KR20210143580A - 살모넬라 검출용 멀티플렉스 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

살모넬라 검출용 멀티플렉스 프라이머 및 이의 용도 Download PDF

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KR20210143580A
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Abstract

본 발명은 살모넬라 다중 검출용 조성물, 키트, 이를 이용한 검출방법 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

살모넬라 검출용 멀티플렉스 프라이머 및 이의 용도{MULTIPLEX PRIMER FOR DETECTION OF SALMONELLA AND USES THEREOF}
본 발명은 살모넬라 다중 검출용 조성물, 키트, 이를 이용한 검출방법 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.
식중독은 병원성 세균, 독소, 바이러스, 기생충, 화학물질, 자연독 등에 오염된 음식물을 섬취함으로써 나타나는 증상을 말하며, 주요 증상은 원인에 따라 복통, 구역질, 구토, 설사, 발열, 두통, 피로감, 두드러기 등을 포함한다. 미생물에 의한 식중독은 세균성 식중독과 바이러스성 식중독으로, 세균성 식중독은 독소형과 감염형으로 구분한다. 독소형 식중독의 원인균은 황색포도상구균, 바실루스 세레우스균, 클로스트리디움균 등이고, 감염형 식중독의 원인균은 병원성 대장균, 장염 비브리오균, 살모넬라균, 시겔라균 등이 있다.
살모넬라(Salmonella spp.) 균은 제1군 법정 전염병에 속하는 장티푸스와 파라티푸스의 원인균으로 식중독을 유발하는 대표적인 병원성 미생물이다. 살모넬라는 그람음성, 무아포성, 통성혐기성 간균으로 2,800여종 이상의 혈청형으로 분류되지만 이들 중 식중독을 유발하는 대표적 균종은 살모넬라 엔테리카(Salmonella. Enterica)이며, 질병 발생의 약 50%를 차지한다. 특히, 살모넬라 엔테리카 아종. 엔테리카 I(Salmonella. enterica subsp. enterica I)은 모든 인간 살모넬라 감염의 99%를 차지한다.
식품의약품안전처 식중독 통계시스템의 원인균별 식중독 발생현황(2002~2014년) 자료를 보면, 살모넬라에 의한 식중독 발생환자수가 총 9,488명으로 2011년에는 1,065명, 2013년에는 690명, 2014년에는 1,416명 등으로 증가 추세이다.
이에, 신속하면서도 속(genus), 아종(subspecies) 및 혈청형(sereover) 수준까지 식별할 수 있는 정확도가 높은 살모넬라 균 검출 방법의 개발이 필요한 실정이다.
한국등록특허 제10-1496835호
본 발명의 목적은 살모넬라(Salmonella spp.)균 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 포함하는 살모넬라균 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 포함하는 살모넬라균 검출용 바이오 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 이용해 대상 시료내 존재하는 살모넬라균을 식별할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 이용해 살모넬라 균을 포함하는 시료의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면은 서열번호 1 내지 5의 염기서열을 포함하는 제 1 프라이머 쌍; 서열번호 6 내지 10의 염기서열을 포함하는 제 2프라이머 쌍; 서열번호 11 내지 15의 염기서열을 포함하는 제3프라이머 쌍; 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍으로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는, 살모넬라(Salmonella spp.)균 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 “프라이머 쌍”은 일반적으로 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머를 합쳐 동시에 지칭하는 용어이며, 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)에 사용되는 프라이머 쌍은 2 개의 외부 프라이머 (정방향 외부 프라이머 및 역방향 외부 프라이머), 2 개의 내부 프라이머 (정방향 내부 프라이머 및 역방향 내부 프라이머) 및 1 개 또는 2개의 루프 프라이머 (정방향 루프 프라이머 및/또는 역방향 루프 프라이머)를 동시에 지칭하는 용어이다. 상기 “프라이머 세트”는 상기 제 1 프라이머 쌍 내지 제 3 프라이머 쌍 중에서 선택된 하나 이상으로 구성된 다수의 프라이머 쌍 묶음을 지칭하는 용어로 사용하였다.
프라이머 쌍의 설계는 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 프라이머 결합 온도 등 여러 가지 제약이 따른다. 그 외에 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
상기 프라이머(primer)는 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 포함하는 짧은 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다.
상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있으며, 표적 물질에 존재하는 핵산과 혼성화 되어 상기 표적 물질의 특정 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다.
상기 프라이머는 증폭의 효율을 고려하여 구체적으로는 단일쇄일 수 있으며, 디옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotide)일 수 있고, 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
상기 혼성화는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다.
상기 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하는 경우에도 일어날 수 있다. 상기 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 제어될 수 있다. 일반적으로, 상기 혼성화 온도가 높으면 완전한 매치일 경우 혼성화가 일어날 가능성이 높으며, 혼성화 온도가 낮으면 일부 미스매치가 존재하더라도 혼성화가 일어날 수 있다.
상기 프라이머 세트는 표적 원료에 존재하는 특정 유전자에 혼성화될 수 있으며, 시료 내에 목적하는 원료가 존재하는 경우 중합효소 연쇄반응에 의해 상기 특징적인 유전자의 염기서열이 중폭 되므로 상기 증폭된 산물(amplicon)을 통해 상기 원료의 존부를 판단할 수 있다.
