CN114164286A

CN114164286A - 一种检测沙门氏菌的多重液滴数字pcr试剂盒及其方法和应用

Info

Publication number: CN114164286A
Application number: CN202111505493.0A
Authority: CN
Inventors: 史贤明; 方正伟; 周秀娟; 詹泽强; 崔妍
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2021-12-10
Filing date: 2021-12-10
Publication date: 2022-03-11

Abstract

本发明公开了一种检测沙门氏菌的多重液滴数字PCR试剂盒及其方法和应用，涉及微生物检测技术领域，试剂盒包含液滴数字PCR反应液和质控品，液滴数字PCR反应液中含有用于检测肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌核酸的引物和探针，探针的两端标记有荧光基团。本发明的试剂盒及检测方法有效的提高了检测的灵敏度，抗干扰性强，减少了检测的假阴性率，且与大肠杆菌、阪崎肠杆菌等均无交叉反应，检测特异性高，减少了检测的假阳性率。

Description

一种检测沙门氏菌的多重液滴数字PCR试剂盒及其方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种沙门氏菌的多重液滴数字PCR检测方法及应用。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)是一种不产芽孢、无荚膜、兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，是肠杆菌科细菌中最重要的一个属，并且多数细菌有周身鞭毛和菌毛，从而表现出较强的运动性。沙门氏菌所需的营养要求较低，能在简单的培养基上生长。沙门氏菌广泛分布于自然界中，可以在人类、动物和环境三者之间进行传播，人类和动物是它们的主要宿主。沙门氏菌会通过受污染的禽类、乳制品、屠宰胴体和被粪便污染的蔬菜等进入食品供应链，人类一旦摄入这些受污染而又未经彻底加工的食物，就有可能感染沙门氏菌病，感染细菌将在人体内迅速繁殖，产生大量毒素，导致食物中毒。

部分血清型可以引起食源性疾病，其中肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌是引起食物中毒最常见的血清型。但是，不同国家地区存在不同的优势血清型：在我国，导致食物中毒最为常见的血清型是肠炎沙门氏菌，而在美国等西方国家，肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌则是最重要的两种血清型。

在微生物学中，传统的鉴定方法主要依靠培养过程，利用各种培养基来计数、分离和鉴定特定的微生物，通过不同的血清凝集反应区分抗原以鉴定不同的血清型。这种鉴定方法费时费力，不足以在日常监控、沙门氏菌暴发和产品溯源召回等方面做出快速反应。鉴于这些因素，开发沙门氏菌快速检测方法成为保障食品安全的迫切需要。

由于PCR具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点，其已被广泛应用于微生物检测。传统PCR技术是将目的基因经过PCR扩增循环，复制出成千上万个子代DNA，然后通过凝胶电泳进行检测。它是一个基于终点的检测，只能对扩增结果进行定性或半定量的分析。实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行一个定量分析的方法。

数字PCR(Digital PCR，dPCR)是在传统PCR、实时荧光定量PCR基础上发展起来的第三代PCR技术。其原理是将含有核酸模板的标准PCR反应体系，平均分配成上万个和数百万个PCR反应，分配到芯片或微滴中，使每个反应中尽可能含有一个模板分子，进行单分子模板PCR反应，通过读取荧光信号的有或无进行计数，经过统计学泊松分布的校准进行绝对定量。数字PCR具备如下特点：①无需制作标准曲线，根据荧光信号的有无进行绝对定量；②结果受扩增效率的影响很低，能够有效避免反应体系中抑制剂的影响；③反应体系液滴的分配过程，降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度。

基于此，数字PCR具备了灵敏度高、特异性好和精确性高的优点，它在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测、表达量微小差异鉴定和拷贝数变异检测等方面表现出的优势已被普遍认可。

发明内容

本发明的提供了一种用于定量检测沙门氏菌核酸的多重液滴数字PCR试剂盒及其方法。

本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种检测沙门氏菌的多重液滴数字PCR试剂盒，本试剂盒包含液滴数字PCR反应液和质控品，液滴数字PCR反应液中含有用于检测沙门氏菌核酸的引物和探针，探针的两端标记有荧光基团，引物和探针序列包括：

