，表示样本中存在鼠伤寒沙门氏菌；
双检测通道Ct值均≤36，且出现典型的扩增曲线，表示样品中同时含有肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。
本发明所使用的荧光PCR缓冲液，包括但不限于：dNTP、MgCl2等。
本发明所使用的阴性对照：焦碳酸二乙酯处理水：自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水，得Millipore-Q纯化水；然后向Millipore-Q纯化水中加入DEPC至终浓度为0.1%，37℃搅拌处理12h，15lbf/in2 (1.034×105Pa) 高压蒸汽灭菌15分钟。阳性对照的制备：以常规方法克隆肠炎沙门氏菌lyg D基因内部特异性片段Sdf Ⅰ和鼠伤寒沙门氏菌特异性基因STM4497，构建重组质粒，对质粒进行序列测定，测序结果正确后，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，将其扩大培养，提取质粒，后将酶切纯化DNA片段为阳性对照。
本发明提供一种能够同时对肠炎沙门氏菌与鼠伤寒沙门氏菌快速鉴别检测的引物探针组。本发明通过对肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌全基因组序列进行比对分析，筛选出肠炎沙门氏菌lyg D基因特异性片Sdf I和鼠伤寒沙门氏菌特异性基因STM4497作为鉴别靶标。选择肠炎沙门氏菌特异性片段lygD中的编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行肠炎沙门氏菌引物和探针设计选择；选择鼠伤寒沙门氏菌特异性基因STM4497编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行鼠伤寒沙门氏菌引物和探针设计。
引物长度为20个碱基左右，GC含量为50%—60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度（Tm值）相差小于2℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。肠炎沙门氏菌探针序列的5’端标记报告荧光基团FAM（6-carboxy-荧光素），3’端标记淬灭荧光基团BHQ 1；鼠伤寒沙门氏菌探针序列的5’端标记报告荧光基团HEX（5-hexachloro-荧光素），3’端标记淬灭基团BHQ 1。
本发明进行荧光PCR反应后进行结果的读取，对于多通道PCR仪，利用FAM（465-510）通道和HEX（VIC）（533-580）读取结果；对于ABI仪器，选择FAM和HEX通道，无荧光淬灭基团读取结果：
阴性：
两个检测通道均无Ct值，且无特征性扩增曲线，表明样品中无肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌；
阳性：
如仅FAM检测通道出现特征性扩增曲线，且Ct值≤36，而HEX/VIC检测通道无Ct值并且无扩增曲线，表示样本中存在肠炎沙门氏菌；
如仅HEX/VIC检测通道出现特征性扩增曲线，且Ct值≤36，而FAM检测通道无Ct值并且无扩增曲线，表示样本中存在鼠伤寒沙门氏菌；
双检测通道Ct值均≤36，且出现典型的扩增曲线，表示样品中同时含有肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。
本发明提供的检测方法，阴性对照用两个检测通道读取数据时，应均无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照用两个检测通道读取数据时，应分别出现相应的特征性扩增曲线，且Ct值均应≤32；如阴性或阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。任一通道Ct值＞36，且出现典型的扩增曲线的样品建议复检。复检仍出现上述结果的，判为阳性，否则，判为阴性。
本发明通过实验证明，本发明提供的检测试剂盒及检测方法，可以一步法确认待检样品中是否存在肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。
本发明选择肠炎沙门氏菌lyg D基因内部特异性片段Sdf Ⅰ和鼠伤寒沙门氏菌特异性基因STM4497作为靶序列，分别设计引物和探针建立并优化了一种肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌双重荧光PCR检测试剂盒，取得了优异的技术效果：
1）快速：该方法对PCR产物进行实时监控，PCR结束即可获得结果，且较单重荧光PCR检测方法省时，具有快速、一步即可鉴别的优势。
2）灵敏：由于采用了特异性的荧光探针和高灵敏度的荧光PCR仪，使该方法比传统的PCR方法灵敏度高100～1000倍；对已知拷贝数的质粒DNA进行检测。结果显示，试剂盒的灵敏度可达10拷贝/反应。