상기 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한 상기 프라이머 서열은 검출 가능한 신호를 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
상기 프라이머들은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
구체적으로, 상기 프라이머 쌍은 살모넬라 검출을 위한 등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 분석용 프라이머 쌍인 것일 수 있다.
본 발명에서 “등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)”은 변성(denaturation), 접합(annealing), 신장(extension) 세 가지 단계의 온도 변화를 주어야 하는 기존의 PCR과 달리, 일정한 온도에서 변성, 접합 및 신장이 가능한 방법이다. 예컨대 등온증폭에서는 Bst. DNA 중합효소를 사용하며, 이 Bst. DNA 중합효소는 일반 PCR의 Taq. DNA 중합효소와는 달리 헬리카제(helicase)의 성격을 가지고 있어 DNA의 이중나선 구조를 열에 의한 변성을 거치지 않고 Tm 값에 가까운 접합 온도에서 변성, 접합 및 신장이 수행될 수 있도록 한다. 등온증폭법은 DNA 중합효소 및 표적 핵산의 여러 부위에서 특이적으로 고안된 최소 4개의 프라이머 세트를 표준 방법으로 하여, 5 개, 6 개의 프라이머 세트를 이용한 방법을 모두 포함한다.
상기 LAMP 분석용 프라이머 쌍은 하기 종류의 프라이머를 포함한다: FIP (forward inner primer), BIP (backward inner primer), F3 (forward outer primer) 및 B3 (backward outer primer)로 이루어진 4종류의 프라이머; 및 신속한 반응(Accelerated LAMP)을 위한 LF (Loop F) 및/또는 LB (Loop B).
상기 LAMP방식은 기존의 2 내지 3개의 영역만을 표적화할 수 있던 PCR과 달리, 6 내지 8개의 특정 영역을 증폭시킬 수 있으며, 기존 PCR 보다 신속하고, 특이성 및 검출 민감도가 우수하다.
본 발명에서는 단일 반응에서 여러 표적을 검출할 수 있는 멀티플렉스(multiplex) PCR 기술을 LAMP방식에 결합하여, 살모넬라균의 속, 아종 및 혈청형까지 동시에 검출이 가능한 조성물을 고안하였다.
본 발명에서 “멀티플렉스(multiplex)LAMP”은 복수의 프라이머 쌍을 동시에 사용하여, 복수의 표적 유전자를 같은 반응액 중에서 증폭하는 방법을 지칭하는 것으로, 본 발명에서는 한 번의 LAMP 반응으로 대상 시료내 존재하는 살모넬라균의 속, 아종 및 혈청을 동시에 검출할 수 있는 방법을 제공한다. 상기 멀티플렉스 LAMP는 다양한 시료를 한 번의 증폭 반응으로 확인할 수 있으므로 경제적이고, 시간이 절약될 수 있다.
구체적으로, 상기 검출용 조성물은 살모넬라균의 속(genus), 아종(subspecies) 및 혈청형(serovar)을 동시에 검출할 수 있는 복수의 LAMP분석용 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
일 실시예에서 상기 검출용 조성물은 살모넬라 속을 타겟으로 하는 제1프라이머 쌍; 살모넬라 아종 I 을 타겟으로 하는 제2프라이머 쌍; 또는 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움을 타겟으로 하는 제3프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 검출용 조성물은 살모넬라 속을 타겟으로 하는 제1프라이머 쌍; 살모넬라 아종 I 을 타겟으로 하는 제2프라이머 쌍; 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움을 타겟으로 하는 제3프라이머 쌍 중 어느 둘 이상의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 검출용 조성물은 살모넬라 속을 타겟으로 하는 제1프라이머 쌍; 살모넬라 아종 I 을 타겟으로 하는 제2프라이머 쌍; 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움을 타겟으로 하는 제3프라이머 쌍을 모두 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 검출용 조성물은 살모넬라 속(Salmonella genus)을 타겟으로 하는 서열번호 1 내지 5의 염기서열을 포함하는 제1프라이머 쌍; 살모넬라 아종 I(Salmonella subspecies I)을 타겟으로 하는 서열번호 6 내지 10의 염기서열을 포함하는 제2프라이머 쌍; 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움(Salmonella enterica serovar Typhimurium)을 타겟으로 하는 서열번호 11 내지 15의 염기서열을 포함하는 제3프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 것으로 구성될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 각 프라이머 쌍들을 각각 또는 동시에 처리하였을 때 살모넬라 균에 대한 매우 높은 민감도 및 특이성을 나타냄을 확인하였다 (표 2 및 표 3).
본 발명의 일 실시예에서는 닭고기로부터 살모넬라균을 검출한 결과, 프라이머 세트는 각각의 타겟 유전자를 특이적으로 증폭시킬 수 있음을 확인하였으며, 살모넬라 속, 살모넬라 아종 I 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움의 타겟 유전자를 명확히 검출함을 확인하였다 (표 4).
본 발명의 다른 일 측면은 상기 검출용 조성물을 포함하는 살모넬라균 검출용 키트에 관한 것이다.
상기 검출용 키트는 용액, 동결건조 분말, 냉동 용액, 또는 스트립 형태를 가질 수 있으며, 각각의 형태는 당업계에서 통상적인 방법으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 용액 형태의 검출용 키트는 나트륨-인산, 칼륨-인산, 트리스-염산 및 이외의 여러 종류의 완충액 등의 완충액에 단백질 또는 프라이머 등을 별도로 또는 혼합하여 제제화할 수 있으며, 필요에 따라 냉동시키거나 동결 건조할 수도 있다.