1)针对沙门氏菌STY1855核酸序列设计的正向引物序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物序列如SEQ ID NO:2所示，所述探针序列如SEQ ID NO:7所示；

2)针对鼠伤寒沙门氏菌STM4495核酸序列设计的正向引物，序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物序列如SEQ ID NO:4所示，所述探针序列如SEQ ID NO:8所示；

3)针对肠炎沙门氏菌SEN1392核酸序列设计的正向引物，序列如SEQ ID NO:5所示，反向引物序列如SEQ ID NO:6所示，所述探针序列如SEQ ID NO:9所示。

作为进一步技术方案，探针序列的5’端标记有荧光报告基团，3’标记有荧光淬灭基团，所述荧光报告基团光谱范围不同。

优选地，

所述SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’标记有Eclipse；

所述SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的5’端标记有HEX，3’标记有BHQ1；

所述SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的5’端标记有Cy5，3’标记有BHQ2。

优选地，所述液滴数字PCR反应液中包括5×PerfeCTa MultiPlex qPCRToughMix、1μM Fluorescein sodium salt、所述6种25μM正反向引物、所述3种25μM探针。

优选地，质控品包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为无菌水，阳性质控品为沙门氏菌ATCC 13076和ATCC 14028DNA溶液。

另一方面，本发明提供一种利用所述多重液滴数字PCR试剂盒检测沙门氏菌的方法，该方法包括以下步骤：

步骤1、处理样品：提取样品DNA，得到样品处理液；

步骤2、配制液滴数字PCR反应体系：将所述液滴数字PCR反应液与所述样品处理液混合，得到液滴数字PCR反应混合液；

步骤3、液滴PCR扩增反应：将所述液滴数字PCR反应混合液加入数字PCR芯片中，置于液滴生成和扩增系统中生成液滴，然后进行PCR扩增反应；

步骤4、读取荧光信号：将扩增后的数字PCR芯片置于荧光读取仪中，利用软件进行结果读取和分析。

优选地，所述步骤2中液滴数字PCR反应液与所述样品处理液混合的体积比为11.5：1。样品抽提总DNA的最佳实验用量为10^-2-10^-3ng/μL。优选地，所述步骤2中液滴数字PCR反应混合液总体积为25μL，包括5×PerfeCTa MultiPlex qPCR ToughMix5μL、1μMFluorescein sodium salt 2.5μL、6种25μM上下游引物各1μL、3种25μM探针各0.25μL、样品DNA 2μL和无菌水8.75μL。

优选地，所述步骤3中PCR扩增反应的条件为：95℃预变性10min；95℃30s、60℃30s，共进行45个循环。

第三方面，本发明提供了所述的多重液滴数字PCR试剂盒检测沙门氏菌方法在沙门氏菌及其两种重要血清型检测中的应用。

本发明的技术优点在于，液滴数字PCR可以对样品进行绝对定量，直接检测出样品中的拷贝数，相对于荧光定量PCR，不需要建立标准曲线，灵敏度更高；液滴数字PCR通过分液增加了扩增效率，提高了PCR反应对抑制剂的耐受程度，特别是环境、食品样本，此外，本发明采用三对引物和探针对不同血清型的沙门氏菌进行检测，有效的提高了检测的灵敏度，抗干扰性强，减少了检测的假阴性率，且与大肠杆菌、阪崎肠杆菌等均无交叉反应，检测特异性高，减少了检测的假阳性率。

附图说明

图1是本发明的特异性实验散点图；

图2是本发明的灵敏度实验散点图。

具体实施方式

以下参考说明书附图对本发明的实施方案进行详细描述，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如相关说明书或者实验室正规教材或手册进行实施。