3）特异：由于不仅采用了特异性的引物，而且采用了特异性的探针，使该方法的特异性高于普通PCR方法；与大肠杆菌、葡萄球菌、志贺氏菌、单增李斯特氏菌、副溶血性弧菌等，均无交叉反应，表明特异性良好。
4）稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好；对不同浓度的已知拷贝数的质粒DNA进行重复性试验，变异系数小于5%。
5）不易污染：全封闭反应，无需PCR后处理，操作安全。
6）肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌双重荧光PCR检测方法的成功建立有助于增强对养鸭过程中沙门氏菌的检测力度。对于从源头控制疫病，进而制定有效的防控措施；切实推动沙门氏菌病的净化，促进区域产业健康可持续发展、助力乡村振兴等，起到了很好的技术指导作用。
附图说明
图1为本发明实施例中（鸭肠炎沙门氏菌/鼠伤寒沙门氏菌双重荧光PCR检测试剂盒）灵敏度试验结果图-鼠伤寒沙门氏菌。
图2为本发明实施例中（鸭肠炎沙门氏菌/鼠伤寒沙门氏菌双重荧光PCR检测试剂盒）灵敏度试验结果图-肠炎沙门氏菌。
图3为本发明实施例中（鸭肠炎沙门氏菌/鼠伤寒沙门氏菌双重荧光PCR检测试剂盒）特异性试验结果图-鼠伤寒沙门氏菌。
图4为本发明实施例中（鸭肠炎沙门氏菌/鼠伤寒沙门氏菌双重荧光PCR检测试剂盒）特异性试验结果图-肠炎沙门氏菌。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进行进一步的解释和说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
试剂盒验证方法：
（1）用DEPC处理水对肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌阳性质控品（拷贝数为0.2x105copies/uL）提取核酸后作1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000稀释，作为灵敏度质控样品。按照6-7中方法对肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌灵敏度质控样品（拷贝数依次为104、103、102、101、100copies/反应）进行检测，验证本试剂盒的灵敏度应达到101copies/反应。
（2）检测大肠杆菌、葡萄球菌、志贺氏菌、单增李斯特氏菌、副溶血性弧菌，验证本试剂盒的特异性，均无阳性交叉反应。
实施例1 引物、探针的设计
1. 引物、探针设计
1.1 引物、探针设计原则
为确保引物、探针的保守性和特异性，选取肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌特异性基因（片段）的编码区特定序列作为靶区域。
本领域大多数的引物设计都是软件直接合成，选取最优引物序列，本发明涉及到的引物序列是在软件设计的基础上人工设计的结果；实施例中涉及到的引物探针序列可以保证不漏检，并且可以同时对肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌进行快速鉴别检测。
1.2引物、探针设计
从NCBI上下载鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、禽伤寒沙门氏菌全基因序列进行比对，找出鼠伤寒沙门氏菌特异性基因STM4497、肠炎沙门氏菌lyg D基因编码区特定序列Sdf I，下载26条鼠伤寒沙门氏菌特异性基因STM4497编码区特定序列，26条肠炎沙门氏菌lyg D基因编码区特定序列，利用Prime 5.0引物设计软件分别进行引物探针设计，在进行初步的筛选后，进行人工设计，在多重序列比对的基础上，设计特异性引物探针，用于引物探针设计的部分鼠伤寒沙门氏菌参比菌株及用于引物探针设计的部分肠炎沙门氏菌参比菌株，具体如表1及表2所示。
表1 用于引物探针设计的部分鼠伤寒沙门氏菌参比菌株
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表2 用于引物探针设计的部分肠炎沙门氏菌参比菌株
Figure DEST_PATH_IMAGE003
1.3引物探针设计特色
引物长度为20个碱基左右，GC含量为50%—60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度（Tm值）相差小于2℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。用于筛选比较的其他引物、探针的名称、序列来源见表3。
表3 用于筛选比较的引物、探针的名称及序列
Figure 486065DEST_PATH_IMAGE004