상기 검출용 키트는 면역측방유동 스트립 방식을 이용한 것일 수 있다. 측방유동분석법(lateral flow assay)은 크로마토그래피 방법을 기본으로 하는 단백질 또는 핵산의 검출 방법이다. 이러한 측방유동분석법은 임신진단, 암진단, 기타 특정 단백질 또는 유전자의 존재 여부 또는 미생물탐지 등 다양한 분야에 널리 사용되고 있다. 측방유동분석법은 항원-항체 반응과 같은 두 물질 간의 특이적인 반응을 기본으로 하는 것으로, 민감도와 특이성이 높고, 빠른시간 내에 결과를 확인할 수 있다는 장점이 있어 질병의 진단 및 빠른 예방 조치를 가능하게 한다.
본 발명의 검출용 키트에는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 살모넬라 균주를 검출하는데 필요한 실험(예: PCR, LAMP) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 LAMP용 조성물은 본 발명에서 제공되는 프라이머 쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O) 등을 포함할 수 있다.
상기 검출용 키트는 LAMP 키트일 수 있으며, 구체적으로는 다중 검출이 가능한 멀티플렉스 LAMP 키트일 수 있다. 상기 LAMP 분석용 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조될 수 있으며, 상기 키트는 LAMP 분석용 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있다. 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 용해제, 세정제 등을 포함한다. 상기 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완중액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
상기 키트는 살모넬라 속, 살모넬라 아종 I 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움 중 어느 하나 이상을 검출할 수 있으며, 보다 구체적으로 살모넬라 속, 살모넬라 아종 I 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움을 동시에 검출할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 검출용 조성물을 포함하는 살모넬라균 검출용 바이오 칩(chip)에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 “바이오 칩(chip)”은 DNA 칩이라고도 불리우며, 매우 작은 DNA 조각들이 고체 표면에 집적된 것으로, 플라스틱, 유리, 실리콘 등의 투명 또는 반투명한 재질로 이루어진 기판에 시료용액과 시약을 수용할 수 있는 챔버 및 채널을 포함한 형태일 수 있다.
바이오 칩은 두께가 얇고 투명하며 히터블록과의 접촉면적이 넓기 때문에 PCR시간을 크게 단축할 수 있고, 동시에 최소한 수백 개 이상의 유전자를 빠른 시간 안에 검색할 수 있는 장점이 있다. 또한, 고형체를 사용함으로써 아주 적은 양의 유전 물질을 고밀도로 붙일 수 있으며, 동시에 많은 수의 유전자를 검색할 수 있으며, 많은 양의 유전자의 발현 정도를 동시에 측정하거나 게놈의 다양한 부분의 유전자형을 파악하기 위해 사용할 수 있다.
바이오 칩은 붙이는 유전물질의 크기에 따라 cDNA(complementary DNA)칩과 올리고뉴클레오티드 칩(oligonucleotide)으로 분류될 수 있다. cDNA 칩에는 최소한 500bp 이 상의 유전자(full-length open reading frame 또는 EST)가 포함될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 칩에는 약 15 내지 40개의 염기들로 이루어진 올리고뉴클레오티드가 접착될 수 있고, 칩 내에 포함되는 용액에 포함될 수 있으나, 상기 형태에 한정되지 않으며 필요에 따라 적절히 변형할 수 있다.
구체적으로, 상기 바이오칩은 살모넬라 속, 살모넬라 아종 I 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움 중 어느 하나 이상을 검출할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 대상 시료에 상기 검출용 조성물을 처리하는 단계;를 포함하는 살모넬라균을 검출하는 방법에 관한 것이다.
상기 검출방법에 사용하는 대상 시료는 살모넬라균이 발견될 수 있는 모든 물질, 바람직하게는 살모넬라 감염 또는 오염이 의심되는 닭고기, 돼지고기, 소고기 등의 식품에서 수득할 수 있다.
본 발명에서는 대상 시료 내 DNA 추출 과정을 생략한 다이렉트 멀티플렉스 LAMP 방식을 이용한 살모넬라 균 검출 방법을 사용하였으며, 최적화된 방법을 통해 신속하면서도 정확성을 높였다 (도 4).
또한, 상기 대상 시료는 프로테이나제 K가 처리된 것일 수 있다.
본 발명에서 “프로테이나제K(Proteinase K)”는 289000 달톤의 분자량(MW)을 가지며 1974년 곰팡이의 추출물로부터 처음 분리된 효소로, 아미노산 세린을 갖고 가수분해에 의해 펩티드 결합을 파괴하는 기능을 가지고 있다. 이러한 프로테이나제 K는 단백질을 파괴하고 핵산 분해 효소(RNase 및 DNase)를 불활성화시키면서 핵 DNA를 방출 시킬 수 있어, 단백질 소화 및 DNA 추출 등의 연구에 사용되고 있다. DNA 추출에 있어 프로테이나제 K 처리는 높은 순도의 고 분자량 DNA 를 가질 수 있으며, 안정성이 우수하여 PCR, 전기 영동 등에 활용될 수 있다.