一、主要菌株

实施例用到的菌株有：肠炎沙门氏菌标准菌株(ATCC 13076)、鼠伤寒沙门氏菌标准菌株(ATCC 14028)、大肠杆菌O157(ATCC 43889)、阪崎肠杆菌(ATCC 25914)。

二、所使用的主要检测仪器

Naica全自动微滴芯片式数字PCR系统(法国Stilla technologies)。

三、检测用主要试剂及耗材

TIANGEN DNA提取试剂盒、5×PerfeCTa MultiPlex qPCR ToughMix、Fluoresceinsodium salt(1μM)(APEXBIO)、引物探针由宝生物工程(大连)有限公司合成、数字PCR芯片(Sapphire chip)等。

实施例1：基于多重液滴数字PCR技术检测沙门氏菌试剂盒及其方法

包括以下主要步骤：

1、细菌模板DNA的提取

使用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒并按说明提取鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、肠炎沙门氏菌ATCC 13076、大肠杆菌O157 ATCC 43889、阪崎肠杆菌ATCC25914的模板DNA。如不能及时检验，提取的DNA可于-20℃保存。

2、体系配制

多重液滴数字PCR扩增体系：Naica全自动微滴芯片式数字PCR系统反应体系总体积为25μL，包括5×PerfeCTa MultiPlex qPCR ToughMix 5μL、Fluorescein sodium salt(1μM)2.5μL、6种正反向引物(25μM)各1μL、3种探针(25μM)各0.25μL、模板DNA 2μL和无菌水8.75μL。具体的，引物和探针的序列如表1所示：

表1引物、探针核苷酸序列

3、液滴生成和PCR扩增

将数字PCR芯片(Sapphire chip)平稳地放于实验台上，切勿震动，轻轻旋转白盖1/4圈，丢弃白盖，移取25μL液滴数字PCR反应液加载于数字PCR芯片(Sapphire chip)的孔井中，加样过程中尽量避免产生气泡，静置2-3min后盖上白色长盖。

打开Naica Geode微滴生成扩增系统(Naica全自动微滴芯片式数字PCR系统)和气压泵(Naica全自动微滴芯片式数字PCR系统)开关，确认气压泵输出压力和微滴生成扩增系统输入压力稳定在1150±50mbar。

轻轻地将数字PCR芯片(Sapphire chip)放置于加热模块上，盖上Naica Geode机器盖，设置PCR反应程序。

反应参数为：Partition 40℃；95℃10min；95℃30s、60℃30s，共进行45个循环；Release P。点击“start”按钮，开始生成液滴和PCR反应程序。

4、液滴荧光信号的读取

将数字PCR芯片(Sapphire chip)取出，置于Naica Prism微滴读取分析系统(Naica全自动微滴芯片式数字PCR系统)进行液滴的读取计数，分析液滴图确定荧光阈值从而计算阳性与阴性的液滴数。

实施例2：基于多重液滴数字PCR技术检测沙门氏菌试剂盒及其方法的特异性评价

用本发明的试剂盒分别对肠炎沙门氏菌标准菌株(ATCC 13076)、鼠伤寒沙门氏菌标准菌株(ATCC 14028)、大肠杆菌O157(ATCC43889)、阪崎肠杆菌(ATCC 25914)、无菌水进行液滴数字PCR检测，验证该方法的特异性。

如图1所示，实验结果显示每个样品生成的液滴数量大于20000，符合泊松分布计算的需要。无菌水作为空白对照没有观察到阳性扩增，说明体系没有受到污染，肠炎沙门氏菌ATCC 13076可以看到FAM通道(S95)和Cy5通道(SEN1392)的扩增，鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028可以看到FAM通道(S95)和HEX通道(STM4495)的扩增，大肠杆菌O157 ATCC43889、阪崎肠杆菌ATCC25914没有显示任何通道的扩增。

上述结果表明该多重液滴数字PCR体系的引物及探针特异性良好，可以用于后续的实验。

本方案建立的多重液滴数字PCR方法仅能够特异性扩增沙门氏菌，同时能够分辨肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。