人工设计的引物探针组肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的引物TM值接近，可以在同时检测的这两种菌时达到反应参数一致，灵敏度相近，且经BLAST，未发现碱基不匹配的情况，而仅靠软件设计的肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌引物，做双重检测，最佳反应参数不一致。经BLAST，有碱基错配现象，且探针TM值与引物TM值差距较小，无法达到理想的效果，故最终确定引物探针的核苷酸序列如下：
表4 引物探针的核苷酸序列
肠炎沙门氏菌上游引物 SE-F（如SEQ ID NO.1所示）： 5’ - TTGATGTGGTTGGTTCGTCACT - 3’
肠炎沙门氏菌下游引物 SE-R如（SEQ ID NO.2所示）： 5’ – CGAATGGTGAGCAGACAACAGG - 3’
肠炎沙门氏菌探针 SE-P 如（SEQ ID NO.3所示）： 5’ FAM - CAGCGAGCATGTTCTGGAAAGCCT - BHQ1 3’
鼠伤寒沙门氏菌上游引物 ST-F如（SEQ ID NO.4所示）： 5’ – AAAGGACCACAAGTTCGC - 3’
鼠伤寒沙门氏菌下游引物 ST-R如（SEQ ID NO.5所示）： 5’ – CAAATAACCCACGTTCAGT - 3’
鼠伤寒沙门氏菌探针 ST-P 如（SEQ ID NO.6所示）： 5’ HEX - CACCTCAACATCTTTCAGATCATCGTC - BHQ1 3’
实施例2 肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌双重荧光PCR反应体系的建立
在多重序列比对的基础上，设计能同时快速鉴别检测肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的引物探针组，初步建立荧光PCR检测方法，并应用Taguchi方法进行优化，找出引物、探针、Mg2+浓度的最佳范围，根据最佳范围进行相应的调整，最终获得引物、探针、Mg2+的具体浓度，从而确定该检测方法的最适条件：反应体系共25 μL，包括荧光PCR反应液、酶混合物、模板三部分。其中，荧光PCR反应液由1.5体积浓度为10 μmol/L的肠炎沙门氏菌上游引物、1.5体积浓度为10 μmol/L的肠炎沙门氏菌下游引物、0.5体积浓度为10 μmol/L的肠炎沙门氏菌探针；1体积浓度为10 μmol/L鼠伤寒沙门氏菌上游引物、1体积浓度为10 μmol/L的鼠伤寒沙门氏菌下游引物、0.3体积浓度为10 μmol/L的鼠伤寒沙门氏菌探针； 10体积2×缓冲液、2体积浓度为25 mmol/L的MgCl2、2体积浓度为2.5 mmol/L的dNTP和0.2体积焦碳酸二乙酯处理水组成。
最终确定该检测方法的扩增条件是：第一阶段预变性，50 ℃/2 min；第二阶段95℃/3 min；第三阶段95 ℃/15 s，60℃/30 sec，共40个循环；荧光收集在第三阶段每次循环的60℃延伸时进行。
荧光PCR反应完成后，若双检测通道均无Ct值，且无特征性扩增曲线，表明样品中无肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌；若双检测通道Ct值均≤32.0，且均出现典型的扩增曲线，表明样品中有肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌；如仅FAM检测通道出现特征性扩增曲线，且Ct值≤36，而HEX/VIC检测通道无Ct值并且无扩增曲线，表示样本中存在肠炎沙门氏菌；如仅HEX/VIC检测通道出现特征性扩增曲线，且Ct值≤36，而FAM检测通道无Ct值并且无扩增曲线，表示样本中存在鼠伤寒沙门氏菌；双检测通道Ct值均≤36，且出现典型的扩增曲线，表示样品中同时含有肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。
本发明提供的检测方法，阴性对照用两个检测通道读取数据时，应均无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照用两个检测通道读取数据时，应分别出现相应的特征性扩增曲线，且Ct值均应≤32；如阴性或阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。任一通道Ct值＞36，且出现典型的扩增曲线的样品建议复检。复检仍出现上述结果的，判为阳性，否则，判为阴性。
实施例3 鸭肠炎沙门氏菌/鼠伤寒沙门氏菌双重荧光PCR检测试剂盒的组装
表5 试剂盒组成清单
Figure DEST_PATH_IMAGE005
实施例4 鸭肠炎沙门氏菌/鼠伤寒沙门氏菌双重荧光PCR检测试剂盒的敏感性试验
用DEPC处理水对肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌阳性质控品（拷贝数为0.2x105copies/uL）提取核酸后作1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000稀释，作为灵敏度质控样品。进检测和判定1:10、1:100、1:1000稀释质控品的检测结果均为阳性，1:10000为阳性，1:100000为阴性，表明试剂盒的检测极限可以达到1:10000，即101copies/反应，见图1、2。