상기 방법은 등온증폭법(LAMP)을 수행하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 방법은 살모넬라 속, 살모넬라 아종 I 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움 중 어느 하나 이상을 동시에 검출할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 대상 시료에 프로테이나제 K를 처리한 후 LAMP 반응을 수행한 결과, 프로테이나제 K 를 처리하지 않은 경우와 비교하여 민감성이 현저하게 향상되었으며 (표 5 및 도 5), 이를 통해 신속하면서도 정확한 살모넬라균 검출이 가능함을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 a) 대상 시료에 상기 검출용 조성물을 처리하는 단계; 및 b) 상기 시료 내에 살모넬라 속(genus), 아종(subspecies) 및 혈청형(serovar)을 동시에 확인하는 단계를 포함하는, 살모넬라균을 포함하는 시료의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 “시료”는 살모넬라균의 포함 여부를 확인하고자 하는 대상이 되는 물질을 말한다. 구체적으로는 식품, 영양제, 음료, 첨가제, 각종 식이에 포함되는 물질 등을 대상으로 할 수 있으나, 상기 형태에 제한되는 것은 아니며 살모넬라균의 포함 여부를 확인하고자 하는 것이라면 모두 대상 시료가 될 수 있다.
상기 살모넬라균은 살모넬라 속, 살모넬라 아종 I 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움 중 어느 하나 이상일 수 있다.
구체적으로, 상기 b) 단계는 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplifaction, LAMP)을 수행하여 살모넬라 속, 아종 및 혈청형을 확인하는 단계일 수 있으며, 보다 구체적으로 멀티플렉스 LAMP 분석을 통해 살모넬라 속, 살모넬라 아종 I 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움을 스크리닝할 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 특별한 제한 없이 당업계에 공지된 방법에 의해 수행되는 모든 유전자 스크리닝 방법을 통해 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 제1프라이머 쌍 내지 제3프라이머 쌍에서 하나 이상 선택된 것으로 이루어진 살모넬라균 검출용 조성물을 활용함으로써 대상 시료 내 존재하는 살모넬라균의 속, 아종 및 혈청형 수준까지 정확히 판별할 수 있다.
또한 본 발명의 상기 제1 프라이머 쌍 내지 제 3 프라이머 쌍은 멀티플렉스 LAMP용 프라이머로써, 동시에 3개의 타겟 유전자를 동시에 검출할 수 있으며, 민감도 및 특이성 또한 우수하다.
본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 다이렉트 멀티플렉스 등온증폭 방식(direct multiplex loop-mediated isothermal amplification assay)을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 LAMP 분석용 프라이머의 위치를 나타낸 것이다(A: Salmonella, B: Salmonella subsp. I, C: Salmonella enterica serovar Typhimurium)
도 3은 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움(Salmonella enterica serovar Typhimurium)으로부터 추출한 DNA를 이용한 트리플렉스(triplex) LAMP분석의 민감도를 나타낸 것이다(A: ATCC131, B: ATCC 14028, C: ATCC14028)
도 4는 LAMP 반응을 위한 시료 준비의 최적화를 비교하여 나타낸 것이다(A: 프로테이나제 K 미처리, B: 프로테니아제 K 처리).
도 5는 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움 ATCC 19585(6.4 X 10-1 내지 6.4 X 104 CFU/g)의 10 배 연속 희석액으로 인위적으로 접종된 닭고기에 대한 트리플렉스 LAMP 분석의 검출한계(limited of detection, LOD)를 비교하여 나타낸 것이다(A: 프로테이나제 K 미처리, B: 프로테이나제 K 처리).
이하, 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 관하여 상세히 서술하나, 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.
실시예 1. 살모넬라 균주 및 DNA 추출
살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움(S. enterica ser Typhimurium)의 3 가지 유형의 균주를 포함한 총 15 개의 살모넬라 균주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, ATCC)에서 입수하여 참조 균주로 사용하였다.
생 닭고기에서 분리한 42 종의 살모넬라(Salmonella)를 한국 소비자원(Korea Consumer Agency)에서 입수하여 트리플렉스 LAMP(triplex LAMP) 분석의 적용 가능성을 평가하였다. 모든 살모넬라 균주는 37℃에서 진탕하여 트립틱 소이 배지 (Difo Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA)에 배양하였으며, DNA 추출을 위해 최종 배양물을 수확하였다.
제조사의 지시에 따라 DNeasy 혈액 및 조직 키트 (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 배양된 살모넬라 균주로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 게놈 DNA의 순도 및 농도는 UV- 분광 광도계 (모델 UV-1700; 일본 도쿄의 시마즈)를 사용하여 측정하였다. A260/A280 비가 1.8 내지 2인 게놈 DNA를 DNA 주형으로 사용하였다. 게놈 DNA를 증류수를 이용하여 25 ng /μl의 농도로 희석하고 -20℃에 저장하였다.
실시예 2. LAMP 프라이머의 설계
STM3098, STM4057 및 STM4497 (GenBank accession number: NC_003197)의 서열은 국립 생명 공학 정보 센터 GenBank 데이터베이스에서 얻었다. PrimerExplorer 버전 5 (Eiken Chemical Co., Ltd., Japan, Tokyo)를 사용하여 5 개의 프라이머로 이루어진 3 세트의 LAMP 프라이머를 설계하였다. 프라이머 세트 각각에는 2개의 외부 프라이머 (정방향 프라이머, F3 및 역방향 프라이머, B3), 2 개의 내부 프라이머 (정방향 내부 프라이머, FIP 및 역방향 내부 프라이머, BIP) 및 1 개의 루프 프라이머 (정방향 루프 프라이머, LF)를 포함한다. 상기 프라이머를 이용하여 타겟 유전자의 7 개 영역을 증폭시켰다. 본 연구에 사용된 LAMP 프라이머의 서열 및 위치에 대한 세부 사항은 표 1 및 도 2에 제시되어있다. 모든 프라이머는 마크로젠(Macrogen, Inc. 서울, 한국)에서 합성하였다.