实施例3：基于多重液滴数字PCR技术检测沙门氏菌试剂盒及其方法的灵敏度评价

将肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的DNA模板按照1：1的比例混合制成50ng/μL的DNA混合模板。

将混合模板进行十倍浓度梯度稀释，稀释成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8共7个梯度，无菌水作为阴性对照，并用本发明的试剂盒进行多重液滴数字PCR检测，详细步骤同上实施例1。

其扩增结果如图2所示，使用本发明的试剂盒进行多重液滴数字PCR灵敏度实验，可以观察到三个通道都有阳性液滴产生，同时阳性液滴和阴性液滴荧光值分别聚集在一起并且界限清晰，液滴生成数量达到实验要求。

随着模板DNA浓度的降低，阳性液滴数减少，当模板浓度低至10^-8时仍然可以观察到阳性液滴，说明该多重液滴数字PCR方法基因组DNA的灵敏度可以达到5fg/μL。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种检测沙门氏菌的多重数字PCR试剂盒及其方法和应用

<130> 01335-21235PIX

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcaataatcg cagtatccag taatg 25

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaagagattt tagcgcagtg tag 23

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccgaacaga cgccagaa 18

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tactttgatg ctttccggtt ca 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgaccggga aaaatgttct g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgcctcccga aaacacatat t 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcatcatcgc ctgcggacaa ccaca 25

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tggccgccat tacacctgcc agta 24

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgatggtcac agacacatac cgggc 25

Claims

1.一种检测沙门氏菌的多重液滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含液滴数字PCR反应液和质控品，所述液滴数字PCR反应液中含有用于检测沙门氏菌核酸的引物和探针，探针的两端标记有荧光基团，引物和探针序列包括：

2.如权利要求1所述的检测沙门氏菌的多重液滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述探针序列的5’端标记有荧光报告基团，3’标记有荧光淬灭基团，所述荧光报告基团光谱范围不同。

3.如权利要求1所述的检测沙门氏菌的多重液滴数字PCR试剂盒，其特征在于，

SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’标记有Eclipse；

SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的5’端标记有HEX，3’标记有BHQ1；

SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的5’端标记有Cy5，3’标记有BHQ2。

4.根据权利要求1～3任一项所述的检测沙门氏菌的多重液滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述液滴数字PCR反应液中包括5×PerfeCTa MultiPlex qPCR ToughMix、1μMFluorescein sodium salt、所述6种25μM正反向引物、所述3种25μM探针。

5.根据权利要求1所述的检测沙门氏菌的多重液滴数字PCR试剂盒，其特征在于，质控品包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为无菌水，阳性质控品为沙门氏菌ATCC13076和ATCC 14028 DNA溶液。

6.一种利用权利要求1～5任一项所述多重液滴数字PCR试剂盒检测沙门氏菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1、处理样品：提取样品DNA，得到样品处理液；

7.如权利要求6所述的多重液滴数字PCR试剂盒检测沙门氏菌方法，其特征在于，所述步骤2中液滴数字PCR反应液与所述样品处理液混合的体积比为11.5：1，样品抽提总DNA的最佳实验用量为10^-2-10^-3ng/μL。

8.如权利要求6所述的多重液滴数字PCR试剂盒检测沙门氏菌方法，其特征在于，所述步骤2中液滴数字PCR反应混合液总体积为25μL，包括5×PerfeCTa MultiPlex qPCRToughMix 5μL、1μM Fluorescein sodium salt 2.5μL、6种25μM上下游引物各1μL、3种25μM探针各0.25μL、样品DNA 2μL和无菌水8.75μL。

9.如权利要求6所述的多重液滴数字PCR试剂盒检测沙门氏菌方法，其特征在于，所述步骤3中PCR扩增反应的条件为：95℃预变性10min；95℃30s、60℃30s，共进行45个循环。

10.权利要求1～9任一项所述的多重液滴数字PCR试剂盒检测沙门氏菌方法在沙门氏菌及其两种重要血清型检测中的应用。