实施实例5 鸭肠炎沙门氏菌/鼠伤寒沙门氏菌双重荧光PCR检测试剂盒的特异性试验
检测大肠杆菌、葡萄球菌、志贺氏菌、单增李斯特氏菌、副溶血性弧菌，验证本试剂盒的特异性，均无阳性交叉反应，见图3、4。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种鸭肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌双重荧光PCR检测引物探针组，其特征在于，所述引物探针序列为：
肠炎沙门氏菌上游引物 SE-F如SEQ ID NO.1所示：
5’- TTGATGTGGTTGGTTCGTCACT - 3’；
肠炎沙门氏菌下游引物 SE-R如SEQ ID NO.2所示：
5’- CGAATGGTGAGCAGACAACAGG - 3’；
肠炎沙门氏菌探针 SE-P如SEQ ID NO.3所示：
5’FAM - CAGCGAGCATGTTCTGGAAAGCCT - BHQ1 3’；
鼠伤寒沙门氏菌上游引物 ST-F如SEQ ID NO.4所示：
5’– AAAGGACCACAAGTTCGC - 3’；
鼠伤寒沙门氏菌下游引物 ST-R如SEQ ID NO.5所示：
5’– CAAATAACCCACGTTCAGT - 3’；
鼠伤寒沙门氏菌探针 ST-P如SEQ ID NO.6所示：
5’HEX- CACCTCAACATCTTTCAGATCATCGTC - BHQ1 3’。
2.一种含有权利要求1所述的引物探针组的试剂盒，其特征在于，包括以下成分：荧光PCR反应液、Taq DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光PCR反应液由1.5体积浓度为10μmol/L的肠炎沙门氏菌上游引物、1.5体积浓度为10 μmol/L的肠炎沙门氏菌下游引物、0.5体积浓度为10 μmol/L的肠炎沙门氏菌探针；1体积浓度为10 μmol/L鼠伤寒沙门氏菌上游引物、1体积浓度为10 μmol/L的鼠伤寒沙门氏菌下游引物、0.3体积浓度为10 μmol/L的鼠伤寒沙门氏菌探针；10体积2×缓冲液、2体积浓度为25 mmol/L的MgCl2、2体积浓度为2.5mmol/L的dNTP和0.2体积焦碳酸二乙酯处理水组成。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶的浓度为5 U/μL。
5.根据权利要求2-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为高压灭菌过的焦碳酸二乙酯处理水；所述阳性对照为肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌鉴别靶标的DNA片段。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照肠炎沙门氏菌的鉴别靶标为lyg D基因特异性片Sdf I；所述鼠伤寒沙门氏菌的鉴别靶标为特异性基因STM4497。
7.一种如权利要求2-6任一项所述的试剂盒在检测鸭肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在反应管中加入荧光PCR反应液和Taq DNA 聚合酶，再加入待测样品核酸，同时设置阳性及阴性对照管，盖紧管帽，离心，放入荧光PCR检测仪内进行荧光PCR反应；
（2）结果读取。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，所述双重荧光定量PCR反应的具体参数为：第一阶段预变性，50 ℃/2 min；第二阶段95 ℃/3 min；第三阶段95 ℃/15 s，60℃/30 sec，共40个循环；荧光收集在第三阶段每次循环的60℃延伸时进行。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，具体为：
阴性：
两个检测通道均无Ct值，且无特征性扩增曲线，表明样品中无肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌；
阳性：
如仅FAM检测通道出现特征性扩增曲线，且Ct值≤36，而HEX/VIC检测通道无Ct值并且无扩增曲线，表示样本中存在肠炎沙门氏菌；
如仅HEX/VIC检测通道出现特征性扩增曲线，且Ct值≤36，而FAM检测通道无Ct值并且无扩增曲线，表示样本中存在鼠伤寒沙门氏菌；
双检测通道Ct值均≤36，且出现典型的扩增曲线，表示样品中同时含有肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。
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