타겟 서열 유전자 프라이머 시퀀스(5′→3′) 농도(μM)
Salmonella genus 1 STM3098 3098-F3 ACAACCGAATCAAAGCCTGA 0.2
2 3098-B3 AAGCATGAATGCCTGGCC 0.2
3 3098-FIP CGCGACATCCGATAGCACGG-TAGATGGCATTCGCTGTCTG 0.8
4 3098-BIP AATACCACGCGCGTTAATCGCC-CTCATCCTGCATCGTGAGTC 0.8
5 3098-LF TCGCTGGAGACCAGATATTG 0.4
Salmonella subspecies I 6 STM4057 4057-F3 TGAAAATGCGGTGGCGATC 0.2
7 4057-B3 TGCACCGCATCAAACTCG 0.2
8 4057-FIP CGGGTGCATATACGTTGCGGC-AGAATTTTTGGTGGCCTCGA 0.4
9 4057-BIP TTACCTTCACCGGAGGCCGG-CTTCACCCACTTGTAGCGAG 0.4
10 4057-LF GCGTTCAGCATCGGGA 0.4
Salmonella enterica ser Typhimurium 11 STM4497 4497-F3 AGCCGCATTAGCGAAGAG 0.2
12 4497-B3 GCGGTCAAATAACCCACGT 0.2
13 4497-FIP ACCTGCAGCTCATTCTGAGCAG-TCAAAAACAACGGCTCCGG 0.6
14 4497-BIP GAAAAGGACCACAAGTTCGCGC-TCAGTGAGCATGTCGACGAT 0.6
15 4497-LF CAAAAATCCAGAACCCAATCTC 0.4
실시예 3. 멀티플렉스 LAMP 프라이머의 특이성 및 민감도 확인
LAMP 프라이머의 특이성 및 감도를 평가하기 위해, 15 μL의 등온 마스터 믹스 ISO-001 (OptiGene, West Sussex, UK), 0.2 μM의 각 외부 프라이머 (F3 및 B3), 1.6 μM의 각 내부 프라이머 (FIP 및 BIP), 0.8 μM의 루프 프라이머 (LF) 및 25 ng의 DNA 주형을 함유하는 25 μL 반응 부피를 사용하여 심플렉스(simplex) LAMP 반응을 수행하였다.
또한, 살모넬라 속, 살모넬라 아종 I 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움에 대하여 상이한 농도의 프라이머를 사용하여 트리플렉스(triplex) LAMP 반응을 수행하였다. 심플렉스 및 트리플렉스 LAMP 반응을 63℃에서 30 분 동안 수행한 후, Genie III LAMP 검출기 (OptiGene)를 사용한 어닐링 곡선 분석을 위해 98℃에서 80℃ (0.05 ℃/s)로 가열 및 냉각 단계를 수행하였다. 이후 Genie Explorer 프로그램을 사용하여 데이터를 분석하였다. 모든 LAMP 실험에서 주형 DNA가 없는 것을 음성 대조군으로 설정하였다.
심플렉스 및 트리플렉스 LAMP 분석에서 살모넬라 속, 살모넬라 아종 I 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움에 대해 설정된 각각의 LAMP 프라이머의 특이성은 15 개의 살모넬라 균주로부터 추출된 25 ng의 DNA 주형을 사용하여 평가하였다. 구체적으로, 심플렉스 LAMP 분석의 민감도는 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움DNA (ATCC 19585)의 10 배 연속 희석액을 이용하여 평가하였다. 트리플렉스 LAMP 분석의 민감도는 25 ng 내지 25 fg 범위의 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움 균주(ATCC 19585, ATCC 13311 및 ATCC 14028) DNA의 약 10 배 연속 희석액을 사용하여 평가하였다. 이들 분석은 동일한 조건 하에서 3 회 수행되었다. LAMP 반응 후 타겟 유전자를 확인하기 위해 어닐링 곡선 분석을 수행하였다.
Salmonella strain Subspecies Source Results a [annealing temperature (°C)]
Simplex LAMP Triplex LAMP
STM3098 STM4057 STM4497 STM3098 STM4057 STM4497
Serovar Typhimurium I ATCC 19585 + (88.8) + (90.0) + (86.8) + (88.6) + (89.9) + (86.8)
Serovar Typhimurium I ATCC 13311 + (88.9) + (90.1) + (86.8) + (88.7) + (89.9) + (86.8)
Serovar Typhimurium I ATCC 14028 + (88.8) + (89.9) + (86.8) + (88.6) + (89.9) + (86.8)
Serovar Typhi I ATCC 33459 + (88.7) + (90.7) - + (88.7) + (90.2) -
Serovar Paratyphi C I ATCC 13428 + (88.6) + (90.5) - + (88.5) + (90.2) -
Serovar Choleraesuis I ATCC 13312 + (88.6) + (90.4) - + (88.5) + (90.2) -
Serovar Enteritidis I ATCC 4931 + (88.8) + (90.6) - + (88.8) + (90.1) -
Serovar Gallinarum I ATCC 9184 + (88.7) + (90.6) - + (88.8) + (90.1) -
Serovar Pullorum I ATCC 9120 + (88.8) + (90.6) - + (88.7) + (90.1) -
Enterica salamae II ATCC 15793 + (88.4) - - + (88.4) - -
Enterica arizonae IIIa ATCC 13314 + (88.3) - - + (88.4) - -
Enterica diarizonae IIIb ATCC 43973 + (88.0) - - + (88.0) - -
Enterica houtenae IV ATCC 43974 + (88.7) - - + (88.7) - -
Enterica indica VI ATCC 43976 + (88.8) - - + (88.9) - -
Bongori V ATCC 43975 + (89.1) - - + (89.1) - -
Strain DNA 양 (ng) 결과 a [어닐링 온도 (°C)]
Simplex LAMP b Triplex LAMP c
STM3098 STM4057 STM4497 STM3098 STM4057 STM4497
Salmonella enterica serovar Typhimurium 25 + (88.6) + (90.1) + (86.8) + + + (88.5 ± 0.1) + + + (89.8 ± 0.06) + + + (86.7 ± 0.06)
2.5 + (88.6) + (90.0) + (86.8) +++(88.5 ± 0.12) +++(89.7 ± 0.06) +++(86.7 ± 0.06)
0.25 + (88.7) + (90.1) + (86.9) +++(88.6 ± 0.06) +++(89.8 ± 0.06) +++(86.8 ± 0.06)
0.025 + (88.6) + (90.1) + (86.8) +++(88.5 ± 0.06) +++(89.8 ± 0.15) +++(86.8 ± 0.06)
0.0025 + (88.7) + (90.0) + (86.9) +++(88.5 ± 0.06) +++(89.8 ± 0.12) +++(86.7 ± 0.1)
0.00025 - + (89.9) + (86.9) +--(88.4) --+89.6) +--(86.6)
0.000025 - - +--(88.6) --- ---
a 양(positive) 및 음(negative) 결과는 + 및 -로 각각 표시됨
b 심플렉스(Simplex) LAMP는 S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585에서 수행됨
c 트리플렉스(Triplex) LAMP는 S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585, ATCC 13311 및 ATCC 14028에서 수행되었음(상기 strain 순서대로 표시)
심플렉스 LAMP 분석 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 STM3098에 기초한 살모넬라 속(genus)-특이적 프라이머 세트는 모든 살모넬라 균주에서 88.0℃ 내지 89.1℃의 어닐링 온도로 증폭되었다. 살모넬라 아속 STM4057을 표적으로 하는 살모넬라 아종 I(Salmonella subsp.I)-특이적 프라이머 세트는 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움(S. ser. Typhimurium)를 포함한 살모넬라 엔테리카 세로바 타이피(S. ser. Typhi), 파리티푸스 C(Paratyphi C), 살모넬라 엔테리카 세로바 콜레라수이스(S. ser. Choleraesuis), 살모넬라 엔테리티디스(Enteritidis), 살모넬라 갈리나룸(Gallinarum), 및 살모넬라 풀로룸(Pullorum)과 같은 살모넬라 아종 I에 속하는 균주에서만 89.9℃ 내지 90.7℃의 어닐링 온도로 증폭되었다. 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움-특이적 프라이머 세트는 비 표적 혈청형과 교차 반응성을 갖지 않으며, 어닐링 온도는 86.8℃이었다. 상기 결과는 모든 타겟 유전자 간의 어닐링 온도의 차이가 대략 35 분 내의 상기 방법에 의한 동시 검출을 허용하였는 바, 트리플렉스 LAMP 분석법이 가능함을 시사한다.
트리플렉스 LAMP 분석을 수행한 결과, 타겟 유전자 이외의 유전자의 증폭은 관찰되지 않았으며, 살모넬라 속에 대한 프라이머 세트의 어닐링 온도는 88.0℃ 내지 89.1℃이고, 살모넬라 아종 I의 어닐링 온도는 89.9℃ 내지 90.2℃이며, 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움은 86.8℃이었으며, 이는 심플렉스 LAMP 분석 결과와 동일하였다.
이러한 결과는 본 발명의 트리플렉스 LAMP 분석법이 15개의 프라이머: 6개의 외부, 6개의 내부 및 3개의 루프 프라이머를 사용하여 교차 반응성 없이 살모넬라 속, 살모넬라 아종 I 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움 타겟 유전자를 특이적으로 증폭시킬 수 있음을 나타내며, 상기 실험을 통해 약 35분 이내에 STM3098, STM4057 및 STM4497의 동시 검출을 위한 트리플렉스 LAMP 반응 및 어닐링곡선 분석이 가능함을 확인하였다.
또한, 도 3 및 표 3에 나타난 바와 같이, 심플렉스 LAMP 분석에서의 각 프라이머 세트의 민감도의 경우 살모넬라 속 민감도는 2.5 pg, 살모넬라 아종 I의 민감도는 0.25 pg, 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움의 민감도는 0.25 pg로 확인되었다.
트리플렉스 LAMP 분석의 민감성을 측정한 결과, 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움 DNA에 대해 모두 2.5 pg로 나타났으며, 심플렉스 LAMP를 사용할 때와 비교하여 동일하거나 더 높게 나타남을 확인하였다. LOD 결과는 세 복제물에서 모두 검출된 경우에만 결정되었으며, 결과는 “+++”로 나타내었다.
상기 결과는, 본 발명의 멀티플렉스 LAMP 분석의 민감도가 높은 감도를 가지며, 살모넬라 속, 살모넬라 아종 I 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움을 동시 검출하는데 충분히 민감함을 시사한다.
실시예 4. 다이렉트 멀티플렉스(direct multiplex) LAMP를 이용한 닭고기에서의 살모넬라균 검출
각 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움 균주를 대략 1.6 x 101 내지 106 CFU/mL 범위의 희석액으로 37℃에서 18 시간 동안 트립틱 소이 배지에서 배양하였다. 각 희석액의 1 mL를 닭고기 25 g에 첨가하였다. 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움이 접종된 모든 시료는 실온에서 2시간 동안 유지시켰다.
각 시료를 225 mL의 완충 된 펩톤 수 (Difco Laboratories, 미국 뉴저지 주 프랭클린 레이크스)와 혼합하고 30 초 동안 손으로 균질화시켰다. 각각의 균질화된 시료 1 mL를 16,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고, 상청액을 제거하였다. 펠릿을 PBS (phosphate buffered saline) 용액으로 재현탁한 다음 99 ℃에서 8 분 동안 가열하였다.
다이렉트 멀티플렉스(direct multiplex) LAMP의 추출 방법은 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움 6.4 x 102 CFU/g를 접종한 닭고기를 사용하여 최적화하였다. 구체적으로 1 mL의 균질화된 용액으로부터 원심 분리된 세포를 3 개의 상이한 부피 25, 50 및 100 μL의 PBS로 재현탁시켜 2 개의 세트를 제조하였다. 한 세트는 56℃에서 10 분 동안 10 μL의 프로테이나제 K(>600 mAU/mL, Qiagen, Hilden, Germany)와 배양하고, 다른 세트는 프로테이나제 K를 첨가하지 않고 제조하였다. 6 개의 모든 시료는 8 분 동안 99℃에서 가열하였고, 각각은 DNA 주형으로서 사용되었다. 2 μL의 상청액은 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이 멀티플렉스 LAMP를 사용하여 분석하였다.
Serovar Multiplex LAMP 결과a
STM3098 STM4057 STM4497
Typhimurium 3/3 3/3 3/3
Enteritidis 17/17 17/17 0/17
Virginia 5/5 5/5 0/5
Haardt 5/5 5/5 0/5
Georgia 2/2 2/2 0/2
Agona 2/2 2/2 0/2
Infantis 1/1 1/1 0/1
Hadar 1/1 1/1 0/1
Edinburgh 1/1 1/1 0/1
Paratyphi A 1/1 1/1 0/1
Sandow 1/1 1/1 0/1
Schwarzenground 1/1 1/1 0/1
Istanbul 1/1 1/1 0/1
Tennessee 1/1 1/1 0/1
a 양성을 나타낸 샘플 개수/전체 샘플 개수
그 결과, 프로테이나제 K가 없는 샘플에서는 트리플렉스 LAMP 분석에 의해 3가지 타겟 유전자가 검출되지 않은 반면, 프로테이아제 K를 처리한 3개 샘플 중 50 및 100 μL로의 PBS로 각각 재현탁시킨 2개의 샘플에서는 살모넬라의 타겟 유전자가 모두 성공적으로 검출됨을 확인하였다 (도 4). 특히 50 μL의 PBS 및 10 μL의 프로테이나제 K를 처리한 샘플에서, 3 개의 피크가 명확하게 검출되었다 (도 4B).
이를 통해 닭고기에 프로테이나제 K를 사용하면 단백질과 같은 억제제의 농도가 감소함에 따라, 트리플렉스 LAMP의 효율이 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. 멀티플렉스 LAMP의 검출 한계(Limited of detection, LOD)
다이렉트 멀티플렉스 LAMP의 검출 한계 (LOD)는 대략 6.4×10-1 내지 104 CFU/g 범위의 농도에서 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움 ATCC 19585로 오염된 닭고기를 이용하여 결정하였다. 이 분석의 LOD를 확인하기 위해 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움 ATCC 13311 및 ATCC 14028도 연속 희석하여 닭고기에 접종하였다.
모든 다이렉트 멀티플렉스 LAMP 반응은 DNA 추출 필요 없이 최적화된 방법을 이용하여 수행하였다. 살모넬라 배양, 닭고기에의 접종, 멀티플렉스 LAMP 반응을 포함한 모든 과정은 3회 수행되었다.
스파이크
(Spiked) 농도 (CFU/g)		 Triplex LAMP 결과[어닐링 온도 (°C)]
ATCC 19585 ATCC 13311 ATCC 14028
STM-3098 STM-4057 STM-4497 STM-4057 STM-4497 STM-4497 STM-4057 STM-4497 STM-4497
6.4 x 104 + b (88.5) + (90.0) + (86.6) + (88.5) + (90.1) + (86.7) + (88.7) + (90.1) + (86.6)
6.4 x 103 + (88.6) + (90.0) + (86.7) + (88.6) + (90.1) + (86.7) + (88.6) + (90.1) + (86.8)
6.4 x 102 + (88.6) + (90.0) + (86.7) + (88.6) + (90.1) + (86.7) + (88.5) + (90.0) + (86.6)
6.4 x 101 + (88.2) + (90.0) + (86.7) + (88.5) + (89.8) + (86.7) + (88.5) + (90.0) + (86.6)
6.4 x 100 - + (90.0) - + (88.4) - - - - -
6.4 x 10-1 - - - - - - - - -
a 양(positive) 및 음(negative) 결과는 + 및 -로 각각 표시됨
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 프로테이나제 K를 처리하지 않은 시료에서는 살모넬라 유전자가 검출된 최저 농도가 6.4X103인 반면, 프로테이나제 K를 처리한 시료에서는 6.4X101 CFU/g로 나타났다 (표 5). 상기와 같은 결과는 프로테이아제 K 처리가 다이렉트 멀티플렉스 LAMP의 민감성을 증가시킴을 시사한다.
아울러, 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움 ATCC 13311 및 ATCC 14028 2개 균주의 LOD는 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움 ATCC 19585와 동일하게 6.4X101 CFU/g로 나타났다. 이에 본 발명의 트리플렉스 LAMP분석은 샘플링 후 결과 분석까지 총 60분 이내에 살모넬라 속, 살모넬라 아종 I 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움을 성공적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
상기 결과를 통해 형광 염료로 표지된 추가적인 표적-특이적 프로브 필요 없이 단일 튜브에서 3개의 타겟 유전자를 효율적이고 정확하게 검출할 수 있음을 확인하였으며, 아울러, LAMP 분석 이전의 최적화된 DNA 추출 절차는 LAMP 분석의 민감도 및 반응 효율을 현저히 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> MULTIPLEX PRIMER FOR DETECTION OF SALMONELLA AND USES THEREOF <130> 20PP30324 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3098-F3 <400> 1 acaaccgaat caaagcctga 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3098-B3 <400> 2 aagcatgaat gcctggcc 18 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3098-FIP <400> 3 cgcgacatcc gatagcacgg tagatggcat tcgctgtctg 40 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3098-BIP <400> 4 aataccacgc gcgttaatcg ccctcatcct gcatcgtgag tc 42 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3098-LF <400> 5 tcgctggaga ccagatattg 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4057-F3 <400> 6 tgaaaatgcg gtggcgatc 19 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4057-B3 <400> 7 tgcaccgcat caaactcg 18 <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4057-FIP <400> 8 cgggtgcata tacgttgcgg cagaattttt ggtggcctcg a 41 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4057-BIP <400> 9 ttaccttcac cggaggccgg cttcacccac ttgtagcgag 40 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4057-LF <400> 10 gcgttcagca tcggga 16 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4497-F3 <400> 11 agccgcatta gcgaagag 18 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4497-B3 <400> 12 gcggtcaaat aacccacgt 19 <210> 13 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4497-FIP <400> 13 acctgcagct cattctgagc agtcaaaaac aacggctccg g 41 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4497-BIP <400> 14 gaaaaggacc acaagttcgc gctcagtgag catgtcgacg at 42 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4497-LF <400> 15 caaaaatcca gaacccaatc tc 22

Claims (14)

  1. 서열번호 1 내지 5의 염기서열을 포함하는 제 1 프라이머 쌍; 서열번호 6 내지 10의 염기서열을 포함하는 제 2프라이머 쌍; 서열번호 11 내지 15의 염기서열을 포함하는 제3프라이머 쌍; 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍으로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는, 살모넬라(Salmonella spp.)균 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머 쌍은 살모넬라 검출을 위한 등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 분석용 프라이머 쌍인 것인, 살모넬라균 검출용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 검출용 조성물은 살모넬라 속(Salmonella genus), 살모넬라 아종 I(Salmonella subspecies I) 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움(Salmonella enterica serovar Typhimurium) 중 어느 하나 이상을 검출하는 조성물인 것인, 살모넬라균 검출용 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 살모넬라(Salmonella spp.)균 검출용 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 키트는 살모넬라 속, 살모넬라 아종 I 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움 중 어느 하나 이상을 검출하는 것인, 살모넬라균 검출용 키트.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 살모넬라(Salmonella spp.)균 검출용 바이오 칩(chip).
  7. 제6항에 있어서,
    상기 바이오칩은 살모넬라 속, 살모넬라 아종 I 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움 중 어느 하나 이상을 검출하는 것인, 검출용 바이오 칩(chip).
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 검출용 조성물을 대상 시료에 처리하는 단계;를 포함하는 살모넬라균을 검출하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplifaction, LAMP)을 수행하는 단계;를 추가로 포함하는, 살모넬라균을 검출하는 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 시료는 프로테이나제 K가 처리된 것인, 살모넬라균을 검출하는 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 방법은 살모넬라 속, 살모넬라 아종 I 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움 중 어느 하나 이상을 검출하는 것인, 살모넬라균을 검출하는 방법.
  12. a) 대상 시료에 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 처리하는 단계; 및
    b) 상기 시료 내에 살모넬라 속(genus), 아종(subspecies) 및 혈청형(serovar)을 확인하는 단계를 포함하는, 살모넬라균을 포함하는 시료의 스크리닝 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 살모넬라균은 살모넬라 속, 살모넬라 아종 I 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움 중 어느 하나 이상에 해당하는 것인, 살모넬라균을 포함하는 시료의 스크리닝 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 b) 단계는 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplifaction, LAMP)을 수행하여 살모넬라 속, 아종 및 혈청형을 확인하는 것인, 살모넬라균을 포함하는 시료의 스크리닝 방법.
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